隱球菌活力檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，是一種檢測隱球菌活力方法的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]新生隱球菌是一種重要的病原真菌，可引起隱球菌腦膜炎和播散性隱球菌感染。隱球菌腦膜炎治療時間長，復(fù)發(fā)率較高。在隱球菌腦膜炎治療中困擾臨床醫(yī)生的一個最重要問題是，由于無法在治療中對隱球菌的活力做出有效判斷，從而對療程的判定缺乏客觀的時間標(biāo)準(zhǔn)(洪微，溫海，陳濱，廖萬清.隱球菌腦膜炎腦脊液真菌學(xué)指標(biāo)的比較研究[J].中華皮膚科雜志，2003，08:48.)。
[0003]根據(jù)美國感染病學(xué)會(IDSA,Infect1us Diseases Society of America)隱球菌腦膜炎治療指南，為了防治隱球菌腦膜炎復(fù)發(fā)，治療時間需要延長到I年以上才能保證隱球菌的活力被足夠抑制。非艾滋病患者隱球菌腦膜炎治療過程包括> 4周的兩性霉素B聯(lián)合氟胞嘧啶誘導(dǎo)治療，8周氟康唑鞏固治療和6-12個月的氟康唑維持治療(PerfectJR, Dismukes WE, Dromer F，et al.Clinical practice guidelines for the managementof cryptococcal disease:201update by the infect1us diseases society ofamerica.Clin Infect Dis.2010Febl; 50 (3):291-322.)。在整個治療過程中需要根據(jù)患者耐受情況和腦脊液中隱球菌活力來調(diào)整治療方案?？拐婢幘幸欢ǖ亩靖弊饔?，以兩性霉素B的腎毒性最為嚴(yán)重，通過監(jiān)測隱球菌活力早日完成誘導(dǎo)治療和縮短全部治療過程有助于改善患者生活水平和減輕患者經(jīng)濟(jì)壓力。
[0004]目前，臨床多通過腦脊液隱球菌計數(shù)、真菌培養(yǎng)和隱球菌乳膠凝集實(shí)驗(yàn)對臨床治療效果進(jìn)行監(jiān)測(陳江漢，溫海，陳孫孝，吳建華，徐紅，朱元杰，熊愛君.隱球菌性腦膜腦炎復(fù)發(fā)因素的初步分析[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，04:463-464.)。但腦脊液隱球菌計數(shù)無法對菌體活力進(jìn)行判斷，無法通過光鏡區(qū)分有活力和無活力的隱球菌。而真菌培養(yǎng)方法隨著治療時間的延長，培養(yǎng)時間也會延長，這不利于即時對療效進(jìn)行跟蹤。乳膠凝集實(shí)驗(yàn)雖可以半定量對隱球菌菌量進(jìn)行監(jiān)測，但其存在滯后性和假陰性可能，臨床有患者經(jīng)過I年正規(guī)抗真菌治療血乳膠凝集滴度仍可低水平陽性。隱球菌腦膜炎患者正規(guī)抗真菌治療后大部分可以達(dá)到腦脊液真菌培養(yǎng)陰性，但患者顱內(nèi)壓仍較高，腦脊液墨汁染色可見真菌，乳膠凝集實(shí)驗(yàn)仍為陽性，明確此時腦脊液中隱球菌活力對疾病治療策略的制定至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種隱球菌活力檢測試劑盒，本發(fā)明另一目的在于提供該試劑盒的檢測方法。
[0006]本發(fā)明的主要技術(shù)方案是，試劑盒采用兩種熒光染料分別標(biāo)記真菌菌體和真菌活力，利用該試劑盒、并借助普通流式細(xì)胞儀的輔助，可快速準(zhǔn)確分析腦脊液隱球菌數(shù)量和活力，對患者預(yù)后判斷和臨床治療方案制定具有重要指導(dǎo)意義。
[0007]本發(fā)明提供了一種隱球菌活力檢測試劑盒，該試劑盒是用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測隱球菌活力和數(shù)量，該試劑盒包括下列試劑:
