一種用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗，本發(fā)明還提供了該疫苗 的制備方法，屬于疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲(chóng)病是由剛地弓形蟲(chóng)引起的一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的人獸共患病。其宿主 范圍非常廣，能夠感染人及大多數(shù)動(dòng)物。弓形蟲(chóng)感染對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重，主要造成流 產(chǎn)、畸胎、死產(chǎn)等。弓形蟲(chóng)的危害巨大，但對(duì)該病的防治至今尚未找到理想的藥物。盡管抗 寄生蟲(chóng)藥物非常有效、廉價(jià)并且易于用藥，但弓形蟲(chóng)耐藥性的產(chǎn)生以及人們普遍關(guān)注的藥 物殘留問(wèn)題日益嚴(yán)重。相比而言，疫苗比較安全，無(wú)化學(xué)殘留且無(wú)污染。有學(xué)者通過(guò)對(duì)弓形 蟲(chóng)抗原及免疫效應(yīng)的深入研宄后認(rèn)為有效的疫苗對(duì)該病的防治具有顯著的意義。弓形蟲(chóng)疫 苗的研宄經(jīng)歷了滅活疫苗、減毒活疫苗等多種探索，前者刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗感染能力弱，后 者雖能較好地產(chǎn)生保護(hù)作用，但由于經(jīng)突變后恢復(fù)毒力，故不適用?？ń槊纾˙CG)是全世界 應(yīng)用最廣的預(yù)防結(jié)核病的疫苗，也是表達(dá)外源基因的活菌疫苗載體，它本身是一種免疫佐 劑和非特異免疫增強(qiáng)劑，能提高機(jī)體的免疫力。重組卡介苗（rBCG)集佐劑和載體于一身， 兼外源基因與活疫苗于一體，接種后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。多種病 毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)抗原以及細(xì)胞因子等蛋白，均可以在rBCG中表達(dá)。因此，采用基因工程方 法研發(fā)一種高效、廉價(jià)的新型動(dòng)物弓形蟲(chóng)病重組卡介苗是當(dāng)務(wù)之急。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供一種用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗，為穿梭表達(dá)載體用于動(dòng)物 弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗和整合表達(dá)載體用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗。
[0004] 本發(fā)明還公開(kāi)了用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗的制備方法，適用于工業(yè)化 生產(chǎn)。
[0005]本發(fā)明用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗的解決方案如下： 將獲得動(dòng)物的細(xì)胞因子基因和剛地弓形蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因，進(jìn)行TA克隆，測(cè)序鑒定正 確后將二者連接為組合體，然后再將二者組合體連接體與大腸桿菌_分枝桿菌穿梭表達(dá)載 體PMV261和整合表達(dá)載體pMV361相連，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BCG，經(jīng)抗性和PCR篩選得到用于 動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗。
[0006]本發(fā)明所提供的用于動(dòng)物弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗制備方法 本發(fā)明以剛地弓形蟲(chóng)保護(hù)性抗原Rhomboid(Rho)基因和犬白介素2 (IL-2)基因?yàn)槔?進(jìn)行穿梭表達(dá)載體和整合表達(dá)載體的構(gòu)建，分別制成疫苗。
[0007] 、穿梭表達(dá)載體用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗疫苗的制備： 根據(jù)Genbank公布犬白介素2 (DIL-2)基因序列的開(kāi)放閱讀框、剛地弓形蟲(chóng)Rhomboid基因序列的開(kāi)放閱讀框以及PMV261穿梭表達(dá)載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物分別對(duì)犬白介素2 (DIL-2)基因和剛地弓形蟲(chóng)Rhomboid基因PCR，TA克隆。測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切 膠回收，與進(jìn)行同樣酶切的PMV261穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接為pMV26l-DIL2-Rho，轉(zhuǎn)入DH5a中，將重組質(zhì)粒pMV261-DIL2-Rho電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選 BCG重組子，PCR證實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電 泳分析及Westernblotting鑒定，命名為rBCGpMV261_DIL2_Rho。
[0008] 疫苗免疫效果檢測(cè)：將制備好的穿梭表達(dá)載體用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗 rBCGpMV261-DIL2-Rho以106CFU/只的劑量通過(guò)皮下注射免疫途徑免疫寵物犬，并同時(shí)設(shè) BCG組和空白對(duì)照組，三免二周后腹腔注射的方式接種弓形蟲(chóng)RH株速殖子進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)， 通過(guò)存活時(shí)間、存活率、體液免疫水平和細(xì)胞因子水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
[0009] 穿梭表達(dá)載體用于犬弓形蟲(chóng)病重組卡介苗疫苗rBCGpMV261-DIL2-Rh0可對(duì)抗 一定劑量剛地弓形蟲(chóng)對(duì)犬的攻擊，特異性抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而逐漸升高，且差異極 顯著（P〈0.01) ;IL-2、IFN-y、TNF-a等細(xì)胞因子濃度均明顯升高，且與對(duì)照組相比差異 極顯著（P〈〇. 01);經(jīng)腹腔接種弓形蟲(chóng)1〇5個(gè)/只，犬存活時(shí)間與對(duì)照組相比均差異顯著 (P〈0. 05)〇
