。
[0096] 雜交反應(yīng)的可視化可以通過任何檢測裝置(諸如直接或間接裝置)而進行。
[0097] 在直接檢測的情況下,即沒有中間物標(biāo)記,雜交反應(yīng)通過細(xì)胞質(zhì)基因共振或通過 承載著導(dǎo)電性聚合物的電極上的循環(huán)伏安法而被觀察到。
[0098] 在間接檢測的情況下,即經(jīng)由標(biāo)記,該標(biāo)記要么可以在目標(biāo)核酸上直接進行,要么 可以經(jīng)由所述先前標(biāo)記的核酸的特定結(jié)合伴侶進行。
[0099]目標(biāo)核酸的特定結(jié)合伴侶意思是能夠結(jié)合到目標(biāo)核酸的任何伴侶,并且作為實例 我們可以提到核酸、寡核苷酸或多核苷酸和酶基底。
[0100] 標(biāo)記意思是能夠直接地或間接地產(chǎn)生可檢測的信號的標(biāo)志的定影。這些標(biāo)志的非 窮盡列表包括:通過例如電化學(xué)、比色法、熒光、發(fā)光而產(chǎn)生可檢測的信號的酶,酶諸如辣根 過氧化酶(HRP),堿性磷酸酶(ALP),貝塔-半乳糖苷酶,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶;酶抑制劑; 酶輔助因子;粒子諸如金粒子,磁性膠乳,脂質(zhì)體;發(fā)色團諸如發(fā)光化合物,染料,放射性分 子諸如 32P,35S或1251,熒光分子諸如熒光素,羅丹明,Alexa?,傘形酮,魯米諾或藻青蛋白。 在熒光的情況下,其可以是酶-基底反應(yīng)的熒光產(chǎn)品,熒光團-猝滅劑組合,熒光的熄滅或 基于熒光特性的任何其它系統(tǒng)。
[0101] 間接系統(tǒng)也可以被使用,例如經(jīng)由另一個配位體/抗配位體對。配位體/抗配位體 對是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的,并且我們可以提到例如下列對:生物素/抗生蛋白鏈菌 素,糖/凝集素,多核苷酸/互補多核苷酸。在這種情況下,是配位體承載著結(jié)合劑。抗配 位體可以是通過前面段落中所描述的標(biāo)志可直接檢測的或者可以本身是通過配位體/抗 配位體可檢測的。
[0102] 這些間接檢測系統(tǒng)在某些條件下可以導(dǎo)致信號的放大。這種用于信號放大的技 術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的,并且可以參考申請人的早期專利申請FR-A-2781802和 W0-A-95/08000 或者參考論文 "J. Histochem. Cytochem. 45 :481-491,1997"。
[0103] 對目標(biāo)核酸的初步標(biāo)記可以如下地進行:通過在末端處,隨機地或特定地,由聚合 酶、由激酶直接或間接并入標(biāo)志或通過并入分子"內(nèi)部"。
[0104] 目標(biāo)分析物的特定結(jié)合伴侶的標(biāo)記是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的,并且例如 由 Greg T. Hermanson 在"Bioconjugate Techniques,1996, Academic Press Inc,525B Street, San Diego, CA92101USA" 中進行描述。
[0105] 取決于所用成對物的標(biāo)記的類型,例如利用酶,本領(lǐng)域的技術(shù)人員將增加試劑以 用于標(biāo)記的可視化。該步驟對應(yīng)于開發(fā)。其被清洗緩沖劑的使用所領(lǐng)先,該清洗緩沖劑的 使用使得能夠去除分析物的或在反應(yīng)中沒有用的要素的片段(或者弱束縛地或者非特定 地),以便限制背景噪聲。