[0008]檢測液A:3.5% (w/v)熒光增白劑(Calcofluor white, CFff), pH 值為 10 ；
[0009]檢測液B:l% (w/v)核酸染色劑碘化丙唳(Propidium 1dide, PI)；
[0010]稀釋液C =PBS稀釋緩沖液，pH值為7.2。
[0011]所述的試劑盒，較佳的，檢測液A:1.75mg CFW溶于0.5ml雙蒸水，NaOH調(diào)節(jié)pH至10，避光管保存；
[0012]較佳的，檢測液B:0.5mg PI溶于0.5ml雙蒸水中，避光保存；
[0013]較佳的，稀釋液C:磷酸氫二鈉2.6g，磷酸二氫鈉0.43g，氯化鈉8.18g，定容到1000ml，調(diào)節(jié) pH 至 7.2。
[0014]所述的試劑盒，最佳的，包括:1ml的檢測液A、Iml的檢測液B和50ml的稀釋液C。
[0015]本發(fā)明的試劑盒中配置了下述熒光化合物組合:核酸染色劑碘化丙啶(Propidium1dide，PI)、熒光增白劑Calcofluor white (CFff)和PBS稀釋緩沖液。PI是一種DNA結(jié)合染料，在536nm波長時被激發(fā)，產(chǎn)生617nm的紅色熒光。PI無膜通透性，不能透過活細(xì)胞膜，只能對細(xì)胞膜有破損的死亡細(xì)胞進(jìn)行染色。CFW是一種熒光增白劑，多用于油漆、油墨、涂料等的增白，同時，它也可以與真菌或植物細(xì)胞壁多糖特異性結(jié)合(如殼聚糖)。CFW在347nm波長光下可被激發(fā)出355nm藍(lán)光。
[0016]進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了一種利用上述的隱球菌活力檢測試劑盒的檢測方法，該方法包括如下步驟:
[0017]A、將含隱球菌的樣本懸液離心1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，去上清；用稀釋液C將沉淀稀釋至16個/ml，制成待測標(biāo)本；
[0018]B、將待測標(biāo)本振蕩后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測調(diào)零，調(diào)零后的標(biāo)本中加入檢測液A，上機(jī)檢測，并進(jìn)行圈門；
[0019]C、在步驟B的樣本中加入檢測液B，再次上機(jī)檢測，至少記錄10000個細(xì)胞并加以記錄和統(tǒng)計分析。
[0020]上述的步驟B中采用FLl和FL4通道檢測熒光。
[0021]上述的步驟C獲得流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，用Flowjo分析軟件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A雙參數(shù)點(diǎn)圖中進(jìn)行設(shè)門調(diào)整。
[0022]本發(fā)明采用上述試劑盒和檢測方法，應(yīng)用于隱球菌活力的檢測，可以檢測腦脊液、肺泡灌洗液等無菌體液中隱球菌的活力。
[0023]采用上述試劑盒和檢測方法，對腦脊液中隱球菌活力進(jìn)行分析的方法，包括下述步驟:
[0024]步驟一試劑制備
[0025]1.1、檢測液 A 為 3.5% (w/v) CFff (Calcofluor white)保存液:1.75mg CFff 溶于0.5ml雙蒸水，NaOH調(diào)節(jié)pH至10，避光管保存。
[0026]1.2、檢測液 B 為 1% (w/v)PI (Propidium 1dide,碘化丙卩定)保存液:0.5mgPI 溶于0.5ml雙蒸水中，避光管保存。
[0027]1.3、稀釋液C為:磷酸氫二鈉2.6g，磷酸二氫鈉0.43g，氯化鈉8.18g，定容到1000ml，調(diào)節(jié)pH至7.2，取50ml分裝。
