堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 堅(jiān)桿火絨草，別名莪藥、山毛香，為菊科火絨草屬植物堅(jiān)桿火絨草Leontopodium franchetii Beauv.的干燥全草，是藏醫(yī)火灸治療中的重要原材料，其藏藥名"扎托巴"[1]， 也叫"扎瓦" [2]。據(jù)藏醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)書(shū)籍《晶珠本草》記載："扎瓦，治瘟病時(shí)疫，解礦石合毒，治肉 瘤" [3]?！端牟酷t(yī)典》明確闡述："但凡'培根'與'龍'型的寒性病、脈病、'黃水'病等，臨床 皆可通過(guò)煮、燒、烤、熏等方式用灸草的藥性和熱能刺激穴位以治之" [4]。藏藥草灸療法以其 療效顯著、成本低廉、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，從古沿用至今。堅(jiān)桿火絨草作為藏醫(yī)臨床施灸的原 材料，以每年的7~8月正值其花開(kāi)旺盛之時(shí)，擇吉日采集全草，曬干，揉成圓錐狀以備用， 此時(shí)灸草的葉和花朵生長(zhǎng)茂盛，無(wú)籽且葉不宜斷殘，是采集灸草的最佳時(shí)節(jié) [5]。
[0003] 雖然藏醫(yī)臨床使用中，一直沿用花期采摘的方式，但是，直至目前，還未見(jiàn)對(duì)堅(jiān)桿 火絨草化學(xué)成分的報(bào)道，更未見(jiàn)從物質(zhì)基礎(chǔ)上來(lái)研宄堅(jiān)桿火絨草采摘時(shí)期和藥材品質(zhì)的報(bào) 道。若該藥材在流通或使用過(guò)程中，已經(jīng)被粉碎成粉，又或棄去了花或果，無(wú)法直觀辨認(rèn)時(shí)， 將不利于對(duì)藥材質(zhì)量的監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人在研宄中發(fā)現(xiàn)，堅(jiān)桿火絨草中含有總黃酮類成分，并且，現(xiàn)代研宄表明，黃 酮類化合物是許多中草藥的有效成分，某些黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、 降血脂、降血壓、鎮(zhèn)痛、保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)等藥理作用 [6<。因此，本 發(fā)明擬提供對(duì)總黃酮的含量檢測(cè)方法，以便實(shí)現(xiàn)對(duì)堅(jiān)桿火絨草藥材品質(zhì)或采收期的質(zhì)量控 制。
[0005] 具體地，本發(fā)明提供了堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量的檢測(cè)方法，具體操作步驟如 下：
[0006] 取待檢藥材，加0~80%v/v乙醇水溶液提取，收集提取液，制備供試品溶液；取 蘆丁對(duì)照品，以無(wú)水乙醇為溶劑，制備對(duì)照品溶液；分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液，采用 NaN0 2-A1(N03) 3-NaOH顯色法顯色后，以未經(jīng)顯色的供試品溶液為空白對(duì)照，在512nm下檢 測(cè)，外標(biāo)法計(jì)算總黃酮含量即可。
[0007] 對(duì)于乙醇濃度而言，本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用0~80% v/v乙醇進(jìn)行提取時(shí)，總黃 酮提取兩均能夠得到270mg/g以上，再增大濃度，提取量明顯降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙 醇濃度為60~70% v/v時(shí)，總黃酮提取量達(dá)到了 300mg/g甚至更高，因此，可優(yōu)選使用此濃 度范圍。
[0008] 更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度以70% v/v這一濃度最佳，總黃酮提取量高達(dá)310mg/g， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出其他乙醇濃度。
[0009] 其中，乙醇提取具體條件為：料液比為1 :50~70g/ml，35~60°C超聲提取0. 5~ lh后，再回流提取3~5次，每次lh。
[0010] 本發(fā)明研宄發(fā)現(xiàn)，當(dāng)直接選用回流或超聲提取時(shí)，總黃酮提取量均較低；本發(fā)明發(fā) 現(xiàn)，先超聲再回流提取這一方式能夠明顯提高總黃酮提取量，但是，這僅限于特定的超聲溫 度和超聲時(shí)間，例如超聲溫度較高時(shí)，或者超聲時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，總黃酮提取量都會(huì)明顯下降， 因此，本發(fā)明優(yōu)選使用的提取方式是：35°C超聲0. 5h再回流3次，每次lh。
[0011] 因此，本發(fā)明最終確定的乙醇提取具體條件為：料液比為1 :50g/ml，35°C超聲提 取0. 5h后，再回流提取3次，每次lh。
[0012] 進(jìn)一步地，總黃酮檢測(cè)過(guò)程中，NaN02-Al (N03)3_Na0H顯色法具體操作如下：分別取 對(duì)照品溶液和供試品溶液，置于10mL比色管中，加純凈水至5mL ;然后加5%亞硝酸鈉溶液 0. 4mL，搖勻，放置5min ;再加10%硝酸鋁溶液0. 4mL，搖勻，放置5min ;再加4%氫氧化鈉試 液4. OmL，加水稀釋至刻度，搖勻后室溫放置15min即可。