【附圖說明】
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的裝置的目的和優(yōu)點將參照附圖依據(jù)下列不以任何方式進行限制的 實施例被更好地理解,圖中:
[0107] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的特別實施方式的具有允許其起作用的所有元件的、用于 收集和溶解微生物的卡或盒的分解頂視圖。
[0108] 圖2示出了形成根據(jù)圖1中所示的本發(fā)明的實施方式的裝置的核心的主卡的透視 頂視圖。
[0109] 圖3示出了仍根據(jù)圖1中所示的本發(fā)明的實施方式的主卡的透視仰視圖。
[0110] 圖4示出了圖2的在珠子堆和柵格的水平上的細(xì)節(jié),所述柵格將各珠子保持在與 至少一個流體導(dǎo)入導(dǎo)管接觸的平面中并允許捕獲微生物。C形的模塊的兩個相反端被流體 地連接到用于導(dǎo)入和排出反應(yīng)液體的通道。
[0111] 圖5A為主卡的過濾部分的流向圖,當(dāng)限制板被關(guān)閉時珠子存在于所述部分中。
[0112] 圖5B為類似于圖5A的流向圖,但其中限制板是打開的。
[0113] 圖6給出了來自圖5B中的細(xì)節(jié)A,但其中流體在捕獲珠子內(nèi)的運動以及限制板的 運動被凸顯。
[0114] 圖7與圖6相同,但集中在限制板的新運動以及反應(yīng)液體在捕獲珠子內(nèi)的運動的 開始上。
[0115] 圖8與圖7相同并清楚地示出了流體在所述捕獲珠子內(nèi)的運動。
[0116] 圖9與圖8相同但強調(diào)了核酸的提取。
[0117] 圖10A至10D示出了填充腔室的有效性,隨著時間的推移微生物被保持裝置保持 在腔室中。
[0118] 圖11示出了表明在根據(jù)本發(fā)明的裝置內(nèi)溶解的效率的曲線。
【具體實施方式】
[0119] 本發(fā)明涉及微生物收集裝置1。圖1示出了由申請人提出的一個實施方式的分解 視圖,其中微生物收集裝置1在沒有任何流體2或液體12存在的情況下被呈現(xiàn)。所述收集 裝置1基本上包括兩個主要部分:主卡4,其相對于副卡5被定位在下部位置,所述副卡5 處于上部位置中。主卡4為L形的,并且副卡5被結(jié)合在此"L"形狀中以給出總體上呈平 行六面體的形狀。主卡4和副卡5意在被使得與彼此接觸。以這種方式,它們將形成用于 保持珠子6的裝置9,該裝置9基本上由出現(xiàn)在該"L"形狀的水平部分中的腔構(gòu)成,該腔9 由與卡4接觸的副卡5的底表面關(guān)閉。這兩個卡,主卡4和副卡5, 一旦被組裝就形成反應(yīng) 模塊3。然而,保持裝置9并不只是包括該反應(yīng)模塊3的邊緣而且還包括一個或多個柵格 27 (未示于圖1中),其允許流體2或液體12通過但不允許珠子6 (也未示出)離開反應(yīng)模 塊3。在柵格27 (示于圖4中)上,柵格27中的孔28的直徑取決于使用的珠子6的直徑。 柵格27中的孔28必須具有比玻璃珠子的直徑小的直徑。在優(yōu)選的實施方式中,柵格27中 的孔28必須具有比玻璃珠子的直徑顯著小的直徑,"顯著"意味著例如珠子6具有從400到 600 ii m的直徑并且柵格27具有從200到250 ii m的孔28。
[0120] 兩個卡4和5的組件以及用于導(dǎo)入和排出流體的導(dǎo)管40和41及用于導(dǎo)入和排出 反應(yīng)液體的通道7和8(示于圖4中),被利用氣密的限制外殼13進行限制,所述限制外殼 13在呈現(xiàn)于圖1中的實施方式中包括一定數(shù)量的限制板。
