將昆明小鼠腹腔無菌接種弓形蟲RH株，三天后收集腹水中的蟲體，用20號針頭的 注射器抽吸兩次以破碎腹腔巨噬細(xì)胞，蟲體稀釋后以5ym濾器過濾，所得純化后的蟲體用 無血清DMEM清洗兩次后以無血清DMEM按照1X108/毫升濃度懸浮蟲體，重提懸液5 %二氧 化碳培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)2h以使蟲體分泌ESA，lOOOrpm離心10min除去蟲體并收集上清，將上 清中添加復(fù)合型蛋白酶抑制劑后利用3KDa蛋白濃縮管20倍濃縮，將濃縮后的蛋白在4°C條 件下無菌PBS透析后測定ESA蛋白濃度并分裝，-80°C保存。
[0030] 2、多克隆抗體的制備
[0031] 將1中所述ESA加同體積弗氏佐劑乳化后，按照100yg/只免疫BALB/c小鼠，每 次免疫間隔2周，首次免疫十天后尾靜脈采集血液分離血清用于抗體滴度ELISA檢測。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 不同感染天數(shù)的急性感染弓形蟲犬血清樣本的制備
[0034] 選擇清潔級比格犬，試驗(yàn)組和對照組各3只，試驗(yàn)組腹腔無菌接種1X109個新鮮 收集的純化后的無菌PBS重懸的實(shí)施例1所述弓形蟲RH株蟲體，對照組接種無菌PBS，檢測 體溫變化并每天采集血液至感染后7天，分離血清后用作弓形蟲急性感染動物血清。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 弓形蟲急性感染不同天數(shù)的血清中循環(huán)抗原的免疫親和層析
[0037] 1、犬血清IgG的去除
[0038] 將實(shí)施例2中所述感染弓形蟲RH株3天內(nèi)的犬血清60yl加至540yl無菌 PBS(pH= 7. 2)中，加入100y1 25% (v/v)的ProteinA瓊脂糖微球，4°C緩慢攪拌2h后 離心收集上清，上清即為除去大部分IgG的稀釋血清。
[0039] 2、去除非特異性結(jié)合
[0040] 將上述收集的上清中加入5y1NormalMouseIgG和100y1 25%的ProteinG 瓊脂糖微球，4°C緩慢攪拌2h后離心收集上清。
[0041] 3、免疫沉淀富集目的蛋白
[0042] 將上述收集的上清中加入5y1實(shí)施例1中制得的ESA多抗后4°C攪拌過夜，加入 100y1 25%的ProteinG瓊脂糖微球，4°C攪拌3h后離心收集瓊脂糖微球，將微球清洗3次 后加入60y1 2XSDS-PAGE上樣緩沖液，100°C煮沸5min后2500rpm離心5min收集上清。
[0043] 4、膜輔助蛋白質(zhì)組制備（FASP)樣品的酶解
[0044] 將3中所獲得的富集的蛋白加入DTT至終濃度為lOOmM，沸水浴5min，冷卻至室 溫。加入200yL尿素buffer(8M尿素，150mMTrisHClpH8.0)混勻，轉(zhuǎn)入10kD超濾離心管， 14000g離心 15min。加入 200yL尿素bufTerl4000g離心 15min，棄濾液。加入 100yL50mM 碘乙酰胺，所述碘乙酰胺溶于8M尿素，該8M尿素由150mMTris-HCl，pH8. 0配制成（這里 請您確認(rèn)或修改），600rpm振蕩lmin，避光室溫30min，14000g離心10min。加入100yL前述 尿素緩沖液，14000g離心10min重復(fù)2次。加入100yL溶解緩沖液（Dissolutionbuffer)， 所述溶解緩沖液為25mMNH4HC03,140 00g離心10min重復(fù)2次。加入40y1Trypsin緩沖 液（2ygTrypsin加入到40yL溶解緩沖液配成），600rpm振蕩lmin，37°C16-18h。換新 收集管，14000g離心10min，取濾液，準(zhǔn)備進(jìn)行液相色譜偶聯(lián)質(zhì)譜分析。
[0045] 5、毛細(xì)管高效液相色譜
[0046] 液相A液為0.1 % (v/v)甲酸水溶液，B液為0.1 % (v/v)甲酸乙腈水溶液，其中 乙腈為84% (v/v)。
[0047] 色譜柱 0? 15mm*150mm(RP-C18)(ColumnTechnologyInc.)以 95% (v/v)的A液 平衡。將4中所得樣品由自動進(jìn)樣器上樣到Zorbax300SB_C18peptidetraps，再經(jīng)色譜柱 分離，相關(guān)液相梯度如下：〇分鐘-50分鐘，B液線性梯度從4%到50% ;50分鐘-54分鐘， B液線性梯度從50 %到100% ;54分鐘-60分鐘，B液維持在100%。
[0048] 6、ESI質(zhì)譜鑒定
[0049] 將5中的經(jīng)過毛細(xì)管高效液相色譜分離到的產(chǎn)物再經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽 及分離后用QExactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測方式：正離子。多肽和多肽的碎片的質(zhì) 量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（fullscan)后采集10個碎片圖譜（MS2scan)。
[0050] 7、ESI質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析
