一種檢測(cè)弓形蟲急性感染的方法及其靶標(biāo)蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)弓形蟲急性感染的方法及其靶 標(biāo)蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲是一種世界范圍內(nèi)寄生的原蟲，可導(dǎo)致人畜流產(chǎn)、死胎和免疫抑制患者死 亡，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，確診困難，給公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)帶來(lái)極大危害。在過(guò)去，免疫學(xué)檢測(cè)方 法是弓形蟲病的主要檢測(cè)方法，但是抗弓形蟲IgG的檢測(cè)難以區(qū)分急性感染和既往感染， IgM和IgA陽(yáng)性也不能作為急性感染的標(biāo)志。因此，弓形蟲急性感染的早期檢測(cè)標(biāo)志物有待 進(jìn)一步尋找確定。
[0003] 弓形蟲循環(huán)抗原（CirculatingAntigens，CAg)是弓形蟲急性感染期蟲體自身排 泄和裂解產(chǎn)物，動(dòng)物感染弓形蟲1-2天即可檢出CAg，2周后滴度顯著降低，CAg陽(yáng)性提示弓 形蟲病急性、活動(dòng)性感染，是病原體存在的重要標(biāo)志，是早期感染的可靠指標(biāo)。排泄-分泌 抗原（Excretory/SecretoryAntigens，ESA)為CAg的主要成分，現(xiàn)有研宄大多是提取ESA 抗原或者表達(dá)某個(gè)分泌蛋白制備多抗來(lái)檢測(cè)血清中的CAg，由于CAg抗原的含量較少，且成 分復(fù)雜，從而使得這些方法的特異性、靈敏度有限。因此，目前尚缺少一種特異性和靈敏度 都較高的檢測(cè)弓形蟲的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服了目前檢測(cè)弓形蟲感染的方法難以區(qū)分急性 感染和既往感染、利用循環(huán)抗原來(lái)檢測(cè)急性感染的方法因循環(huán)抗原含量低、成分復(fù)雜等原 因特異性和靈敏度有限的問(wèn)題，提供了一種適用于弓形蟲早期急性感染檢測(cè)的高特異性、 高敏感性的檢測(cè)方法，用所述檢測(cè)方法能夠快速檢測(cè)弓形蟲急性感染，并具有較高的特異 性和靈敏度。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案之一：一種非疾病診斷治療目的的檢測(cè)弓形蟲急性感染的方法， 其包括下述步驟：使待檢測(cè)樣本與弓形蟲ELMO蛋白或所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體發(fā)生反 應(yīng)。
[0006] 本發(fā)明中，所述待檢測(cè)樣本可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指被弓形蟲感染的樣本，較佳地 為被弓形蟲感染后的血清樣本。
[0007] 本發(fā)明中，所述弓形蟲ELMO蛋白可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指，較佳地為氨基酸序列如 GenBank收錄號(hào)為EPT30320. 1的序列所示，所述弓形蟲ELMO蛋白的制備方法可以為本領(lǐng) 域常規(guī)的方法，如合成法或表達(dá)純化法，較佳地為原核表達(dá)純化法。所述原核表達(dá)純化方法 較佳地包括下述步驟：培養(yǎng)含有所述弓形蟲ELMO基因的原核表達(dá)載體的原核表達(dá)菌株，破 碎細(xì)胞，從裂解液中提取所述弓形蟲ELMO蛋白。所述原核表達(dá)的菌株可以為本領(lǐng)域常規(guī)的 表達(dá)菌株，較佳地為大腸桿菌表達(dá)菌株，更佳地為大腸桿菌BL21菌株。所述原核表達(dá)的載 體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的表達(dá)載體，較佳地為pET系列表達(dá)載體，最佳地為pET28a載體。所 述提取方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為層析法，更佳地為親和層析法，最佳地為鎳離子-6 組氨酸親和層析法。
[0008] 本發(fā)明中，所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指的抗體，如單克隆 抗體或多克隆抗體。所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方 法，較佳地包括下述步驟：將所述弓形蟲ELMO蛋白免疫動(dòng)物后制得所述抗體，更佳地包括： 將所述弓形蟲ELMO蛋白免疫動(dòng)物，二次免疫后采集血液分離含有所述抗體的血清。所述動(dòng) 物可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用到的動(dòng)物，較佳地為兔或小鼠，更佳地為小鼠。所述免疫注射可以 為本領(lǐng)域常規(guī)的注射方式，如直接將所述弓形蟲ELMO蛋白注射到動(dòng)物體內(nèi)，較佳地為將所 述弓形蟲ELMO蛋白與弗氏佐劑一起注射到所述動(dòng)物體內(nèi)。所述二次免疫的間隔時(shí)間較佳 地為2周，所述采集血液較佳地為從所述動(dòng)物的尾靜脈采集。
[0009] 本發(fā)明中，所述反應(yīng)可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指，較佳地包括下述步驟：（1)將所述弓 形蟲ELMO蛋白或所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體包被于基質(zhì)上；（2)向步驟（1)中包被有所 述弓形蟲ELMO蛋白或所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體的基質(zhì)上加入待檢測(cè)樣本，使其與所述 弓形蟲ELMO蛋白或所述弓形蟲ELMO蛋白的抗體發(fā)生反應(yīng)。
[0010] 本發(fā)明中，較佳地還可以包括步驟（3):檢測(cè)步驟（2)所述反應(yīng)的結(jié)果。所述檢測(cè) 可以為本領(lǐng)域常規(guī)的檢測(cè)方法，較佳地為檢測(cè)抗原與抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法，例如當(dāng)基質(zhì)上 包被的為ELMO蛋白時(shí)，在步驟（2)過(guò)后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP)標(biāo)記的抗IgG的抗體后 孵育、顯色并測(cè)定化學(xué)發(fā)光值；當(dāng)基質(zhì)上包被的是所述檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體時(shí)，在步 驟（2)后加入與所述檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體異源的ELMO抗體，孵育后再加入辣根過(guò)氧 化物酶（HRP)標(biāo)記的抗IgG的抗體后再孵育、顯色并測(cè)定化學(xué)發(fā)光值。