[0010] 、整合表達(dá)載體用犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗疫苗的制備： 根據(jù)犬白介素2 (DIL-2)基因序列的開(kāi)放閱讀框、剛地弓形蟲(chóng)Rhomboid基因序列的開(kāi) 放閱讀框以及PMV361穿梭表達(dá)載體酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物分別對(duì)犬白介素2 (DIL-2)基因和 剛地弓形蟲(chóng)Rhomboid基因PCR，TA克隆。測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行雙酶切，切膠回收，與進(jìn)行同 樣酶切的PMV361穿梭表達(dá)載體進(jìn)行連接為pMV361-DIL2-Rho,轉(zhuǎn)入DH5 a中，將重組質(zhì)粒 pMV261-DIL2-Rho電穿孔轉(zhuǎn)化卡介苗中，37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，篩選BCG重組子，PCR證 實(shí)為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行45°C熱誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting鑒定，命名為rBCGpMV361-DIL2-Rho。
[0011] 疫苗免疫效果檢測(cè)：將制備好的整合表達(dá)載體用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗 rBCGpMV361-DIL2-Rho以106CFU/只的劑量通過(guò)皮下注射免疫途徑免疫寵物犬，并同時(shí)設(shè)BCG組和空白對(duì)照組，三免二周后腹腔注射的方式接種弓形蟲(chóng)RH株速殖子進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)， 通過(guò)存活時(shí)間、存活率、體液免疫水平和細(xì)胞因子水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。
[0012] 整合表達(dá)載體用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防重組卡介苗疫苗rBCGPmv361-DIL2-Rho可對(duì) 抗一定劑量剛地弓形蟲(chóng)對(duì)犬的攻擊，特異性抗體滴度隨免疫次數(shù)增加而逐漸升高，且差異 極顯著（P〈〇. 01) ;IL_2、IFN-y、TNF-a等細(xì)胞因子濃度均明顯升高，且與對(duì)照組相比差 異極顯著（P〈〇. 01)。經(jīng)腹腔接種弓形蟲(chóng)1〇5個(gè)/只，犬存活時(shí)間與對(duì)照組相比均差異顯著 (P〈0. 05)〇
[0013]Rhomboid蛋白作為一類(lèi)膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶，是參與EGF和EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的 調(diào)節(jié)器。Rhomboid蛋白最先在果幡體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)在許多原核和真核生物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn) 了該蛋白，在寄生蟲(chóng)領(lǐng)域，惡性瘧原蟲(chóng)、柔嫩艾美爾球蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)、弓形蟲(chóng)中均發(fā)現(xiàn)了 Rhomboid蛋白。最近的研宄已經(jīng)確立了Rhomboid蛋白在頂器門(mén)原蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中 水解微線(xiàn)蛋白致使蟲(chóng)體進(jìn)入靶細(xì)胞的重要地位。研宄發(fā)現(xiàn)弓形蟲(chóng)入侵宿主細(xì)胞的完整過(guò)程 需要粘附蛋白配體與宿主細(xì)胞受體之間的解聚作用，Rhomboid蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的絲氨酸 蛋白酶，在弓形蟲(chóng)體內(nèi)有分解黏附素的作用。因此本發(fā)明選擇使用Rhomboid基因作為保護(hù) 性抗原基因進(jìn)行重組卡介苗的構(gòu)建。IL-2又稱(chēng)T細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Tcellgrowthfactor， TCGF)主要是有⑶4+和⑶8 +T淋巴細(xì)產(chǎn)生的一種糖蛋白。有研宄表明IL-2基因可以誘導(dǎo) 感染弓形蟲(chóng)的鼠IFN-Y分泌增加，使小鼠的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。另有研宄表明IL-2基因 可以有明顯的增強(qiáng)Rhomboid蛋白的保護(hù)作用。因此本發(fā)明選擇使用Rhomboid基因作為保 護(hù)性抗原基因進(jìn)行重組卡介苗的構(gòu)建，并將白介素2 (DIL-2)插入到載體中以增加疫苗效 果。
[0014] 這樣的活載體疫苗既能發(fā)揮卡介苗本身較強(qiáng)的細(xì)胞免疫佐劑作用，又能使表達(dá)的 蛋白發(fā)揮免疫保護(hù)作用，達(dá)到更好的預(yù)防弓形蟲(chóng)病的目的。因此這兩種疫苗的研制具有非 常廣闊的前景和應(yīng)用價(jià)值。
[0015] 將本發(fā)明提供的兩種用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重組卡介苗通過(guò)皮下注射途徑免疫 犬，以腹腔注射的方式接種弓形蟲(chóng)RH株速殖子進(jìn)行攻蟲(chóng)試驗(yàn)，通過(guò)存活時(shí)間、存活率、體液 免疫水平和細(xì)胞因子水平檢測(cè)等指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，用于犬弓形蟲(chóng)病預(yù)防的重 組卡介苗rBCGpMV261-DIL2-Rho和rBCGpMV361-DIL2-Rho組均具有明顯的免疫促進(jìn)作用， 各指標(biāo)均強(qiáng)于陰性對(duì)照組，具有較好的抗剛地弓形蟲(chóng)效果。
[0016] 本發(fā)明的積極效果在于： 利用重組卡介苗（rBCG)集佐劑和載體于一身，兼外源基因與活疫苗于一體，接種后可 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，而且又能表達(dá)細(xì)胞因子和弓形蟲(chóng)抗原蛋白，表 達(dá)的細(xì)胞因子能使表達(dá)的蛋白發(fā)更好的免疫保護(hù)作用，兩者優(yōu)勢(shì)組合，達(dá)到更好的預(yù)防弓 形蟲(chóng)病的目的。
[0017] 本發(fā)明疫苗熱穩(wěn)定性好，運(yùn)輸和保存較為容易，易于生產(chǎn)，產(chǎn)品不需純化，可直接 用于免疫保護(hù)試驗(yàn)，免去了蛋白質(zhì)后處理的復(fù)雜工序，從而大大降低了成本，適宜于廣大農(nóng) 村。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為pMV261-IL2-Rho載體構(gòu)建示意圖； 圖2為pMV(361)-IL2-Rho載體構(gòu)建示意圖； 圖3為pMV261 (361)-IL2-Rho在卡介苗表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果； 圖4為pMV2(