的熒光成像方法
【專利說明】一種活細(xì)胞中稀土離子La3+、Lu3+的熒光成像方法 技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說是利用杯芳烴熒光探針用于活細(xì)胞中稀土離子 La3+、Lu3+的熒光成像方法。 【背景技術(shù)】
[0002] 稀土在我國儲量占世界首位，已大量用于農(nóng)作物增產(chǎn)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)微量添加 劑、工業(yè)生產(chǎn)、生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。稀土微肥具有對農(nóng)作物的增產(chǎn)作用，在我國得到廣泛的應(yīng) 用。隨著稀土在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域的大量使用，稀土離子不可避免地會隨食物鏈進(jìn)人 到人體，因此稀土離子與生物體的相互作用也日益受到人們的關(guān)注。由于生物體系的復(fù)雜 性，稀土離子與它們相互作用的過程也是相當(dāng)復(fù)雜的，作用機(jī)理也不甚清楚，有關(guān)稀土進(jìn)人 生物體內(nèi)是否有毒仍然存在爭議。有文獻(xiàn)報(bào)道，稀土離子可以和生物體內(nèi)的一些酶系相互 作用，影響它們的活性和生物體的代謝過程。稀土元素在生物學(xué)方面的效應(yīng)及機(jī)理研宄指 出，稀土可促進(jìn)種子萌發(fā)和根系生長，增進(jìn)座花座果率，提高作物硝酸還原酶，固氮酶，淀粉 酶，蛋白酶，脂肪酶，過氧化物酶和酯酶等活性及土壤酶的活性，促進(jìn)作物新陳代謝。施用稀 土能改善和增強(qiáng)光合器官的結(jié)構(gòu)，功能和活性，大大加強(qiáng)了光合產(chǎn)物的產(chǎn)出和向結(jié)實(shí)器官 的轉(zhuǎn)運(yùn)。稀土可使蛋白質(zhì)，氨基酸，維生素，油料作物的含油量，抗逆性和糖酸比增加。可 使植物吸收波長更短的輻射能，為光合提供更多的能量。自由基和超氧化物歧化酶的平衡 在生物代謝中具有重要的作用。微量鈰離子可清除大量氧自由基；稀土氨基酸配合物和稀 土其他形式的配合物均具有抑菌或殺菌的作用；稀土離子及其含氮大環(huán)配合物有催化斷裂 的作用，在醫(yī)學(xué)和遺傳工程上有重要意義；高濃度稀土和腺苷三磷酸配合物分子中原子的 活性標(biāo)度變化使得該配合物對激酶類有強(qiáng)的抑制作用而影響代謝過程。然而，在細(xì)胞內(nèi)發(fā) 生上述作用的前提是稀土離子能透過細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞，因此，關(guān)于稀土離子能否進(jìn)入動(dòng) 植物細(xì)胞的研宄必然成為稀土生物效應(yīng)研宄的重點(diǎn)。細(xì)胞信使物質(zhì)一般認(rèn)為包括胞內(nèi)游離 Ca2+、肌醇三磷酸、二酰甘油、環(huán)腺苷酸和環(huán)脲苷酸等。細(xì)胞在受到稀土離子作用時(shí)胞內(nèi)信 使物質(zhì)必定會發(fā)生變化。鈣調(diào)蛋白是廣泛存在于真核細(xì)胞中的一種多功能的調(diào)節(jié)因子，它 通過生物體內(nèi)的鈣離子介導(dǎo)參與許多的細(xì)胞代謝調(diào)控過程，在細(xì)胞代謝過程中發(fā)揮著重要 的作用，調(diào)節(jié)著近三十余種酶的活性，調(diào)節(jié)更為廣泛的生理功能及基因表達(dá)。存在于生物體 內(nèi)的鈣調(diào)素與Ca 2+的結(jié)合并不專一，許多二價(jià)與三價(jià)的金屬離子如稀土離子由于離子半徑 /電荷性質(zhì)及配位化學(xué)性質(zhì)等方面與Ca 2+有相似之處，能夠在一定程度上取代Ca 2+，在鈣調(diào) 素中與Ca2+產(chǎn)生競爭結(jié)合并發(fā)揮一定的作用。紅細(xì)胞是人體中最簡單也最有代表性的膜系 統(tǒng)，稀土能否通過紅細(xì)胞膜意義重大，但至今有關(guān)這方面的研宄仍無定論。大多數(shù)的研宄者 認(rèn)為稀土離子不能進(jìn)入人紅細(xì)胞，只是在膜表面起作用。倪嘉纘研宄組利用ICP-MS及NMR 技術(shù)研宄了稀土離子和兔紅細(xì)胞的作用，得出稀土離子不能進(jìn)入紅細(xì)胞的結(jié)論；但王夔研 宄組應(yīng)用激光掃描法研宄指出，稀土離子能進(jìn)入紅細(xì)胞，其跨膜與稀土離子在膜上的打洞 作用有關(guān)。熒光指示劑法對稀土離子跨紅細(xì)胞膜的研宄，能檢測不同濃度稀土離子的跨膜 行為，以及稀土離子對鈣內(nèi)流的作用。
