溶解存在于樣品中的微生物、提取并提純所述微生物的核酸以用于分析目的的自動化系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域是生物學(xué)分析領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明首先涉及用于溶解存在 于環(huán)境或臨床樣品中的微生物、用于提取并用于提純所述微生物的核酸的裝置。本發(fā)明還 涉及用于溶解微生物、用于提取和提純所述微生物的核酸以用于分析目的的自動化系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 若干年來，在醫(yī)院中的院內(nèi)感染的發(fā)生率已有了相當(dāng)可觀的增長。這些感染被解 釋為由于就醫(yī)人員的污染（這些人員因此為限定免疫抑制），并由于存在于醫(yī)院環(huán)境中且 不管如何始終謹(jǐn)慎地進行設(shè)備和表面的消毒以及空氣調(diào)節(jié)也無法消滅的致病微生物所致。 考慮到這些越來越頻繁的環(huán)境微生物污染的情況，用于改善和便于環(huán)境控制的裝置和方法 的開發(fā)已成為保健專業(yè)醫(yī)生的主要挑戰(zhàn)。
[0003] 且不說院內(nèi)感染的問題，對環(huán)境狀況的監(jiān)控在近些年來在工業(yè)環(huán)境、特別是在食 品工業(yè)和制藥或化妝品工業(yè)中已經(jīng)成為周期性發(fā)生的關(guān)注點。在食品工業(yè)中，我們熟悉產(chǎn) 品的、或甚至原材料的致病微生物污染對于消費者的健康可能具有的災(zāi)害性后果。事實上， 由于細菌（諸如李斯特菌屬或沙門氏菌屬中的那些）導(dǎo)致的有毒食品感染現(xiàn)在是屢見不 鮮。對空氣質(zhì)量的監(jiān)控在制藥或化妝品工業(yè)的質(zhì)量方法中也是關(guān)鍵過程。
[0004] 此外，這種監(jiān)控必須符合曾經(jīng)的需求增長水平，由于日益嚴(yán)格的規(guī)障。
[0005] 在對保健專業(yè)醫(yī)生或制造者而言可得到的以用于執(zhí)行環(huán)境監(jiān)控的工具中，空氣生 物取樣器（biosampler)是用于檢測空氣中的微生物的選擇方案。這些裝置在我們希望測 量空氣生物污染的地方被放置在合適的點處。它們通常包括連接到培養(yǎng)介質(zhì)的空氣取樣 器。由空氣取樣器收集的空氣與培養(yǎng)介質(zhì)形成接觸；收集到的任何空氣傳播的微生物將被 沉積在所述培養(yǎng)介質(zhì)上。培養(yǎng)介質(zhì)然后被回收并被放在爐中以促進微生物的生長。于是便 可以通過傳統(tǒng)的微生物技術(shù)來檢測和識別所述微生物。
[0006] 然而，這些裝置具有與所采用的技術(shù)相關(guān)的主要缺點。該缺點是獲得分析結(jié)果所 花費的時間。事實上，傳統(tǒng)的微生物技術(shù)、尤其是細菌學(xué)的使用，包含等待細胞生長、或甚至 在特定的培養(yǎng)介質(zhì)上的再播步驟所必需的培育次數(shù)以允許識別。結(jié)果，當(dāng)我們希望檢測和 識別是院內(nèi)感染或食物中毒的原由的致病生物體時，為獲得結(jié)果所花費的時間相對很長， 或甚至太長。
[0007] 該類裝置的另一個缺點是，盡管培養(yǎng)介質(zhì)的使用使得在細菌的屬和種之間進行區(qū) 分成為可能，但其通常不能在同一個細菌種的菌株之間進行區(qū)分?，F(xiàn)在，已知的是微生物的 致病性可能取決于上述的菌株而顯著改變。