[0051] 原始文件（rawfile)用用Mascot2. 2軟件搜索相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫。最后得到鑒 定的蛋白質(zhì)結(jié)果。相關(guān)參數(shù)如下：Enzyme=Trypsin、Missedcleavage= 2、Fixed modification：Carbamidomethyl(C),Variablemodification：0xidation(M)搜索使用 Uniprot數(shù)據(jù)庫：uniprot_Toxoplasma_gondii_26517_20140612.fasta蛋白質(zhì)庫（收錄序 列 26517 條，下載于 201406013)。Peptidestolerance:20ppm，MS/MStolerance:0?IDa， Mascot結(jié)果過濾參數(shù)為：Mascotscore多20。搜庫結(jié)果表明ELMO蛋白的蛋白序列覆蓋率 為0. 71 %，唯一肽段數(shù)為2,唯一肽段數(shù)多2即為成功鑒定。
[0052] 實(shí)施例4序列分析
[0053] ELMO基因核苷酸序列及蛋白安氨基酸序列以NCBI在線數(shù)據(jù)庫和DNAstar軟件進(jìn) 行分析。不同物種ELMO氨基酸序列的進(jìn)化樹分析表明，弓形蟲ELMO重組蛋白除了與貓寄 生的非致病性的哈氏哈蒙德蟲（Hammondiahammondi)ELMO同源性較高外，與其他物種同源 性較低，結(jié)果見圖1。
[0054] 實(shí)施例5
[0055] 原核表達(dá)與弓形蟲早期檢測相關(guān)的標(biāo)志蛋白
[0056] 1、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0057]根據(jù)剛地弓形蟲ELMO基因的已知序列（Gen-Bank收錄號：XM_002367397. 1)，利用 Primer5. 0針對其開放閱讀框設(shè)計(jì)引物，預(yù)期擴(kuò)增基因的長度為930bp，在上、下游引物5' 端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，上游引物FP: 5'TCTGGATCCGGGTCTCCGAGGTA3'，下游 引物RP: 5'AAGGTCGACTAGACCGGACGGAG3'，
[0058] 2、弓形蟲RH株的收集及RNA的提取
[0059] 從液氮中取出保種的弓形蟲RH株復(fù)蘇，腹腔接種小鼠，3d后用滅菌生理鹽水沖洗 腹腔，收集腹腔液，l〇〇〇rpm離心15min，棄上清液，所得弓形蟲RH株蟲體用PBS洗3次，采 用Trizol法提取RNA。總RNA保存于-70°C備用。
[0060]3、ELMO基因的RT-PCR擴(kuò)增
[0061] 將提取的總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以此為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25yL) :2XTaqMix12. 5yL，上、下游引物及cDNA模板各lyL，加入dd H20 補(bǔ)至 25yL。反應(yīng)條件：94°C4min;94°C45s，58°C50s，72°C50s，30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，如圖2 所示。將回收純化的PCR產(chǎn)物與pMD19T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10感受 態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。經(jīng)菌落PCR鑒定后，將陽性質(zhì)粒送。陽性質(zhì)粒被命 名為PMD19T-ELM0。
[0062] 4、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定
[0063] pMD19T-ELM0和pET-28a表達(dá)載體均用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切， 酶切后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，挑取單個菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切鑒定。
[0064] 5、重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)
[0065] 重組質(zhì)粒的表達(dá)及可溶性分析：將篩選的陽性重組菌接種于10mL含卡那霉素 70yg/mL的LB液體培養(yǎng)基，于37°C、200rpm振搖培養(yǎng)8h后，接種于250mlLB卡那霉素培 養(yǎng)基中，相同條件擴(kuò)大培養(yǎng)至〇D600nm值為0. 6-0. 8時，加入0. 5mmol/LIPTG，20°C誘導(dǎo)表 達(dá)12h。8000rpm離心lOmin收集菌體，將離心收集的誘導(dǎo)表達(dá)菌體用1/10原培養(yǎng)液體積 的1X結(jié)合緩沖液重懸，于冰浴上超聲破碎，12000rpm離心lOmin，分別收集上清液和沉淀， 通過SDS-PAGE分析重組蛋白的存在形式并純化。
[0066] 6、重組蛋白ELMO的純化
[0067] 將誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體，用