糖尿病患者認知障礙的血清學標志物-GSK3β的檢測方法
【技術領域】
[0001]發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及糖尿病患者認知障礙的新型血清學標志物-GSK3 0的檢測方法。
【背景技術】
[0002]2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease, AD)都是與衰老相關的疾病，最近研宄顯示，T2DM可以明顯增加AD發(fā)生的風險，有學者還將AD稱為“3型糖尿病”。T2DM的特征性表現(xiàn)為胰島素抵抗、胰島素分泌障礙和葡萄糖產(chǎn)生增加，而大腦中胰島素及血糖水平異常是導致AD形成的重要原因。AD典型的病理學特征是大量神經(jīng)元內(nèi)形成以過度磷酸化的微管相關蛋白tau為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)及由β -淀粉樣多肽沉積與神經(jīng)元外形成的大量老年斑，最典型的臨床表現(xiàn)是患者記憶力的進行性下降。
[0003]AD是一個連續(xù)的病理生理過程，包括輕度認知障礙前期(pre-MCI)、輕度認知障礙期(mild cognitive impairment,MCI)和癡呆期。AD在癡呆期時病程不可逆轉(zhuǎn)，目前臨床藥物治療效果甚微。因此，篩選并發(fā)現(xiàn)新的敏感和特異的pre-MCI和MCI生物標志物尤其是早期標志物成為AD早期診治的關鍵。
[0004]目前應用較多的是腦脊液中的生物學標志物，其敏感性及特異性較高；血液中的標志物雖然應用較少，但其無創(chuàng)性、快速及價格經(jīng)濟等易被人們廣泛接受，給AD的診斷提供了新的思路。已有文獻報道AD患者血液中存在載脂蛋白E、血小板APP異構(gòu)體比值、高半胱氨酸、miRNA、白細胞介素、血紅素氧合酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等變化，但其特異性和敏感性并不令人滿意，僅能作為輔助診斷指標使用。GSK-30作為一種蛋白激酶，參與多種細胞內(nèi)信號傳導通路，是很多細胞功能的重要調(diào)節(jié)因子。GSK-3 0不僅是胰島素受體偶聯(lián)信號系統(tǒng)的重要組成成份，而且與很多疾病尤其是AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病密切相關。糖尿病發(fā)病過程中GSK-3活性明顯升高，GSK-3也參與tau蛋白過度磷酸化和β淀粉樣蛋白產(chǎn)生，GSK-3 β是T2DM與AD之間共同的激酶，可能在DM并發(fā)AD樣病變中起更重要的作用。目前動物實驗也證實，GSK-3 0的過度活化與tau蛋白過度磷酸化以及動物的空間記憶損傷呈顯著正相關。因此，研宄對患者血液中GSK-3 0蛋白及酶活性表達的檢測方法，可望成為AD早期診斷的血清學標志物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的任務是提供一種糖尿病患者認知障礙的血清學標志物-GSK3 0的檢測方法，所述的方法為斑點印跡(Dot-blot)和酶活性測定。Dot-blot方法是依據(jù)抗原、抗體結(jié)合反應原理，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測，可以作為蛋白質(zhì)簡單快速的定量分析。酶活性檢測方法是應用GENMED的GSK-3 0激酶活性檢測試劑盒，是一種旨在通過多肽底物，在GSK-3 α抑制劑的存在下，受到GSK-3 β磷酸化后，進而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的氧化反應，即采用光度法測定其氧化后峰值的變化，以分析細胞裂解樣品中GSK3 0活性的權威而經(jīng)典的技術方法。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術方案是:
[0007]本發(fā)明提供的檢測糖尿病患者血小板GSK-3 β活性相對定量的方法，包括以下步驟:
[0008]步驟一、血小板分離與純化:人全血5ml，60g離心力，4攝氏度離心15min，上層是血楽，中層是白細胞，下層是紅細胞。取上層血楽，60g離心力，4攝氏度離心15min，去沉淀，1500g離心15min，分為2層，上層為血清，下層為血小板；
[0009]步驟二、血小板標本用改良臺氏液洗滌，1500g離心5min3次，儲存于_80°C冰箱；
[0010]步驟三、血小板蛋白提取與濃度測定:(I)血小板加入預冷的裂解液120 μ 12XBuffer，所述的 2XBuffer 由 50mM Tris-Cl pH 8.0、I % NP-40、150mM NaCl、
0.1% SDS、0.02% NaNR3R、20%甘油、cocktail、I % PMSF 組成，在冰上靜置 20min 后，將蛋白樣品置于沸水中煮1min使其蛋白充分變性，60hz超聲15秒；(2)BCA法測定蛋白濃度；