[0011] 本發(fā)明技術(shù)方案之二：一種檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體，其是通過(guò)包括如下步驟 的制備方法所制得的：將弓形蟲ELMO蛋白免疫動(dòng)物后制得所述抗體。
[0012] 本發(fā)明中，所述檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體可以為本領(lǐng)域常規(guī)所指的抗體，如單 克隆抗體或多克隆抗體。所述檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的 制備方法，較佳地包括下述步驟：將前述弓形蟲ELMO蛋白免疫注射動(dòng)物，二次免疫后采集 血液分離含有所述抗體的血清。所述動(dòng)物可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用到的動(dòng)物，較佳地為兔或 小鼠，更佳地為小鼠。所述免疫注射可以為本領(lǐng)域常規(guī)的注射方式，如直接將所述弓形蟲 ELMO蛋白注射到動(dòng)物體內(nèi)，較佳地為將所述ELMO蛋白與弗氏佐劑一起注射到動(dòng)物體內(nèi)。所 述二次免疫的間隔時(shí)間較佳地為2周，所述采集血液較佳地為從動(dòng)物的尾靜脈采集血液。
[0013] 本發(fā)明技術(shù)方案之三：一種檢測(cè)弓形蟲急性感染的試劑盒，其包括前述ELMO蛋白 和/或前述檢測(cè)弓形蟲急性感染的抗體。
[0014] 本發(fā)明中，所述檢測(cè)弓形蟲急性感染的試劑盒較佳地還可以包括免疫反應(yīng)封閉 液、免疫反應(yīng)洗絳液、免疫反應(yīng)終止液和偶聯(lián)有顯色反應(yīng)酶的抗IgG的抗體。
[0015] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0016] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0017] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明所提供的一種檢測(cè)弓形蟲急性感染的靶標(biāo) 蛋白及其抗體，以及一種利用所述靶標(biāo)蛋白及其抗體的檢測(cè)弓形蟲急性感染的方法能夠有 效、快速地檢測(cè)弓形蟲早期急性感染，并具有較高的特異性和靈敏度。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1、不同物種ELMO氨基酸序列的進(jìn)化樹分析表明。
[0019] 圖2、弓形蟲ELMO基因的RT-PCR結(jié)果。
[0020] 圖3、弓形蟲ELMO蛋白His?Bind柱純化結(jié)果。1 :流穿液；2 :漂洗液；3和4 :洗 脫液。
[0021] 圖4、弓形蟲ELMO蛋白的組織定位。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注 明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所述 的"室溫"是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。
[0023] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑的來(lái)源如下：
[0024] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與微生物：昆明小鼠和BALB/c小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司； 比格犬購(gòu)自上海新閃試驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)；弓形蟲RH株購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；大 腸桿菌BL21(DE3)和大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
[0025] 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑：Vero細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生化與細(xì)胞研宄所；DMEM、胰酶購(gòu) 自Gibco公司；BSA、弗氏佐劑購(gòu)自Sigma公司；復(fù)合型蛋白酶抑制劑購(gòu)自Merck公司； NormalMouseIgG、ProteinA瓊脂糖微球、DAPI購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Alexa Fluor488標(biāo)記的驢抗鼠IgG購(gòu)自Jackson公司；HisBandResin試劑盒購(gòu)自默克公司； BCA蛋白定量試劑盒和二硫蘇糖醇（DTT)購(gòu)自Bio-Rad公司；總RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自 ThermoScientific公司；pMD19T質(zhì)粒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；pET28a質(zhì)粒購(gòu) 自Novagen公司；氨芐青霉素和卡那霉素購(gòu)自生工生物工程股份有限公司；3, 3'，5, 5' -四 甲基聯(lián)苯胺、多聚甲醛和Triton-X100購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物由蘇州金唯 智生物技術(shù)有限公司合成；DNA測(cè)序由寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行。
[0026] 實(shí)驗(yàn)儀器：色譜柱RP-C18購(gòu)自ColumnTechnologyInc.;色譜儀 Zorbax300SB_C18peptidetraps購(gòu)自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；QExactive 質(zhì)譜儀購(gòu)自ThermoFisherScientific;激光共聚焦顯微鏡NikoneclipseCl_Si購(gòu)自尼 康（Nikon)公司。
[0027] 實(shí)施例1獲得弓形蟲ESA抗原并制備多抗
[0028] 1、ESA的制備
[0029]