一種用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 剛地弓形蟲（goWii)是一種嚴(yán)格胞內(nèi)寄生性原蟲，呈世界性分布，能 感染包括人和動物在內(nèi)的所有溫血動物，是典型的人獸共患性寄生蟲病病原。全球約有35% 的人群感染弓形蟲，部分地區(qū)感染率更高。弓形蟲感染多呈隱性，對免疫功能低下或缺陷病 人如器官移植病人、AIDS和惡性腫瘤患者以及孕婦人群危害最大。同時，弓形蟲感染家畜， 能夠造成患病家畜流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸胎等癥狀，給畜牧業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前仍 無治療弓形蟲病的理想藥物，因此研制安全有效的抗弓形蟲疫苗在弓形蟲病的預(yù)防和治療 中尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一種用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗，具有良好的免疫效果。
[0004]絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要組分，有絲氨酸/蘇氨酸 激酶活性，主要介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、迀移和應(yīng)激反應(yīng)等重要生命 活動，與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。弓形蟲er々7基因編碼的ERK7蛋白屬M(fèi)APK激酶 家族，可能參與調(diào)控機(jī)體細(xì)胞的增殖和/或分化功能。弓形蟲基因由11個外顯子和 10個內(nèi)含子組成，全長6596bp，負(fù)責(zé)編碼692個氨基酸，分子量約74kD。本發(fā)明將弓形 蟲e>r々7基因原核表達(dá)所得的ERK7蛋白與弗氏佐劑（Freund'sadjuvant，F(xiàn)A)聯(lián)合應(yīng)用，進(jìn) 行抗弓形蟲急性和/或慢性感染的免疫效果評估。結(jié)果顯示，該蛋白疫苗的免疫新方案能 夠有效地延長弓形蟲GT1急性感染BALB/c鼠的存活時間，以及抑制弓形蟲PRU慢性感染中 腦包囊的產(chǎn)生，取得了較好的免疫保護(hù)性效果。
[0005]本發(fā)明提供一種一種免疫原性組合物，所述組合物由弓形蟲重組蛋白和佐 劑。
[0006]作為優(yōu)選方案，所述佐劑為弗式完全佐劑和弗氏不完全佐劑。
[0007] 作為另一優(yōu)選方案，所述疫苗中的蛋白濃度為0. 7mg/mL。
[0008] 作為又一優(yōu)選方案，所述弓形蟲重組蛋白與佐劑的體積比值為：1:1。
[0009]本發(fā)明還要求保護(hù)一種用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分為 權(quán)利要求1-4任一所述的免疫原性組合物。
[0010] 本發(fā)明還要求保護(hù)疫苗的制備方法，步驟如下： (1) 制備弓形蟲er々7重組蛋白； (2) 將弓形蟲重組蛋白與佐劑混合制劑，得到疫苗。
[0011] 本發(fā)明還要求保護(hù)上述免疫原性組合物或免疫疫苗在制備預(yù)防弓形蟲感染的藥 物中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還要求保護(hù)編碼權(quán)利要求1所述的弓形蟲重組蛋白的核酸。
[0013] 本發(fā)明還要求保護(hù)包含權(quán)利要求7所述核酸的表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明還要求保護(hù)包含權(quán)利要求8所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的免疫疫苗能夠有效地延長弓形蟲GT1急性感染BALB/c鼠的存活時間，本 發(fā)明的免疫疫苗對PRU急性感染并無明顯效果，但能大幅度降低弓形蟲PRU慢性感染中腦 包囊數(shù)目，取得了良好的免疫效果。
【附圖說明】