[0028]步驟二樣本標(biāo)記與檢測
[0029]將腦脊液樣本1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清液，加入1.3中稀釋液C200 μ 1，重懸，制成待測標(biāo)本；
[0030]步驟三采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測
[0031]按照流式細(xì)胞儀的操作規(guī)程，對步驟二中制備的待測標(biāo)本進(jìn)行測試。并用Flowjo分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
[0032]3.1將重懸的待測標(biāo)本振蕩后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測，采用二維點(diǎn)圖形式進(jìn)行結(jié)果分析:先建立FSC/SSC點(diǎn)圖，排除細(xì)胞碎片，選取Rl區(qū)；
[0033]3.2在3.1的樣本中加入5 μ I檢測液Α，再次上機(jī)檢測，吸樣量為50 μ 1，F(xiàn)Ll-A/FL4-A雙通道檢測；
[0034]3.3在3.2的樣本中加入5 μ I檢測液B，再次上機(jī)檢測，獲得流式細(xì)胞數(shù)據(jù)，用Flowjo分析軟件，在PI_Cy5-A/V1Blue-A雙參數(shù)點(diǎn)圖中進(jìn)行調(diào)整。
[0035]四分門左下象限代表腦脊液中有活力的宿主細(xì)胞數(shù)a (如白細(xì)胞等)，右下象限代表腦脊液中有活力的隱球菌數(shù)b，左上象限代表腦脊液中死亡的宿主細(xì)胞數(shù)C，右上象限代表腦脊液中死亡的隱球菌數(shù)d。每個標(biāo)本至少連續(xù)測定兩次，至少記錄10000個細(xì)胞并加以記錄和統(tǒng)計分析。
[0036]腦脊液中隱球菌濃度為(b+d) X離心后樣本重懸體積/ (流式細(xì)胞儀吸樣量*原始腦脊液體積)。
[0037]腦脊液中隱球菌活力比值為b/(b+d)。
[0038]通過對隱球菌濃度和活力比值的綜合判斷可以及時對治療方案進(jìn)行調(diào)整，若在誘導(dǎo)治療4周時，隱球菌活力明顯下降，則可進(jìn)入鞏固治療階段。同時，若在治療療程結(jié)束后腦脊液中仍有有活力的隱球菌，則延長維持治療時限，防止疾病復(fù)發(fā)。由于真菌細(xì)胞壁均有胞壁多糖成分，所以格特隱球菌、新生隱球菌和其他少見的隱球菌均可利用該方法進(jìn)行檢測。
[0039]采用該技術(shù)方案產(chǎn)生的有益效果在于:(1)本發(fā)明的試劑盒采用2種熒光小分子化合物組合，能夠準(zhǔn)確分析腦脊液中隱球菌的活力，做到臨床治療效果檢測和預(yù)后判斷；
(2)本方面使用方法簡單、方便，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法往往需要I周左右的培養(yǎng)時間，而且隨菌體活力的下降，培養(yǎng)時間還將延長，本發(fā)明可在30分鐘內(nèi)完成檢測；(3)利用本試劑盒的熒光小分子化合物組合，為定量分析腦脊液中隱球菌的活力比提供了可能，有利于治療效果評價的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
【附圖說明】
[0040]圖1是兩性霉素B治療5天的隱球菌腦膜炎患者腦脊液樣本檢測示意圖，
[0041]其中:圖1A為未進(jìn)行熒光標(biāo)記的腦脊液上樣，圖1B為試劑盒雙標(biāo)后腦脊液樣本分區(qū)圖，根據(jù)圖1B可知患者腦脊液中68.9%的隱球菌尚未死亡；
[0042]圖2是本發(fā)明對實(shí)驗(yàn)樣本的檢測示意圖，
[0043]其中:實(shí)驗(yàn)樣本為IX 1fVml細(xì)胞混懸液上樣，細(xì)胞懸浮液為小鼠外周血循環(huán)白細(xì)胞與隱球菌1: