即 固定液中。作為固定液，可合適地使用福爾馬林，進一步優(yōu)選使用中性緩沖福爾馬林。根據(jù) 組織標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性或物性適當(dāng)?shù)剡x擇中性緩沖福爾馬林的濃度。濃度可在1~50%、優(yōu) 選5~25%、進一步優(yōu)選10~15%之間適當(dāng)?shù)刈兏褂?。使用真空累對浸潰過組織標(biāo)準(zhǔn) 樣品的固定液適當(dāng)?shù)剡M行脫氣。在常壓及室溫的條件下，將組織標(biāo)本在固定液中放置數(shù)小 時，由此實施固定。關(guān)于固定所需的時間，可在1小時~7日、優(yōu)選2小時~3日、還優(yōu)選3 小時~24小時、進一步優(yōu)選4小時~16小時的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇。進行固定之后，在磯酸 緩沖液等中再適當(dāng)浸潰數(shù)小時（該時間可在2小時~48小時、優(yōu)選3小時~24小時、進一 步優(yōu)選4小時~16小時的范圍內(nèi)適當(dāng)選擇）。 接下來，可采用冰凍切片法或石蠟切片法，從實施固定后的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品合適地制作 切片。作為冰凍切片法的優(yōu)選例子，可舉出下述方法；將組織投入0CT冰凍切片包埋劑 (0.C.T.compound) (Miles.Inc)中使其冰凍，使用低溫恒溫器（C巧ostat，制作冰凍切片的 裝置）將冰凍的組織切成薄片。在石蠟切片法中，將實施固定后的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品浸潰在包 埋劑中，使其凝固，由此賦予均勻且適當(dāng)?shù)挠捕取Ｗ鳛榘駝珊线m地使用石蠟。使用己醇 對實施固定后的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行脫水。具體而言，將組織標(biāo)準(zhǔn)樣品依次浸潰在70%己醇、 80%己醇、100%己醇中，由此對該組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行脫水。關(guān)于浸潰所需的時間及次數(shù)，可 在1小時~數(shù)日及1次~3次的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇。此外，雖然可W在室溫或4°C下進行 浸潰，但在4°C下進行浸潰時，浸潰時間越長越優(yōu)選（如，徹夜等）。然后，將該液相置換為 二甲苯后，利用石蠟包埋組織標(biāo)準(zhǔn)樣品。關(guān)于將該液相置換為二甲苯所需要的時間，可在1 小時~數(shù)小時的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇。該情況下，可在室溫下進行置換，也可在4°C下進行置 換，但在4°C下進行置換時，置換的時間越長越優(yōu)選（如，徹夜等）。關(guān)于石蠟包埋所需的時 間及次數(shù)，可在1小時~數(shù)小時及1次~4次的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡x擇。該情況下，可在室溫下 進行包埋，也可在4°C下進行包埋，但在4°C下進行包埋時，包埋的時間越長越優(yōu)選（如，徹 夜等）。此外，可使用將石蠟包埋反應(yīng)自動化處理的石蠟包埋裝置巧G1160、Leica等）來 合適地對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行石蠟包埋。 將如上所述進行了石蠟包埋的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品粘接在臺架上，由此制作"塊化lock)"，利 用薄片切片機（microtome)將該塊薄薄地切成選自1~20ym的厚度中的所期望的厚度。 將切薄片而得的組織切片靜置在作為透過性支承體的載玻片上，由此進行粘著。該情況下， 為防止組織切片的剝離，也可合適地使用向載玻片上涂布0. 01 %聚-k賴氨酸（Sigma)并 進行干燥而得的載玻片。對被粘著的組織切片進行適當(dāng)?shù)臅r間（選自數(shù)分~1小時之間） 的風(fēng)干。 杭原修復(fù) 在優(yōu)選方式中，對因福爾馬林固定而導(dǎo)致與抗體的反應(yīng)性減弱了的抗原的反應(yīng)性進行 修復(fù)。本發(fā)明中，可W適用蛋白酶誘導(dǎo)的抗原修復(fù)法（PIER法），也可W適用熱誘導(dǎo)的抗原 修復(fù)法化I邸法）。