取已知含量的堅(jiān)桿火絨草粗粉6份，每份lg，分別精密加入 對(duì)照品溶液適量，按"1. 2. 3項(xiàng)"下供試品溶液的制備方法制備，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的 制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算得蘆丁的平均回收率為97. 41 %，RSD值為0. 88% (n = 6)，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度好、結(jié)果可靠，用此工藝提取堅(jiān)桿火絨草中總黃酮是可取的。
[0041] 1. 2. 7不同采收期堅(jiān)桿火絨草不同植物部位總黃酮的含量測(cè)定
[0042] 精密稱取不同采收期堅(jiān)桿火絨草不同部位的粗粉各lg，分別各取3個(gè)樣本，按 "1. 2. 3項(xiàng)"下供試品溶液的制備方法制備，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm 下測(cè)定吸光度值，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中總黃酮的平均含量。
[0043] 1. 2. 8單因素試驗(yàn)法優(yōu)化堅(jiān)桿火絨草總黃酮的提取工藝
[0044] ①提取溶劑。精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉（過(guò)4號(hào)篩）lg，9份，分別于150mL錐形 瓶中加入蒸餾水、濃度10%、30%、50%、60%、70%、80%、95%和無(wú)水乙醇各5011^，然后按 "1. 2. 3項(xiàng)"下供試品溶液的制備方法制備，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm 下測(cè)定吸光度值。
[0045] ②料液比。精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉（過(guò)4號(hào)篩）lg，5份，分別于150mL錐形瓶 中加入70%乙醇溶液30,40,50,60,7011^，然后按"1.2.3項(xiàng)"下供試品溶液的制備方法制 備，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值。
[0046] ③提取方式。精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉（過(guò)4號(hào)篩）lg，5份，分別于150mL錐形 瓶中加入70%乙醇溶液50mL，依次進(jìn)行直接水浴回流提取、超聲提取、35°C超聲輔助提取 0. 5h后再水浴回流提取、35 °C超聲輔助提取lh后再水浴回流提取、60 °C超聲輔助提取0. 5h 后再水浴回流提取，各重復(fù)3次，然后分別合并所得濾液，加濃度70 %乙醇定容于250mL容 量瓶中，搖勾，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值。
[0047] ④提取次數(shù)。精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉（過(guò)4號(hào)篩）lg，5份，分別于150mL錐形瓶 中加入濃度70%乙醇溶液50mL，先35°C超聲處理0. 5h，再轉(zhuǎn)移至150mL圓底燒瓶中水浴回 流提取lh，分別重復(fù)提取1，2, 3,4, 5次，然后分別合并所得濾液，加70%乙醇定容于250mL 容量瓶中，搖勻，按"1. 1.5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值。
[0048] 2結(jié)果與分析
[0049] 2. 1單因素試驗(yàn)法優(yōu)化堅(jiān)桿火絨草總黃酮的提取工藝
[0050] 2. 1. 1提取溶劑的選擇
[0051] 試驗(yàn)結(jié)果以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液為提取溶劑時(shí)，堅(jiān)桿火絨草總黃酮提取得率最 高。因此，確定70%乙醇溶液提取效果最好。
[0052] 表1乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響
[0054] 分析可見(jiàn)，當(dāng)使用0~80 % v/v乙醇進(jìn)行提取時(shí)，總黃酮提取兩均能夠得到 270mg/g以上，再增大濃度，提取量明顯降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度為60~70% v/v 時(shí)，總黃酮提取量達(dá)到了 300mg/g甚至更高，因此，可優(yōu)選使用此濃度范圍，其中，又以70% v/v這一濃度最佳，總黃酮提取量高達(dá)310mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其他乙醇濃度。
[0055] 2. 1.2料液比的選擇
[0056] 試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著料液比的增加，總黃酮含量逐漸升高，當(dāng)料液比超過(guò)lg:50mL 后，總黃酮含量幾乎不再增加。因此，確定適宜的料液比為lg:50mL(簡(jiǎn)寫為1:50)。
[0057] 表2料液比對(duì)總黃酮提取量的影響
[0059] 2. 1. 3提取方式的選擇
[0060] 試驗(yàn)結(jié)果表明：以35°C超聲輔助提取0. 5h，再水浴回流的方式進(jìn)行提取，堅(jiān)桿火 絨草總黃酮得率最高。因此，確定35°C超聲提取0. 5h后再水浴回流提取為最佳提取方式。
[0061] 表3提取方式對(duì)總黃酮提取量的影響
[0063] 分析可見(jiàn)，當(dāng)直接選用回流或超聲提取時(shí)，總黃酮提取量均較低；本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，先 超聲再回流提取這一方式能夠明顯提高總黃酮提取量，但是，這僅限于特定的超聲溫度和 超聲時(shí)間，例如超聲溫度較高時(shí)，或者超聲時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，總黃酮提取量都會(huì)明顯下降，因此， 本發(fā)明優(yōu)選使用的提取方式是：35°C超聲0. 5h再回流3次，每次lh。
[0064] 2. 1. 4提取次數(shù)的選擇