[0013] 其中，所述待檢藥材為菊科火絨草屬植物堅(jiān)桿火絨草Leontopodium franchetii Beauv.的根、莖、葉、花、果或全草。
[0014] 進(jìn)一步地，當(dāng)所檢測(cè)的藥材中，總黃酮的含量越高，表明藥材采收期在花期或接越 近花期，或者表明藥材品質(zhì)越好。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)藥材提取工藝的考察，最終找到了總黃酮提取量最佳的提取工藝， 在此工藝條件下制備供試品溶液，才能夠準(zhǔn)確的實(shí)現(xiàn)對(duì)不同品質(zhì)堅(jiān)桿火絨草中總黃酮的含 量測(cè)定，避免因提取不完全或工藝不當(dāng)所致化學(xué)成分改變而帶來(lái)的測(cè)量失誤。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)對(duì)堅(jiān)桿火絨草不同采收期、不同植物部位總黃酮含量的測(cè)定比較，發(fā) 現(xiàn)花期采摘的藥材中總黃酮含量明顯高于果期，確定了其花期為最佳采收期，這一結(jié)論與 藏醫(yī)的"在秋季花開(kāi)旺盛時(shí)擇吉日采集全草"臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相一致。上述發(fā)現(xiàn)表明，總黃酮 含量可以作為堅(jiān)桿火絨草最佳采收期的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其含量越高表明其采摘時(shí)間越接近最佳 米收期，藥材品質(zhì)越好。
[0017] 如在流通或使用過(guò)程中，已將堅(jiān)桿火絨草粉碎，或已棄去花、果，從外觀無(wú)從辨認(rèn) 藥材采收期的時(shí)候，即可采用本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)藥材的總黃酮含量進(jìn)行對(duì)比，以便確認(rèn)所 使用藥材采收時(shí)期是否合理，品質(zhì)是否較好，這就為該藥材合理開(kāi)發(fā)利用及質(zhì)量控制提供 可借鑒的科學(xué)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1堅(jiān)桿火絨草中總黃酮含量測(cè)定（mg/g)
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1堅(jiān)桿火絨草總黃酮的含量的測(cè)定
[0020] 1材料與方法
[0021] 1.1 材料
[0022] 試驗(yàn)用堅(jiān)桿火絨草樣本分別在2013年7月2和9月24日采收于西南民族大學(xué)青 藏高原研宄基地紅原草地，并經(jīng)于西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研宄院劉圓教授鑒定。樣品用超 純水洗凈曬干，在60°C電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干后，粉碎，過(guò)4號(hào)篩，得堅(jiān)桿火絨草粗粉。
[0023] 1. 1. 2主要試劑.無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純；蘆丁 對(duì)照品，購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司（批號(hào)MUST-12040302,含量彡98% )，試驗(yàn)用 水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。
[0024] 1. 1. 3主要儀器.DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限 公司JY-02多功能粉碎機(jī)，購(gòu)自永康浩瀚工貿(mào)有限公司；METTLER TOLEDO TYPE AE240S電 子分析天平，購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；德國(guó)IKAURV 10控制型旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)儀，購(gòu)自德國(guó)IKA上海分公司；KQ5200E型超聲波清洗器（40kHz、250W)，購(gòu)自昆山超聲儀 器有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購(gòu)自國(guó)華電器有限公司；TU-1950系列紫外可見(jiàn)分光 光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；回流裝置、抽濾裝置、錐形瓶、量筒、移液槍、 容量瓶、比色管等常用儀器。
[0025] 1. 2 方法
[0026] 1. 2. 1紫外分光光度法（UV)測(cè)定樣品中總黃酮含量的測(cè)定方法與依據(jù)