此外，在一種非限定性的實施方式中，對如下所述制備的"可同等看待 的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品"中的一個標(biāo)準(zhǔn)樣品適用PIER法，對另一個標(biāo)準(zhǔn)樣品適用HIER法，將 與抗體反應(yīng)時的、兩者之間的染色程度的差異數(shù)值化也是可W的。 在一種非限定性的實施方式中，準(zhǔn)備一組下述的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品，所述組織標(biāo)準(zhǔn)樣 品是如"生物學(xué)試樣"項所述進行制備的，且被安裝在透過性支承體上。該組織標(biāo)準(zhǔn)樣品優(yōu) 選為組織上可同等看待的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品。所謂"可同等看待"，是指相比較的兩個組織 標(biāo)準(zhǔn)樣品是由該組織標(biāo)準(zhǔn)樣品所來自的受試體標(biāo)準(zhǔn)樣品中的幾乎相同的細胞或組織構(gòu)成 的。例如、作為相鄰的切片而制備的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品是可同等看待的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品。 本發(fā)明中，只要沒有特別地另作記載，則"可同等看待的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品"是指作為相鄰 的切片而制備的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品，但除此W外，即使不是作為相鄰的切片而制備的，若構(gòu) 成兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品的細胞或組織的構(gòu)成在該兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品之間可同等看待，則也相 當(dāng)于"可同等看待的兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品"。作為細胞或組織的構(gòu)成在該兩個組織標(biāo)準(zhǔn)樣品之 間可同等看待的情況，例如可合適地示例下述情況；（1)在組織切片中的平面座標(biāo)上的同 一位置上存在來自同一細胞的細胞的切片的情況；(2)該細胞的切片在該平面座標(biāo)上的同 一位置上的存在比例至少為50%W上、優(yōu)選為60%W上、還優(yōu)選為70%W上、進一步優(yōu)選 為80%W上、更優(yōu)選為90%W上、特別優(yōu)選為95%W上的情況等。 關(guān)于熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)法，可適當(dāng)?shù)夭捎美梦⒉ǖ募訜岱椒?、利用高壓蓋的加熱 方法、或利用煮沸處理的加熱方法等。W780W的功率將液溫保持在約98°C進行煮沸處 理時，處理等修復(fù)所需要的時間可在5分鐘~60分鐘之間適當(dāng)?shù)剡x擇，例如10分鐘。 關(guān)于抗原的修復(fù)處理，除了可W在lOmM巧樣酸鋼緩沖液中進行W外，也可W在市售的 TargetRetrievalSolution(Dako切tomation)等中進行。在下述實施例中，使用Target RetrievalSolution。只要修復(fù)處理的結(jié)果使得識別抗GPC3抗體的抗原中的表位獲得與 抗體的結(jié)合性，能夠進行下文所述的抗原與抗體的復(fù)合體的檢測，則可合適地使用任意緩 沖液、水溶液。 對于蛋白酶誘導(dǎo)的抗原修復(fù)法中使用的蛋白酶的種類、來源，沒有特別限定，可適當(dāng) 選擇使用通?？色@得的蛋白酶。作為可使用的蛋白酶的例子，可優(yōu)選舉出0.01N鹽酸中的 0. 05%濃度的胃蛋白酶、或抑7. 6的Tris緩沖液中還含有0. 01 %濃度的化化的0. 1 %濃 度的膜蛋白酶、含有l(wèi)OmM的抓TA及0. 5%的SDS的抑7. 8的lOmMTris鹽酸緩沖液中的 1~50yg/ml濃度的蛋白酶K等。此外，使用蛋白酶K時，其反應(yīng)液的pH可在6. 5~9. 5之 間適當(dāng)?shù)剡x擇，也可適當(dāng)?shù)乩锰鹪噭?、膜蛋白酶抑制劑、膜凝乳蛋白酶（chymotrypsin) 抑制劑。Histofine肥R2試劑盒（MONO)(NichireiBiosciences)中附帶的蛋白酶也可作 為上述那樣合適的蛋白酶的具體例子舉出。蛋白酶抗原修復(fù)通常于37°C進行，但反應(yīng)溫度 可在25°C~50°C的范圍內(nèi)適當(dāng)?shù)剡M行變更。于37°C進行蛋白酶抗原修復(fù)時，反應(yīng)時間可在 例如1分鐘~5小時之間適當(dāng)?shù)剡x擇，例如，為15分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、2小時、3 小時、4小時等。