lmg PSA抗體溶液，加入10mg/mL的2-IT溶液2~4 y L，室溫靜置30min，加 入0. lm〇L/L的甘氨酸溶液10 y L，室溫靜置5min ;用G-25凝膠柱除鹽，收集活化的PSA抗 體，于2-8°C保存?zhèn)溆茫?br>[0043] ②取1. 2mg ALP溶液，加入5mg/mL的SMCC溶液20 y L，室溫靜置30min，用G-25 凝膠柱除鹽，收集活化的ALP抗體，于2-8°C保存?zhèn)溆茫?br>[0044] ③將步驟①所得活化的PSA抗體與步驟②所得活化的ALP抗體混合，于2-8°C條件 下靜置反應(yīng)18h，通過(guò)Supperdex200凝膠純化柱進(jìn)行純化，獲得含有抗體PSA-ALP連接物 (即ALP標(biāo)記的PSA抗體）的溶液，于2-8°C保存?zhèn)溆茫?br>[0045]④將步驟③所得抗體PSA-ALP連接物的溶液用含1 %牛血清白蛋白（BSA)、10%新 生牛血清、1%酪蛋白、0. 5% Proclin300防腐劑、pH為8. 0的0.1 moL/L的Tris緩沖液稀 釋?zhuān)♂屩罰SA抗體-ALP偶聯(lián)物濃度為0. 5 y g/mL，pH為8. 0,即制得試劑2號(hào)。
[0046] 3、磁分離試劑的制備
[0047] (1)材料與儀器：
[0048] 磁微粒的懸浮液：磁微粒的質(zhì)量百分含量為5%，磁微粒含羧基活性基團(tuán)，每克磁 微粒（干重）的羧基含量為0. 8毫摩爾，磁微粒具有超順磁性，磁微粒直徑為1 ym ;
[0049] FITC抗體：羊抗FITC多克隆抗體，純度為95%以上，稀釋效價(jià)超過(guò)1:200萬(wàn)；
[0050] 2-嗎啉乙磺酸（MES)、碳二亞胺（EDC)、Tris和其他試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純。
[0051] (2)制備步驟：
[0052] ①取100mg磁微粒的懸浮液，磁分離去上清，用0? lm〇L/L pH為4. 7的MES緩沖液 10mL重懸；
[0053] ②向步驟①所得液中加入2mg的FITC抗體，室溫混懸60min ;
[0054] ③向步驟②所得液中加入0. 5mL新配制的10mg/mL的EDC水溶液，室溫混懸2h ;
[0055] ④將步驟③所得液磁分離，去上清，用含1%牛血清白蛋白（BSA)、10%新生牛血 清、1%酪蛋白、〇. 5% Proclin300防腐劑、pH為8. 0的0.1 moL/L的Tris緩沖液稀釋?zhuān)粗?得磁分離試劑。
[0056] 為充分證明本發(fā)明對(duì)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性保護(hù)效果，還依 照現(xiàn)有技術(shù)常規(guī)配制了試劑1'號(hào)，檢測(cè)其對(duì)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性的 保護(hù)效果，以與本發(fā)明進(jìn)行對(duì)照。試劑1'號(hào)的制備方法如下：
[0057] (1)制備用材料與儀器：以Tris緩沖液保存的PSA抗體，純度超過(guò)99%，濃度為 5mg/mL ;異硫氰酸熒光素（FITC)，碳酸氫鈉、Tris等試劑應(yīng)達(dá)到化學(xué)純；G-25凝膠純化柱采 購(gòu)自GE公司；
[0058] (2)制備步驟：
[0059] ①用0? 2m〇L/L pH為9. 0的碳酸鹽緩沖液配制0? 5mg/mL的FITC溶液；
[0060] ②按照PSA抗體與FITC分子比為1:10的比例在抗體溶液中加入步驟①所配制的 FITC溶液，混合均勻后，室溫下靜置反應(yīng)12h小時(shí)，得到PSA抗體-FITC偶聯(lián)物；
[0061] ③將步驟②的反應(yīng)液通過(guò)G-25凝膠柱進(jìn)行分離，去除未反應(yīng)的FITC，得到含有 PSA抗體-FITC偶聯(lián)物（即FITC標(biāo)記的PSA抗體）的溶液；
[0062] ④用含1%牛血清白蛋白（BSA)、10%新生牛血清、1%酪蛋白、0. 5% Proclin300 防腐劑、pH為8. 0的0. lm〇L/L Tris的緩沖液將步驟③所得含有PSA抗體-FITC偶聯(lián)物的 溶液稀釋為工作液，即制得試劑1'號(hào)。
[0063] 將上述分別用本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3所得穩(wěn)定劑稀釋制備的試劑 1號(hào)，以及現(xiàn)有技術(shù)中用含1 %牛血清白蛋白（BSA)、10%新生牛血清、1 %酪蛋白、0. 5% Proclin300防腐劑、pH為8. 0的0.1 moL/L的Tris緩沖液稀釋制備的試劑1'號(hào)，均分別于 37°C條件下放置6天（加速穩(wěn)定性37°C條件下6天相當(dāng)于4°C保存1年）、4°C條件下保存 6天，然后通過(guò)搭配上述試劑2號(hào)、磁分離試劑及發(fā)光底物和清洗液等其他試劑盒組分測(cè)定 校準(zhǔn)品發(fā)光值和空白限，所用檢測(cè)儀器為北京濱松公司的BHP9507型號(hào)化學(xué)發(fā)光免疫分析 儀，檢測(cè)后對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)照。在上述檢測(cè)分析中，所用發(fā)光底物為堿性磷酸酶的酶 促化學(xué)發(fā)光底物，購(gòu)自北京阿匹斯生物技術(shù)有限公司，為含0. 6mmol/L二氧雜環(huán)乙烷類(lèi)化 合物的Tris緩沖液，pH 9. 35。在上述檢測(cè)分析中，所用校準(zhǔn)品的制備方法如下：
[0064] (1)材料與儀器：磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、Proclin300試劑至少達(dá)到化學(xué)純；前 列腺特異性抗原購(gòu)自Fitzgerald公司，純度超過(guò)98% ;
[0065] (2)制備步驟：
[0066] ①量取600mL純化水于容器中，稱(chēng)取200mL新生牛血清加入容器中，充分?jǐn)嚢杌旌?均勻；