[0027] 蘆丁和黃酮類化合物的基本母核結(jié)構(gòu)均為2-苯基色原酮，具有相同的吸光度測(cè) 試性質(zhì)，于510nm附近均有最大吸收峰，以蘆丁對(duì)照品計(jì)，測(cè)定堅(jiān)桿火絨草中總黃酮的含 量。黃酮類化合物主要包括黃酮苷和黃酮醇苷兩大部分。在黃酮類化合物溶液中加入鋁離 子試劑，在堿性條件下黃酮類化合物中的酚羥基與鋁鹽形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，在可見(jiàn)光區(qū)能 獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，其質(zhì)量濃度與吸光度符合比耳定律，可以定量測(cè)定 [9]。而且研宄表 明NaN02-Al (N03) 3-NaOH顯色法具有靈敏、穩(wěn)定的特性，故而選之作為顯色系統(tǒng)[1°]。
[0028] 1. 2. 2對(duì)照品洛液的制備
[0029] 精密稱量蘆丁對(duì)照品（105°C干燥至恒重）25. OOmg，置50mL容量瓶中，加無(wú)水乙醇 適量，溶解，放冷，加無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，即得〇. 50mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。
[0030] 1. 2. 3供試品溶液的制備
[0031] 精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉（過(guò)4號(hào)篩）lg，于150mL錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70% 的乙醇50mL，先35°C超聲處理0. 5h，再轉(zhuǎn)移至150mL圓底燒瓶中水浴回流提取lh，重復(fù)提 取3次，合并所得濾液，加70%乙醇定容于250mL容量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。
[0032] 1. 2. 4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
[0033] 準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和堅(jiān)桿火絨草樣品溶液適量，分別置于10mL比色管中， 加純凈水至51^;然后加5%亞硝酸鈉溶液0.41^，搖勻，放置51^11;再加10%硝酸鋁溶液 0.41^，搖勻，放置51^11 ;再加4%氫氧化鈉試液4.〇1111，加水稀釋至刻度，搖勻后室溫放置 15min，以提取溶劑為空白參比，在300~650nm之間測(cè)定吸光度，根據(jù)最大吸收峰選定檢測(cè) 波長(zhǎng)。結(jié)果蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和堅(jiān)桿火絨草樣品溶液顯色后均在512nm處有最大吸收峰，故將 512nm確定為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0034] 1. 2. 5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0035] 精密吸取 0. 50mg/mL 的蘆丁對(duì)照儲(chǔ)備液 0、0. 40、0. 80、1. 20、1. 60、2. 00、2. 40mL 分 別置于1〇1^比色管中，加純凈水至51^;然后加5%亞硝酸鈉溶液0.41^，搖勻，放置51^11 ; 再加1〇%硝酸鋁溶液〇.41^，搖勻，放置51^11;再加4%氫氧化鈉試液4.〇1111，加水稀釋至 刻度，搖勻后室溫放置15min，以溶解溶劑為空白參比。按照中國(guó)藥典2010年版一部附錄 VA下的紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)512nm處測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)溶液濃度進(jìn)行線 性回歸分析，結(jié)果表示，濃度在〇~120ug/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，回歸方程為Y = 0. 0102X+0. 0247, R2= 0. 9998。
[0036] 1. 2. 6方法學(xué)考察
[0037] ①精密度試驗(yàn)。精密量取"1. 2. 2項(xiàng)"中對(duì)照品溶液lmL，6份，分別按"1. 2. 5項(xiàng)" 下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值，RSD值為0.77%，表明本方法精密度良 好。
[0038] ②穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一批堅(jiān)桿火絨草粗粉，按照"1. 2. 3項(xiàng)"下的方法制備供試品 溶液，按"1. 2. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法處理，分別于顯色后15、30、60、90、120min時(shí)于 512nm下測(cè)定吸光度值，RSD值為1. 18%，表明樣品溶液在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。
[0039] ③重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取堅(jiān)桿火絨草粗粉6份，按照" 1. 1. 3項(xiàng)"下的方法制備供試 品溶液，按"1. 1. 5項(xiàng)"下標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法于512nm下測(cè)定吸光度值，RSD值為0. 94%， 表明本方法重復(fù)性較好。
[0040] ④回收率試驗(yàn)。精密稱