修復(fù)處理結(jié)束后，利用清洗用緩沖液對實施過該處理的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行 清洗。清洗用緩沖液可合適地使用PBS(化OS地atebuffersaline,磯酸鹽緩沖液），除此 W外，也可W合適地使用Tris鹽酸緩沖液。通常，作為清洗條件，采用于室溫實施3次5分 鐘的清洗的方法，但清洗的時間及溫度可適當(dāng)變更。 紀(jì)織梳準(zhǔn)樣品與杭GPC3杭體的巧麻 對于實施過利用熱誘導(dǎo)的抗原修復(fù)法的抗原修復(fù)處理的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品和/或?qū)嵤┻^ 利用蛋白酶誘導(dǎo)的抗原修復(fù)法的抗原修復(fù)處理的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品，將下文所述的抗GPC3抗 體作為一級抗體進行反應(yīng)。該反應(yīng)在對抗GPC3抗體識別抗原中的表位而形成抗原抗體復(fù) 合體而言為適當(dāng)?shù)臈l件下實施。通常，該反應(yīng)于4°C徹夜實施，或者于37°C實施1小時，反 應(yīng)條件可在對抗體識別抗原中的表位而形成抗原抗體復(fù)合體而言為適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)適當(dāng)?shù)?進行變更。例如，反應(yīng)溫度可在4°C~50°C的范圍內(nèi)進行變更，反應(yīng)時間可在1分鐘~7日 之間進行變更。實施低溫下的反應(yīng)時，優(yōu)選使其長時間反應(yīng)。一級抗體反應(yīng)結(jié)束后，利用清 洗用緩沖液對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行清洗。清洗用緩沖液可合適地使用PBS(磯酸鹽緩沖液）， 除此W外，也可W合適地使用Tris鹽酸緩沖液。通常，作為清洗條件，采用于室溫實施3次 5分鐘的清洗的方法，但清洗的時間及溫度可適當(dāng)變更。 然后，對于實施過一級抗體反應(yīng)的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品，使其與可識別一級抗體的二級 抗體進行反應(yīng)。通常，可使用利用標(biāo)記物質(zhì)（其用于將二級抗體可視化）預(yù)先標(biāo)記過 的二級抗體。作為標(biāo)記物質(zhì)，可優(yōu)選舉出FITC(異硫氯酸巧光素）、切2 (Amersham)、 Alexa488(MolecularProbe)等巧光染料，辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等的酶，或膠體金 等。 關(guān)于與二級抗體的反應(yīng)，在對抗GPC3抗體與可識別該抗GPC3抗體的二級抗體形成抗 原抗體復(fù)合體而言為適當(dāng)?shù)臈l件下實施。通常，該反應(yīng)于室溫或37°C實施30分鐘至1小 時，但可在對抗GPC3抗體與二級抗體形成抗原抗體復(fù)合體而言為適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)適當(dāng)?shù)剡M 行變更。例如，反應(yīng)溫度可在4°C~50°C的范圍內(nèi)進行變更，反應(yīng)時間可在1分鐘~7日之 間進行變更。實施低溫下的反應(yīng)時，優(yōu)選使其長時間反應(yīng)。二級抗體反應(yīng)結(jié)束后，利用清洗 用緩沖液對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行清洗。清洗用緩沖液可合適地使用PBS(磯酸鹽緩沖液），除 此W外，也可化合適地使用Tris鹽酸緩沖液。通常，作為清洗條件，采用于室溫實施3次5 分鐘的清洗的方法，但清洗的時間及溫度可適當(dāng)變更。 接下來，對于實施過二級抗體反應(yīng)的組織標(biāo)準(zhǔn)樣品，使其與將標(biāo)記物質(zhì)可視化的物 質(zhì)進行反應(yīng)。使用辣根過氧化物酶作為二級抗體的標(biāo)記物質(zhì)時，在馬上要進行解育前將 0. 02%過氧化氨水溶液與用抑7. 2的0. 1MTris鹽酸緩沖液調(diào)整為0. 1 %濃度的DAB(二 氨基聯(lián)苯胺）溶液等量混合，由此得到反應(yīng)液，在該反應(yīng)液中對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行解育。除 DABW外，也可適當(dāng)?shù)剡x擇DAB-Ni、AEC+(W上，DAK0)等顯色基質(zhì)。