[0011]步驟四、血小板蛋白Dot-blot測定:(I)血小板樣品配置成統(tǒng)一濃度為5ug/ul，將2ul樣品點于硝酸纖維素膜NC膜上；⑵將NC膜晾干l-2h后，置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，搖床上室溫封閉30-60min ； (3)取出NC膜，用雙蒸水沖洗干凈，加入1:1000GSK-3 β和Ser9-GSK-3i3的一抗，抗體用I % BSA的TBS稀釋，4 °C過夜，I X TBST緩沖液，所述的IXTBST 由 10mM NaCl、50mM Tris,0.5% Tween 20,pH 7.4 組成，洗 NC 膜 3 次，每次 5min ;(4)用雙蒸水清洗掉泡沫，用Licor公司標記IRDyeT 800通道1:10000的熒光二抗染料，二抗由I % BSA的TBS稀釋。室溫下封膜孵育lh，IXTBST，所述的IXTBST為10mM NaCl,50mM Tris,0.5% Tween 20、pH 7.4。緩沖液洗膜3次，每次1min ； (5)雙蒸水沖洗泡沫，5min后熒光掃描、顯色，利用自帶灰度值分析軟件，進行半定量統(tǒng)計。
[0012]本發(fā)明提供的酶活試劑盒檢測糖尿病患者血小板GSK-3 0活性的方法，包括以下步驟:
[0013]步驟1、待測樣品準備:
[0014]1.1將純化過的血小板樣品，小心加入3毫升GENMED清理液(Reagent A)，混勻，移入到預冷的10毫升試管，放進4°C臺式離心機離心5分鐘，速度為300g，小心抽去上清液；
[0015]1.2加入500微升GENMED裂解液(Reagent B)，充分混勻。轉(zhuǎn)移到預冷的1.5毫升離心管。強力渦旋震蕩15秒。置于冰槽里孵育30分鐘。放進4°C微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g。
[0016]1.3小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管。移取10微升進行蛋白定量檢測；即刻放進一 70°C保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作；
[0017]步驟2、測定準備:
[0018]2.1將血小板樣品置于冰槽里；
[0019]2.2設定好分光光度儀，設置條件為:波長為340nm，每間隔I分鐘掃描一次，共讀數(shù)6次，共5分鐘，掃描完成后置零；
[0020]2.3 GENMED緩沖液(Reagent C)室溫下均衡溫度；
[0021]步驟3、背景對照測定:
[0022]3.1移取65微升GENMED緩沖液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反應液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放進30°C培養(yǎng)箱里靜置3分鐘；
[0023]3.2加入5微升GENMED陰性液(Reagent G)，上下傾倒數(shù)次，在3秒之內(nèi)混勻，即刻放進分光光度儀檢測，此為背景空對照:340波長讀數(shù)O分鐘一 340波長讀數(shù)5分鐘；
[0024]步驟4、樣品測定:
[0025]4.1移取65微升GENMED緩沖液(Reagent C)到新的比色皿，加入10微升GENMED酶促液(Reagent D)，加入10微升GENMED反應液(Reagent E)，加入10微升GENMED底物液(Reagent F)，放進30°C培養(yǎng)箱里靜置3分鐘；
[0026]4.2加入5微升待測樣品，上下傾倒數(shù)次，在3秒之內(nèi)混勻，即刻放進分光光度儀檢測，此為樣品總活性讀數(shù):340波長讀數(shù)O分鐘-340波長讀數(shù)5分鐘；
[0027]步驟5、計算樣品活性:
[0028]按以下公式計算出血小板GSK-3 0活性:
[0029][(樣品讀數(shù)一背景讀數(shù))1X0.1X樣品稀釋倍數(shù)]+ (0.005X6.22X5)=單位濃度/毫克；
[0030]上述公式中:
[0031]樣品讀數(shù)是指加入待測樣品O分鐘和5分鐘后分光光度儀的檢測差值，樣品讀數(shù)=340波長讀數(shù)O分鐘-340波長讀數(shù)5分鐘；
[0032]背景讀數(shù)是指加入陰性液O分鐘和5分鐘后分光光度儀的檢測差值，背景讀數(shù)=340波長讀數(shù)O分鐘-340波長讀數(shù)5分鐘；
[0033]樣品稀釋倍數(shù)是指樣品反應前稀釋的倍數(shù)；
[0034]0.1,0.005,6.22、5分別是指體系容量、樣品容量、毫摩爾吸光系數(shù)、反應時間常量;
[0035]單位濃度定義:在30°C溫度下，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠氧化I微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位。
[0036]本發(fā)明的特點是:建立的血小板GSK-3 β蛋白及酶活性的檢測方法，操作簡單，準確快捷，并可同時檢測多個樣品。所構(gòu)建的Dot-blot方法檢測了血小板GSK-3 β蛋白及活性位點的表達，發(fā)現(xiàn)T2DM并MCI患者血小板GSK-3 β (ser9)較單純T2DM患者表達下降，活性增高，但二者GSK-30總蛋白表達無明顯差異。所應用的酶活性檢測方法，提示T2DM并MCI患者GSK-3 β酶活性要高于單純DM組，單純DM組GSK-3 β酶活性要高于非糖尿病NC組，相互之間比較有統(tǒng)計學意義。說明GSK-30活性在糖尿病認