[0003] 活細(xì)胞成像技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域重要的研宄手段，可以解釋活細(xì)胞中的多種生命 和生理現(xiàn)象。隨著生命科學(xué)的發(fā)展，對細(xì)胞內(nèi)的活性物種、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等方面 的信息研宄越來越深入。熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種高靈敏的可 視化分析技術(shù)。目前用于活細(xì)胞成像分析的熒光探針多為有機(jī)小分子熒光染料，在實(shí)際應(yīng) 用中，這些有機(jī)熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易猝滅、生物相容性及穩(wěn)定性差的缺 點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)長時(shí)間、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)連續(xù)測定，提高可視化分析的選擇性和精確度是迫切需要解決 的問題。
[0004] 近年來，隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們對細(xì)胞內(nèi)的活性物種、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及細(xì) 胞凋亡等方面的研宄越來越深入。熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種有效 的可視化分析技術(shù)。稀土配合物熒光探針由于具有熒光壽命長、發(fā)射峰窄和Stokes位移大 等發(fā)光性質(zhì)，引起了人們的重視與關(guān)注。目前稀土配合物熒光探針由于其優(yōu)越的光學(xué)特性 已被應(yīng)用到生命科學(xué)研宄的各個(gè)領(lǐng)域，包括熒光免疫分析、酶活性測定、核酸測定等。近年 來，隨著新型的水溶性稀土配合物不斷的被合成出來，稀土配合物熒光探針得到了更廣泛 的應(yīng)用，尤其在熒光成像方面越來越顯示出它的優(yōu)越性。稀土配合物獨(dú)特的發(fā)光特點(diǎn)與先 進(jìn)的光學(xué)成像技術(shù)相結(jié)合，為實(shí)時(shí)在線動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)的分子提供了有力的實(shí)驗(yàn)手段，為 揭示細(xì)胞內(nèi)小分子物種與生物大分子的生理功能與人類疾病的關(guān)系提供了新技術(shù)與新方 法，結(jié)果將有力的促進(jìn)生命科學(xué)的發(fā)展。設(shè)計(jì)新型的稀土熒光探針，提高其水溶性、膜穿透 性、選擇性以及長激發(fā)波應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)活性小分子物種檢測；研宄探針穿膜機(jī)理及在細(xì)胞 內(nèi)的分布情況，為探針的設(shè)計(jì)提供理論支持；利用時(shí)間分辨等熒光顯微成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞 內(nèi)分子事件的實(shí)時(shí)觀測和動(dòng)態(tài)研宄，對細(xì)胞生物學(xué)、組織學(xué)以及光子學(xué)成像研宄有重要影 響。
[0005] 杯芳烴是一類新型大環(huán)化合物，以經(jīng)典杯芳烴為先導(dǎo)已發(fā)展出氧雜杯芳烴、硫雜 杯芳烴等新型化合物。以杯芳烴為分子平臺，研制出各種熒光探針化合物。杯芳烴化合物 已應(yīng)用于很多領(lǐng)域，包括陰/陽離子配合物的傳感、污染修復(fù)和催化等。杯芳烴應(yīng)用在生物 體系，包括可用于模擬離子通道、模擬酶、蛋白質(zhì)表面識別，用于核磁共振成像試劑平臺、給 藥系統(tǒng)、固體脂質(zhì)納米粒子和抗菌劑等。杯[4]芳烴衍生物在限制細(xì)胞活性、致免疫性和毒 性等方面已有研宄。然而，在細(xì)胞攝取及細(xì)胞命運(yùn)過程中沒有相關(guān)報(bào)道。通過杯[4]芳烴 熒光衍生物探針可方便地用于研宄攝取和定位細(xì)胞器，為研宄和開發(fā)杯[4]芳烴藥物和藥 物傳輸系統(tǒng)提供有用的信息。
[0006] 目前報(bào)道的杯芳烴熒光探針文獻(xiàn)不超過百篇，能應(yīng)用于細(xì)胞中分子/離子熒光成 像為數(shù)甚少。Anja Mueller等在2011年報(bào)道了利用一種陽離子熒光標(biāo)記的杯[4]芳烴，用 于細(xì)胞中溶酶體成像；Rakesh K. Pathak等在2012年報(bào)道了一種含亞氨基的三唑基-杯 [4]芳烴結(jié)構(gòu)的Zn2+熒光探針，利用探針-Zn 2+配合物實(shí)現(xiàn)對活性HeLa細(xì)胞中組氨酸和半 胱氨酸的熒光成像。同年他們還報(bào)道了利用該杯芳烴-Cd 2+配合物用于細(xì)胞中半胱氨酸的 焚光成像，但都是基于焚光猝滅成像；Rakesh Kumar Pathak等于2013年報(bào)道了的雙喹啉 修飾的硫雜杯[4]芳烴熒光探針，應(yīng)用