在解育的過程中，時 而在顯微鏡下觀察顯色的程度，在確認到了適當(dāng)?shù)娘@色的階段將組織標(biāo)準(zhǔn)樣品浸潰在PBS 中，由此停止可視化反應(yīng)。 使用堿性磯酸酶作為二級抗體的標(biāo)記物質(zhì)時，在BCIP(5-漠-4-氯-3-嘲噪基磯酸 醋）/NBT(氮藍四挫，nitrobluetetrazolium)狂ymed)基質(zhì)溶液（向含有l(wèi)OmM濃度的 MgCls及28mM濃度的化C1的抑9. 8的50mM碳酸鋼緩沖液中，溶解0. 4mM濃度的NBT及 0.38mM濃度的BCIP而得的溶液）中對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行解育。此外，除BCIP及NBTW外， 也可W適當(dāng)?shù)厥褂糜拦碳t（PermanentRed)、快紅（FastRed)或品紅+(化油3；[]1+) (W上， DAKO)等。在進行解育之前，也可W在室溫下與含有ImM濃度的鹽酸左旋咪挫（levamisole hy化ochloride)OJacalaiTesque)(其為內(nèi)源性堿性磯酸酶的抑制劑）、0. 1M氯化鋼及 50mM氯化儀的0. 1MTris-鹽酸緩沖液（pH9. 5)預(yù)解育1分鐘~數(shù)小時。在解育的過程 中，時而在顯微鏡下進行觀察，在觀察到作為反應(yīng)最終產(chǎn)物的紫色的甲臓（formazan)的沈 著的階段，對組織標(biāo)準(zhǔn)樣品進行水洗，或者在利用含有2%聚己締醇的TBS使反應(yīng)停止后使 用TBST(含有0. 1 %的吐溫20的TB巧進行清洗。使用膠體金作為二級抗體的標(biāo)記時，通過 銀敏化使金屬銀附著于金粒子，由此使膠體金可視化。銀敏化的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而旨是已知的。 使用。11'"異硫氯酸巧光素）、切2(4111日'3113111)、41日義3488(1〇1日州13'?1'〇6日）等巧光染 料作為二級抗體的標(biāo)記物質(zhì)時，不需要可視化物質(zhì)的反應(yīng)工序，可通過照射該巧光物質(zhì)的 激發(fā)波長的光，使用巧光顯微鏡適當(dāng)?shù)貦z測所發(fā)出的光。 紀(jì)織免巧染傳評分 在本發(fā)明的一種非限定性的實施方式中，還提供下述方法，所述方法為：根據(jù)游離GPC3濃度、W及利用上述方法檢測到的組織中的GPC3的表達量，確定GPC3祀向治療劑療 法有效，或者確定是否繼續(xù)實施該GPC3祀向治療劑療法。在一種非限定性的實施方式中， 利用例如下文示例的非限定性的方法將利用上述方法檢測到的組織中的GPC3的表達數(shù)值 化。本發(fā)明中，將如上所述進行了數(shù)值化的組織中的GPC3的表達量稱為"GPC3的組織免疫 染色評分"。 按照W02009116659中記載的方法，將按表1所示的基準(zhǔn)算出的、陽性細胞率（Positive cellrate;PR)、細胞質(zhì)或細胞膜中的染色強度（Stainingintensityofc}ftoplasm; SI-cp,Stainingintensityofcellmembrane;SI-cm)及細胞膜染色模式（Staining patternofcellmembrane;Sp-cm)的各自的評分基于式1及式2的計算式加和而得的評 分，示例為本發(fā)明的非限定性的GPC3的組織免疫染色評分（方便起見，稱為"復(fù)合評價分數(shù) 1")。
[表 1-1]
【主權(quán)項】
1. 確定GPC3靶向治療劑療法對患者的癌癥的有效性、或確定是否繼續(xù)對患者實施 GPC3靶向治療劑療法的方法，所述方法包括監(jiān)測從接受GPC3靶向治療劑療法之前的患者 和/或接受過GPC3靶向治療劑療法的患者分離的生物學(xué)試樣中的游離GPC3濃度，所述方 法中，該游離GPC3濃度為規(guī)定的值時，確定為該GPC3靶向治療劑療法是有效的，或者確定 為繼續(xù)實施該GPC3靶向治療劑療法。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述游離GPC3濃度是從患者分離的全血試樣、血漿 試樣或血清試樣中的濃度。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述從患者分離的生物學(xué)試樣中的所述游離GPC3 濃度是血漿試樣或血清試樣中的濃度。
4. 如權(quán)利要求1~3中任一項所述的方法，其中，所述游離GPC3的規(guī)定值為0.1 ng/ mL~lOOng/mL的范圍。
5. 如權(quán)利要求1~4中任一項所述的方法，其中，所述游離GPC3濃度采用免疫學(xué)方法 進行測定。
6. 如權(quán)利要求1~5中任一項所述的方法，其中，所述游離GPC3濃度與在開始GPC3靶 向治療劑療法之前從該患者分離的