[0008] 此外，該類裝置具有其不允許檢測能存活但不可栽培的空氣傳播的微生物的缺 點。
[0009] 這些裝置還具有養(yǎng)分表面隨著收集的繼續(xù)而干燥的缺點。
[0010] 此外，存在目的在于回收空氣傳播的粒子、尤其是微生物的裝置。因而，文獻 GB-2254024描述了基于旋風(fēng)效應(yīng)原理的用于收集存在于空氣中的粒子的裝置。盡管這種裝 置證明適合于收集存在于空氣中的粒子，包括微生物，但其還從未針對處理這樣獲得的樣 品進行調(diào)查，特別是針對執(zhí)行意在被用于分析的遺傳物質(zhì)的提取方面。
[0011] 更一般地，在識別微生物和/或傳送結(jié)果的速度方面最相關(guān)的技術(shù)，無論是對于 臨床樣品還是環(huán)境樣品而言，毫無疑問是分子診斷技術(shù)。這些技術(shù)，基于對微生物的遺傳物 質(zhì)的分析，并且特別是對感興趣的某些特定的序列的分析，使得能夠在記錄時間中獲得對 微生物的非常精確的識別，因為它們使得能夠省略培養(yǎng)步驟。
[0012] 然而，這些技術(shù)的使用具有一定數(shù)量的限制，其中最重要的是存在于空氣中的并 因此可回收以用于執(zhí)行分析的微生物的潛在有限的量。事實上，已知的是，環(huán)境樣品，而且 還有某些臨床樣品，在微生物方面是相對貧乏的。結(jié)果，從該原材料中獲得的遺傳物質(zhì)的量 很小。用來提取核酸的技術(shù)在產(chǎn)量方面的性能于是就成了至關(guān)重要的參數(shù)。
[0013] 此外，大部分用于溶解的微生物的現(xiàn)存的技術(shù)相對于所有微生物而言是不通用的 和/或需要有資質(zhì)的人員的干預(yù)以便執(zhí)行手動步驟。
[0014] 文獻W0-A-2005/038025描述了用于從特別是自空氣中采樣的微生物中提取核酸 的方法。該方法包括采用三個不同的溶解方法，即化學(xué)溶解、熱沖擊溶解和機械溶解。如果 這種方法使得能夠毫無疑問地優(yōu)化提取核酸的效率并因此增加可用的遺傳物質(zhì)的量以用 于分析，那么情況仍然是該效率依然依賴于回收的微生物的量?，F(xiàn)在，針對優(yōu)化所述微生物 的回收該文獻中什么都沒有描述。
[0015] 文獻US-A-5, 707, 861描述了用于破壞活細胞諸如微生物的裝置。該裝置允許細 胞利用玻璃珠子和由于在包含微生物的管與承載所述管的支撐件的孔之間的空間所致的 振動效應(yīng)兩者被溶解。因此，這種裝置使得能夠優(yōu)化細胞的溶解并因此優(yōu)化遺傳物質(zhì)的提 取。這種裝置及其采用的方法具有與上面所述的那些裝置同樣的限制，即它們?nèi)砸蕾囉诨?收的微生物的量。此外，它們具有另外的缺點：需要隨后的濃縮核酸的步驟以便使它們與細 胞碎片分離。最后它們需要在濃縮步驟結(jié)束時手動地回收核酸。
[0016] 這些問題也出現(xiàn)在文獻US-5, 567, 050中所描述的裝置上。
[0017] 具有較高集成的系統(tǒng)也已被描述。因而，文獻W0-A-2004/018704描述了一種用于 收集空氣中的微生物并識別它們裝置，以及使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）擴增技術(shù)的相關(guān)的方 法。該系統(tǒng)被特別地設(shè)計用于在郵件分類中心防止通過生物污染的暗殺企圖。該系統(tǒng)包 括沿著用于運輸郵件的回路放置的空氣采樣裝置，用于通過旋風(fēng)效應(yīng)篩選/分離粒子的裝 置，用于從液體樣品中濃縮/回收粒子的裝置，用于將樣品的片段傳遞至來自加利福尼亞 的Cepheid公司的GeneXpert?PCR分析盒中的裝置。該盒然后被手動地傳遞到一獨立的 自動化生物分析儀以用于識別從空氣中收集的一種或多種微生物。
