一種健骨藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種健骨藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 金天格膠囊是一種健骨藥物，由人工虎骨粉和適量輔料制成的制劑，人工虎骨粉 具有健骨作用，用于腰背疼痛，腰膝酸軟，下肢痿弱，步履艱難等癥狀的改善。
[0003] 虎骨作為一種名貴中藥材并經(jīng)過(guò)千百年的臨床實(shí)踐，它的藥用價(jià)值得到了充分的 證明，虎骨具有顯著的抗炎、追風(fēng)、鎮(zhèn)痛、健骨等功效，主要用于治療骨質(zhì)疏松、風(fēng)濕以及骨 傷等。在1993年，為遵守國(guó)際公約，我國(guó)明令禁止虎骨貿(mào)易和藥用后，含有虎骨成分的很多 著名中成藥就悄然消失了。為使具有悠久歷史的以虎骨為原料的傳統(tǒng)中藥制品不在市場(chǎng)上 消亡，2003年由中國(guó)藥品生物制品檢定所、金花企業(yè)（集團(tuán)）股份有限公司等聯(lián)合研制出了 與天然虎骨所含成分基本相同的人工虎骨粉配方。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，用該配方制成的人工虎 骨指紋圖譜與天然虎骨幾乎相同，13項(xiàng)實(shí)驗(yàn)及30多個(gè)藥理、藥效及安全性指標(biāo)與天然虎骨 粉無(wú)明顯差異。
[0004] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ01592003-2009Z頒布了金天格膠囊 的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，原質(zhì)量控制方法中總氨基酸的含量采用傳統(tǒng)水解、手動(dòng)衍生，使用高效液 相色譜法進(jìn)行測(cè)定，原質(zhì)量控制方法只對(duì)總磷量進(jìn)行了測(cè)定，局限性較大。同時(shí)，原方法可 操作性差，誤差大，效率低，操作時(shí)間為2天，專(zhuān)屬性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供健骨藥物（金天格膠 囊）的質(zhì)量檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明公開(kāi)的一種健骨藥物的質(zhì)量檢測(cè)方法，該健骨藥物由人工虎骨粉和輔料制 成膠囊，其質(zhì)量檢測(cè)方法包括以下測(cè)定步驟：
[0008] 1)將健骨藥物水解后，測(cè)定樣品中總氨基酸含量，每粒膠囊含總氨基酸不少于 65mg，具體選擇以下任意一種測(cè)定方法：
[0009] a.采用微波水解、自動(dòng)在線衍生，使用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定每粒膠囊中包含 羥脯氨酸的總氨基酸含量；
[0010] b.采用傳統(tǒng)水解、PITC衍生法，用高效液相色譜法測(cè)定金天格膠囊中包含羥脯氨 酸的總氨基酸含量；
[0011] C.采用傳統(tǒng)水解、自動(dòng)在線衍生，使用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定金天格膠囊中包 含羥脯氨酸的總氨基酸含量；
[0012] d.采用微波水解、PITC手動(dòng)衍生，用高效液相色譜法測(cè)定金天格膠囊中包含羥脯 氨酸的總氨基酸含量；
[0013] 2)采用原子吸收分光光度法測(cè)定該健骨藥物中總鈣含量，每粒膠囊含鈣不少于 55mg〇
[0014] 步驟1)中：a.采用微波水解、自動(dòng)在線衍生，使用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定每粒 膠囊中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量，具體包括以下步驟：
[0015] (1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取氨基酸對(duì)照品：L-羥脯氨酸、脯氨酸，門(mén)冬氨酸、 谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮 氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及賴氨酸，加濃度為〇. 〇2mol/L鹽酸溶液配成對(duì)照品溶液，具體配 制關(guān)系如下：
[0018] (2)供試品溶液的制備：精密稱(chēng)定膠囊中的內(nèi)容物人工虎骨粉0. 2g，置高通量微
[0016]
[0017] 波消解管中，精密加入lOmL濃度為6mol/L的鹽酸溶液，稱(chēng)定重量，置微波消解儀內(nèi)于180°C水解15min，放冷至室溫，用6mol/L的鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，加入10mL濃度為6mol/L 的氫氧化鈉溶液中和，并轉(zhuǎn)移至l〇〇mL容量瓶中，用濃度為0. 02mol/L的鹽酸溶液稀釋并定 容至刻度；精密量取5mL置于25mL容量瓶中，用濃度為0. 02mol/L的鹽酸溶液稀釋并定容 至刻度，濾過(guò)，制得供試品溶液；
[0019] (3)總氨基酸的測(cè)定：分別精密量取制備的對(duì)照品溶液及供試品溶液各20yL，并 分別注入氨基酸分析儀，測(cè)得所述健骨藥物每粒膠囊中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量。