[0016] 附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為弓形蟲GT1感染BALB/c鼠存活時間線形圖； 圖2為弓形蟲PRU慢性感染中腦包囊數(shù)目線形圖； 圖3為原核表達(dá)載體pET30a質(zhì)粒圖； 圖4為重組載體pET30a-er々7質(zhì)粒圖。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0018] 實施例1 (一）構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30a-er々7 1、弓形蟲GT1總RNA的提?。簭囊旱腥〕龉蜗xGT1蟲株，37 °C迅速解凍后腹腔接 種BALB/c雌鼠若干。連續(xù)傳代三次后，無菌收集發(fā)病的BALB/c鼠腹水，室溫9000rpm離 心10min。沉淀用于GT1總RNA提取，提取方法參照北京天根生化科技有限公司RNAprep Pure動物組織總RNA提取試劑盒的使用說明書進(jìn)行。
[0019] 2、弓形蟲基因的特異性擴(kuò)增：以弓形蟲GT1總RNA為模板，參照 PrimeScript?OneStepRT-PCR試劑盒（TaKaRa)使用說明，特異性擴(kuò)增er々7目的基因，反 應(yīng)體系為：PrimeScript?OneStepEnzymeMixlyL，2XOneStepBuffer12.5yL，上 / 下游引物（20yM)各0.5yL，總RNA模板lyL，補(bǔ)加RNaseFreedH20至25.0yL;反應(yīng)條 件為：50°CRT反應(yīng) 30min;95°CRTase失活 2min;95 °C預(yù)變性 5min;95 °C變性 45 s，56. 5 °C退火30s，72 °C延伸2min，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 °C延伸10min。
[0020] 上游引物：5,-GGAATTCCATATGAAACACCATCATCATCATCATCAGATGAGTGACGAGGTCGACA AAC-3，， 下游引物：5'-CCGGAATTCTTATCAGCTGTTGTATGTCTTGGAC-3'。
[0021] 其中，單劃線、雙劃線和虛線標(biāo)注處分別為AWel位點、6XHis標(biāo)簽和AcoRI位點； 3、目的基因的連接、轉(zhuǎn)化與測序：RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD18-TVector (TaKaRa)4 °C條件下連接過夜，產(chǎn)物命名為pMD18-er々7,并將其轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞。陽 性克隆送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增的的核苷酸序列 參見序列表SEQID No. 1，其編碼的氨基酸序列參見序列表SEQID No. 2。
[0022] 4、小量提取質(zhì)粒：參照北京天根生化科技有限公司TIANprepMiniPlasmidKit 的使用說明進(jìn)行。
[0023] 5、目的片段的回收與原核表達(dá)載體的構(gòu)建：將pET30a和pMD18-er々7質(zhì)粒分別雙 酶切（yWelA5boRI)后，進(jìn)行目的片段的回收純化。經(jīng)T4DNALigase(TaKaRa)，將er々7基 因定向亞克隆至pET30a原核表達(dá)載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌BL21的感受態(tài)細(xì)胞中， 陽性菌株命名為pET30a-er々7。其核苷酸序列參見序列表中SEQIDNo.4。
[0024](二）ERK7原核表達(dá)蛋白的純化與定量 1、原核表達(dá)ERK7蛋白：將陽性表達(dá)菌pET30a-er々7 0. 4mL接種于400mLLB培養(yǎng)基 (Kan+抗性）中，培養(yǎng)過夜后常規(guī)誘導(dǎo)ERK7蛋白的表達(dá)。
[0025] 2、ERK7蛋白的預(yù)處理：4°C條件下，9000rpm離心10min，棄上清。向所得菌體沉 淀中加入20mL無菌PBS溶液，漩渦震蕩混勻。-80 °C與37 °C反復(fù)凍融三次后進(jìn)行超聲破 碎(超聲4s，停3s，共超聲破碎7min)。超聲結(jié)束后，4°C10000rpm離心1min，棄上 清，沉淀用40mL8M尿素溶解。
[0026] 3、ERK7蛋白的純化：蛋白純化參照Novagen公司Ni-NTAHis?Bind?Resin試劑 盒使用說明進(jìn)行。
[0027] 4、ERK7蛋白的透析：使用21MM透析袋(MW:12000-14000)常規(guī)透析，透析液為無 菌PBS溶液。
[0028] 5、ERK7蛋白的定量：透析產(chǎn)物的濃度用分光光度計在280nm波長處測得，濃度為 1.238mg/mL。
[0029](三）免疫效果的評估 1、BALB/c實驗鼠的分組：4-6周齡BALB/c雌鼠購買自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 實驗動物中心，并將其隨機(jī)分為3組（I:BlankControl;II:PBS+FA;III:ERK7+FA)，每組 16只。