[0067] ②稱(chēng)取磷酸氫二鉀3. 4g、磷酸二氫鉀0.36g、Proclin300防腐劑0.02mL加入步驟 ①所得混合液中，充分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?br>[0068] ③用4mol/L鹽酸調(diào)步驟②所得混合液的pH為7. 0-7. 5;
[0069] ④將步驟③所得混合液后用純化水定容至1L，用0. 2um濾器過(guò)濾，得校準(zhǔn)品稀釋 液，于2-8 °C保存待用；
[0070] ⑤用步驟④所得校準(zhǔn)品稀釋液分別配制濃度為〇、〇. 5、4、15、50、100ng/mL的前列 腺特異性抗原溶液，作為校準(zhǔn)品樣本待測(cè)。
[0071] 在上述檢測(cè)分析中，所用清洗液的制備方法如下：
[0072] (1)材料與儀器：Tris、NaCl、Tween-20和TritonlOO試劑至少達(dá)到化學(xué)純；
[0073] (2)制備步驟：
[0074] ①量取80mL純化水于容器中，稱(chēng)取Tris 1.21g和NaCl 0. 85g于0. 1L容器中，充 分?jǐn)嚢柚镣耆芙猓?br>[0075] ②稱(chēng)取Tween-200?5g、TritonlOO0?5g依次加入到步驟①所得混合液中，充分 攪拌，直至完全混勻；
[0076] ③用4mol/L鹽酸調(diào)步驟②所得混合液的pH為7. 5-8. 0;
[0077] ④將步驟③所得混合液用純化水定容至0. 1L，用0. 2um濾器過(guò)濾，得到清洗液濃 縮液；
[0078] ⑤取0. 1L步驟④所得清洗液濃縮液加入1. 4L純化水進(jìn)行1:15倍稀釋后，得到清 洗液。
[0079] 應(yīng)用上述試劑進(jìn)行檢測(cè)的具體操作步驟如下：
[0080]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑，其特征在于，所述穩(wěn)定劑的原料 組分包括三羥甲基氨基甲烷、e-乳球蛋白、n，N二甲基二吖啶硝酸鹽、魚(yú)皮凝膠、多聚賴(lài)氨 酸和水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑，其特征 在于，每IL所述穩(wěn)定劑中含有的原料組分如下：三羥甲基氨基甲烷0.Olmol、0 -乳球蛋白 Ig~5g、N，N二甲基二卩丫啶硝酸鹽Img~3mg、魚(yú)皮凝膠Ig~3g、多聚賴(lài)氨酸0.1 g~lg、 余量為水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑，其特 征在于，所述穩(wěn)定劑的pH為7~9。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑，其特 征在于，所述穩(wěn)定劑的pH為8。
5. -種保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑的制備方法，將權(quán)利要求1-4 中任一項(xiàng)所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑的各原料在水中充分?jǐn)?拌至完全溶解并混合均勻，得到保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑的制備方 法，其特征在于，在室溫下，將所述穩(wěn)定劑的各原料在水中充分?jǐn)嚢柚镣耆芙獠⒒旌暇鶆?后，用4mol/L鹽酸調(diào)pH至7~9,制備完成后置于2~8°C下保存。
7. -種保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑的用途，其特征在于，將權(quán)利 要求1-4任一項(xiàng)所述保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑用于免疫分析測(cè)定。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑的用途，其 特征在于，在免疫分析測(cè)定中，將異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物用所述保護(hù)異硫氰酸 熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑稀釋。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及保護(hù)異硫氰酸熒光素與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定劑及其制備方法和用途，所述穩(wěn)定劑的原料組分包括三羥甲基氨基甲烷、β-乳球蛋白、N，N二甲基二吖啶硝酸鹽、魚(yú)皮凝膠、多聚賴(lài)氨酸和水。本發(fā)明能夠有效的保護(hù)FITC與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性，能夠使FITC與抗原抗體偶聯(lián)物工作液保存一年后活性剩余達(dá)到95％以上，相較于現(xiàn)有常規(guī)用試劑，使FITC與抗原抗體偶聯(lián)物的穩(wěn)定性得到大幅提高，顯著延長(zhǎng)了相關(guān)試劑盒的有效期，并使得試劑盒能夠長(zhǎng)期保持良好的性能參數(shù)；且制備方法簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)成本低，適于在相關(guān)免疫分析測(cè)定領(lǐng)域推廣應(yīng)用。
【IPC分類(lèi)】G01N33-68, G01N33-58
【公開(kāi)號(hào)】CN104698189
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510109304
【發(fā)明人】于大為
【申請(qǐng)人】北京中航賽維生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年3月12日