[0020] 步驟1)中：b.采用傳統(tǒng)水解、PITC衍生法，用高效液相色譜法測(cè)定健骨藥物每粒 膠囊中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量，具體包括以下步驟：
[0021] ⑴對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取氨基酸對(duì)照品：門(mén)冬氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸、絲 氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、苯丙氨酸及鹽酸賴氨酸，加濃度〇.lmol/L鹽酸溶液配成對(duì)照品溶液，具體配制 關(guān)系如下：
[0022]

[0023] (2)供試品溶液的制備：精密稱(chēng)定膠囊內(nèi)容物人工虎骨粉0. 2g，置耐壓管中，精密 加入6mL濃度為6mol/L的鹽酸溶液，在110°C水解24小時(shí)，冷卻至室溫，氮吹干燥，精密加 入0. 1N氫氧化鈉溶液20mL，以2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5min;然后精密量取5mL上清液，并用 0. 1N鹽酸溶液稀釋并定容至刻度；精密量取5mL置于10mL容量瓶中，用0. 1N的鹽酸溶液 稀釋并定容至刻度，濾過(guò)，制得供試品溶液；
[0024] (3)對(duì)照品溶液及供試品溶液的衍生：分別精密量取制得的對(duì)照品溶液及供試品 溶液各4mL，分別置于20mL具塞試管中，并均加入0.lmol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液2mL、 lmol/L三乙胺乙腈溶液lmL，搖勾，室溫下反應(yīng)1小時(shí)后，加入8mL正己烷萃?。混o置10分 鐘，取下層溶液并用〇. 45um有機(jī)濾膜過(guò)濾，取濾液，得到衍生后的對(duì)照品溶液和衍生后的 供試品溶液；
[0025] (4)測(cè)定：分別精密量取上述衍生后的對(duì)照品溶液及供試品溶液各2y1，分別注 入液相色譜儀，記錄色譜圖；以外標(biāo)法計(jì)算樣品中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量；
[0026] 液相色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Shim-pack VP-0DS4. 6mmX250mm;以0.lmol/L醋酸鈉緩沖溶液為流動(dòng)相A，以甲醇：乙腈：水= 20:60:20的混合液為流動(dòng)相B;檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，柱溫為35°C，進(jìn)樣體積為2yL，洗脫條 件如下：
[0027]
[0028] 所述流動(dòng)相A的0.lmol/L醋酸鈉緩沖溶液在使用前用用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值為 6. 3±0. 05。
[0029] 步驟1)中：c.采用傳統(tǒng)水解、自動(dòng)在線衍生，使用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定金天 格膠囊中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量，具體包括以下步驟：
[0030] (1)對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取L-羥脯氨酸、脯氨酸，門(mén)冬氨酸、谷氨酸、絲氨 酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、賴氨酸對(duì)照品適量，加〇. 〇2mol/L鹽酸溶液配成對(duì)照品溶液，具體配制關(guān)系如 下：
[0033] (2)供試'溶液的制備\精密稱(chēng)定-囊中內(nèi)容物又工虎骨粉2g，置耐壓管中，精
[0031]
[0032] 密加入6mol/L的鹽酸溶液10mL，稱(chēng)定重量，置110°C水解24小時(shí)，放冷至室溫，用6mol/L的鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，加入6mol/L的氫氧化鈉溶液10mL中和，并轉(zhuǎn)移至100mL容 量瓶中，用0. 02mol/L的鹽酸溶液稀釋并定容至刻度；精密量取5mL，置25mL容量瓶中，用 0. 02mol/L的鹽酸溶液稀釋并定容至刻度，濾過(guò)，制得供試品溶液；
[0034] (3)總氨基酸的測(cè)定：分別精密量取上述對(duì)照品溶液及供試品溶液各20y1，分別 注入氨基酸分析儀，測(cè)得所述健骨藥物每粒膠囊中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量。
[0035] 步驟1)中：d.采用微波水解、PITC手動(dòng)衍生，用高效液相色譜法測(cè)定金天格膠囊 中包含羥脯氨酸的總氨基酸含量，包括以下步驟：
[0036] ⑴對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取氨基酸對(duì)照品：門(mén)冬氨酸、谷氨酸、羥脯氨酸、絲 氨酸、甘氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、纈氨酸