[0030] 2、免疫方案： 第I組（BlankControl):不作任何處理，為空白對照組； 第II組（PBS+FA):無菌PBS溶液與FA等體積混合，完全乳化(連續(xù)震蕩混勻1. 5h，下 同）后，經(jīng)兩個途徑(腿部肌肉注射和頸部皮下接種，下同）免疫BALB/c鼠； 第III組（ERK7+FA) :70yg步驟(二）得到的ERK7蛋白與100yLFA等體積混合， 經(jīng)完全乳化后免疫BALB/c鼠； 免疫時間間隔為1 ?，共免疫5次，其中前2次所用佐劑為弗氏完全佐劑，后3次為弗氏 不完全佐劑。每只BALB/c鼠每次每部位免疫100yLPBS+FA或100yLERK7+FA。
[0031] 3、弓形蟲GT1和PRU蟲株的攻擊感染：最后一次免疫（即第5次免疫)后的第14d 進(jìn)行攻蟲感染實驗，具體攻蟲方案如下所示： 腹腔注射弓形蟲GT1株：將新鮮收集的弓形蟲GT1速殖子稀釋為10 4個/mL后，按照 每只100yL的注射劑量，腹腔感染BALB/c鼠(每組8只），觀察并記錄實驗鼠存活時間。 結(jié)果顯示，本發(fā)明的蛋白疫苗能夠有效地延長弓形蟲GT1急性感染BALB/c鼠的存活時間 (代〇. 05)，具體結(jié)果見表1和圖1A: 表1弓形蟲GT1感染BALB/c鼠存活時間統(tǒng)計表
*KO. 05 灌胃感染弓形蟲PRU株：將新鮮收集的弓形蟲PRU包囊稀釋為200個/mL后，按照每只 100yL的灌胃劑量，經(jīng)口感染BALB/c鼠(每組8只），觀察并記錄實驗鼠存活時間。灌胃感 染28d后處死存活小鼠，進(jìn)行腦包囊計數(shù)。結(jié)果顯示，本發(fā)明的蛋白疫苗對PRU急性感染 并無明顯效果，但能大幅度降低弓形蟲PRU慢性感染中腦包囊數(shù)目（K0. 001)，具體結(jié)果見 表2,表3和圖1B，圖2所示： 表2弓形蟲PRU感染BALB/c鼠存活時間統(tǒng)計表
表3弓形蟲PRU感染BALB/c存活鼠腦包囊計數(shù)統(tǒng)計表
林* K0. 001〇
[0032]最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種免疫原性組合物，其特征在于：所述組合物由弓形蟲重組蛋白和佐劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其特征在于：所述佐劑為弗式完全佐劑和 弗氏不完全佐劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于：所述疫苗中的蛋白濃度 為 0? 7mg/mL〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特征在于：所述弓形蟲重組蛋 白與佐劑的體積比值為：1:1。5. -種用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗，其特征在于：所述疫苗的有效成分為權(quán)利要 求1-4任一所述的免疫原性組合物。6. 權(quán)利要求5所述的疫苗的制備方法，其特征在于：步驟如下： (1) 制備弓形蟲er々7重組蛋白； (2) 將弓形蟲重組蛋白與佐劑混合制劑，得到疫苗。7. 權(quán)利要求1-4任一所述的免疫原性組合物或權(quán)利要求5所述的免疫疫苗在制備預(yù)防 弓形蟲感染的藥物中的應(yīng)用。8. 編碼權(quán)利要求1所述的弓形蟲重組蛋白的核酸。9. 包含權(quán)利要求8所述核酸的表達(dá)載體。10. 包含權(quán)利要求9所述的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種免疫原性組合物，所述組合物由弓形蟲<i>erk</i>7重組蛋白和佐劑。本發(fā)明還提供用于弓形蟲感染預(yù)防的免疫疫苗，所述疫苗的有效成分為權(quán)利要求1-4任一所述的免疫原性組合物。本發(fā)明的免疫疫苗能夠有效地延長弓形蟲GT1急性感染BALB/c鼠的存活時間，本發(fā)明的免疫疫苗對PRU急性感染并無明顯效果，但能大幅度降低弓形蟲PRU慢性感染中腦包囊數(shù)目，取得了良好的免疫效果。
【IPC分類】A61K39/39, C12N15/12, A61K39/002, A61P33/02, C12R1/19, C12N1/21, C12N15/70
【公開號】CN105169387
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李中原, 趙禹, 朱興全, 徐民俊
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年8月31日