[0065] 在確定了超聲后再回流的提取方式下，對(duì)回流次數(shù)進(jìn)行了考察。試驗(yàn)結(jié)果表明：隨 著回流次數(shù)的增加，總黃酮含量先是逐漸升高，然后趨于平穩(wěn)，當(dāng)回流提取3次后總黃酮含 量幾乎不再增加。因此，確定適宜的提取次數(shù)為3次。
[0066] 表4提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取量的影響
[0068] 通過(guò)單因素試驗(yàn)法，最終確定了堅(jiān)桿火絨草總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇體積 分?jǐn)?shù)70%，料液比lg :50mL，35°C超聲波（40kHz、250W)輔助處理0. 5h后再水浴回流提取3 次每次lh，優(yōu)選工藝條件下，堅(jiān)桿火絨草花期的葉中總黃酮提取率高達(dá)310. 441mg/g。
[0069] 2. 2不同采收期堅(jiān)桿火絨草不同植物部位總黃酮的含量
[0070] 如圖1所示，堅(jiān)桿火絨草總黃酮含量隨采收期的不同而變化，花期總黃酮含量明 顯高于果期；同一植株不同部位總黃酮的含量差異較大，花期堅(jiān)桿火絨草的葉總黃酮含量 最高，平均高達(dá)310. 441mg/g，花部位次之。
[0071] 三、結(jié)論與討論
[0072] 本發(fā)明提取方法總黃酮提取得率高、含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單，可作為一 種高效便捷測(cè)定堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的方法。
[0073] 本發(fā)明同時(shí)對(duì)堅(jiān)桿火絨草不同采收期、不同植物部位中黃酮類化合物進(jìn)行了提取 和含量測(cè)定比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，花期的總黃酮含量均明顯高于果期，同一植株不同部位 總黃酮的含量差異均較大，花期采收的堅(jiān)桿火絨草葉和花中總黃酮含量均明顯高于其他部 位。因此，試驗(yàn)確定了總黃酮可以作為堅(jiān)桿火絨草最佳采收期及最佳藥用部位的評(píng)價(jià)指標(biāo)， 為堅(jiān)桿火絨草中的開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)；同時(shí)試驗(yàn)也驗(yàn)證了 "藏醫(yī)臨床火 灸材料堅(jiān)桿火絨草以花期為最佳采收期"的正確性，并進(jìn)一步確定了其最佳藥用部位應(yīng)為 葉和花，從而為藏醫(yī)臨床安全合理用藥提供科學(xué)理論依據(jù)。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的檢測(cè)方法，其特征在于：具體操作步驟如下： 取待檢藥材，加O~80 %v/v乙醇水溶液提取，收集提取液，制備供試品溶液；取蘆 丁對(duì)照品，以無(wú)水乙醇為溶劑，制備對(duì)照品溶液；分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，采用 NaNO2-AI(NO3) 3-NaOH顯色法顯色后，以未經(jīng)顯色的供試品溶液為空白對(duì)照，在512nm下檢 測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算總黃酮含量即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：乙醇濃度為60~70%v/v;優(yōu)選為 70%v/v〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：乙醇提取具體條件為：料液比為1 : 50~70g/ml，35~60°C超聲提取0. 5~Ih后，再回流提取3~5次，每次lh。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：乙醇提取具體條件為：料液比為1 : 50g/ml，35°C超聲提取0. 5h后，再回流提取3次，每次lh。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：NaN02-Al(NO3)3-NaOH顯色法具體 操作如下：分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，置于IOmL比色管中，加純凈水至5mL;然后加 5%亞硝酸鈉溶液0. 4mL，搖勻，放置5min;再加10%硝酸鋁溶液0. 4mL，搖勻，放置5min;再 加4%氫氧化鈉試液4.OmL，加水稀釋至刻度，搖勻后室溫放置15min即可。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述待檢藥材為菊科 火絨草屬植物堅(jiān)桿火絨草Leontopodium franchetii Beauv?的根、莖、葉、花、果或全草。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于：藥材總黃酮的含量越高，藥材品質(zhì)越 好。
【專利摘要】本發(fā)明提供了堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的檢測(cè)方法，具體操作步驟如下：取待檢藥材，加0～80％v/v乙醇水溶液提取，收集提取液，制備供試品溶液；取蘆丁對(duì)照品，以無(wú)水乙醇為溶劑，制備對(duì)照品溶液；分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法顯色后，以未經(jīng)顯色的供試品溶液為空白對(duì)照，在512nm下檢測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算總黃酮含量即可。本發(fā)明通過(guò)對(duì)藥材提取工藝的考察，最終找到了總黃酮提取量最佳的提取工藝，在此工藝條件下制備供試品溶液，才能夠準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品質(zhì)堅(jiān)桿火絨草中總黃酮的含量測(cè)定，避免因提取不完全或工藝不當(dāng)所致化學(xué)成分改變而帶來(lái)的測(cè)量失誤。
【IPC分類】A61K36/28, G01N21/25
【公開號(hào)】CN104931429
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510325277
【發(fā)明人】劉圓, 趙小燕, 李瑩, 黃艷菲
【申請(qǐng)人】西南民族大學(xué), 劉圓
【公開日】2015年9月23日
【申請(qǐng)日】2015年6月15日