[0121] 首先,在上部位置中,有兩個頂板14和15。然后在下部位置中有兩個底板16和 17 ;板14和16特別是在分析區(qū)域26的流體通道的水平上提供對反應(yīng)模塊3的限制,該分 析區(qū)域?qū)⒃诤竺孢M行描述。然后有頂和底鐵磁限制板15和17,它們就其本身而言被定位在 所述反應(yīng)模塊3上方。
[0122] 在捕犾步驟之后,板15和17被重定位以關(guān)閉消耗品(consumable)。只有微生物 10保留在腔室9中。通道7和8然后被用來在超聲波溶解步驟之前循環(huán)洗脫緩沖劑。
[0123] 應(yīng)注意的是,頂板15和底板17具有鐵磁性質(zhì),因為它們包圍了定位在反應(yīng)模塊3 四個拐角處以及在其中心處的一定數(shù)目的磁體21。磁體21 -方面提供鐵磁板15和17在 0形圈密封件18上的壓力,并且另一方面在捕獲微生物之后提供氣密性。這些板15和17 提供了到各捕獲珠子6的通路,并使得可以將存在于流體2中的微生物10捕獲在珠子6上。 板15和17在裝置1的表面上在滑動件29上滑動,所述滑動件位于側(cè)邊上,并且在本例中 它們具有燕尾形狀。在完成空氣采樣后,所述板15和17通過沿著滑動件29滑動而被重定 位到它們的初始位置。液體回路于是被關(guān)閉。在板上需要"夾持"力以便確保關(guān)閉的完美 氣密性。該力例如是鐵磁性的,其具有作用在上述板的整個表面上的均勻壓力的優(yōu)點。
[0124] 在主卡4和副卡5與頂板15和底板17之間,氣密性通過一組氣密的0形圈密封件 18得以確保。這些0形圈密封件18在上部位置中的數(shù)量是三個并在下部位置中的數(shù)量是 三個,并且是同心的。當(dāng)然,該數(shù)量不以任何方式進行限制,因為使用單一 0形圈密封件可 能也足夠。此外,其它的密封裝置存在于頂板14和底板16與裝置1的其余部分之間。所 采用的手段特別是利用粘合劑或雙面膠將這些板中的每一個粘貼在主卡4上。類似地,副 卡5被永久地粘貼在裝置的本體4上。該粘貼被超聲波地、通過激光或熱地執(zhí)行,其是永久 的并且允許收集裝置1的組裝。
[0125] 應(yīng)注意的是,主卡4包括在其中有通道的兩個區(qū)域。首先是有存儲區(qū)域,其在反應(yīng) 模塊3近旁被標(biāo)記為25。還有分析區(qū)域26,其在上面被提及。存在于區(qū)域25和26的水平 上的各個通道允許整個卡的流體管理。存儲區(qū)域25中的通道是用于存儲反應(yīng)液體12 (洗脫 緩沖劑)的貯存器。分析區(qū)域26中的通道是用于為分析而進行樣品制備的流體通道。它 們在卡的正面和背面上循環(huán)。熒光讀取也發(fā)生在區(qū)域26中的通道中。因為這些區(qū)域25和 26不是本發(fā)明的本質(zhì),它們將不進一步被描述。
[0126] 這些類型的通道和它們的功能在由申請人以2009年9月18日的法國優(yōu)先權(quán)提交 的在先專利申請W0-A-2011/033231中被更好地說明。讀者請參考該專利申請以獲得更全 面的信息。
[0127] 在捕獲微生物10之后,板15和17被再次關(guān)閉。來自腔室25的緩沖劑被送至捕 獲腔室9中以用于再懸浮微生物。然后超聲波溶解通過在卡外部的裝置而在該同一腔室9 中進行。溶解產(chǎn)物然后經(jīng)由分配器閥22 (其在孔31中滑動)被共享,并通過泵活塞23 (其 在孔32中滑動)被送至區(qū)域26的通道中,以便為檢測做準(zhǔn)備和擴增核酸11。
[0128] 然而,應(yīng)被理解的是,各個元件允許反應(yīng)液體12通過分配器閥22、以及泵活塞23 的干預(yù)而從隔室到隔室的流體管理和傳遞。這些泵活塞23中的三個在主卡4的左側(cè),且另 外三個在該同4的右側(cè)。
[0129] 最后,為結(jié)束對圖1的描述,要注意的是,在主卡4內(nèi)還有干燥站24。這些站24位 于分析區(qū)域26近旁,并且包含干燥劑以