[0018] 盡管該系統(tǒng)解決了與上述的裝置和方法有關(guān)的許多技術(shù)問題，然而其仍具有較多 缺點。這些缺點中的第一個是用于在傳遞到分析盒之前進行樣品處理（收集、分離、濃縮/ 回收）的系統(tǒng)相對復(fù)雜和昂貴。第二個缺點是所收集的微生物在液體樣品中被回收，僅其 一小部分被分析。這意味著存在沒有回收所有的微生物并因此沒有回收所有的核酸的相當(dāng) 大的風(fēng)險，這極大地限制了分析的適用性。此外，不管其復(fù)雜性如何，該系統(tǒng)需要將該盒手 動傳遞至GeneXpert?自動化分析儀中。
[0019] 申請人已經(jīng)提交了一項主要涉及盒的專利申請W0-A-2009/001010,所述盒合適于 放置在空氣采樣裝置內(nèi)并適合于接納用于回收核酸的裝置，具有粗略的圓柱形狀的所述盒 包括微生物的保持區(qū)域，所述保持區(qū)域包括用于溶解微生物的裝置。該發(fā)明還涉及用于收 集空氣傳播的微生物的裝置和用于溶解微生物的裝置。
[0020] 申請人還提交了一項專利申請W0-A-2010/067019,該申請除了其它方面以外涉及 用于收集空氣傳播的微生物的裝置，所述裝置包括：
[0021] ?空氣采樣模塊，其包括：
[0022] i.包括空氣導(dǎo)入導(dǎo)管的上部元件，所述空氣導(dǎo)入導(dǎo)管允許空氣流進入所述模塊， 所述導(dǎo)管在其基部處具有用于干擾空氣流的裝置，
[0023] ii.包括用于排出空氣的裝置的下部元件，其允許所產(chǎn)生的空氣流排出，
[0024] 所述上部和下部元件與彼此集成使得空氣流能夠在所述空氣采樣模塊內(nèi)被產(chǎn)生 是可能的；
[0025] ?盒，其具有粗略的圓柱形狀，其包括微生物的保持區(qū)域，所述保持區(qū)域包括用于 溶解微生物的裝置，所述盒被定位在所述空氣采樣模塊內(nèi)部。
[0026] 通過這兩個新穎的方案，不可否認(rèn)的是，該過程被改善為對于任選地處于植物性 狀態(tài)或呈孢子形式的大量的微生物而言（不論它們是細菌、病毒還是或真菌）具有通用的 溶解、并對于環(huán)境樣品和臨床樣品都有效。
[0027] 此外，有著相當(dāng)高的微生物濃度，該系統(tǒng)與各種下游分析（諸如PCR，皿上劃線， 等）相容，并且機械溶解被集成。
[0028] 然而，當(dāng)可能找到更優(yōu)的方案時，滿足于運行良好的系統(tǒng)并不是人類的本性。因 此，在這兩個例子中，收集仍受限于氣態(tài)或液態(tài)流體的體積，該流體與回收介質(zhì)（通常為培 養(yǎng)介質(zhì)）形成接觸。流體流將始終在同一點上撞擊該介質(zhì)，這將導(dǎo)致：
[0029] ?要么所述介質(zhì)在精確的點處飽和而其余部分未被使用，
[0030] ?要么該介質(zhì)老化，因為其始終在同一個（些）點處被氣體或液體撞擊，這在氣體 的情況下導(dǎo)致介質(zhì)表面的干燥并且在液體的情況下導(dǎo)致介質(zhì)表面的液化。在這兩種情況下 并且特別是在瓊脂干燥的情況下，捕獲效率隨著時間將會有非常明顯的下降。
[0031] 此外，通過撞擊的捕獲方式對于具有小于1 y m的直徑的小粒子來說非常低效。另 一個問題是存在一部分回收介質(zhì)（具有甘油的珠子）被空氣流挾帶的風(fēng)險。因此，流體的 這種投射及其在所述介質(zhì)上的反彈可能產(chǎn)生彈著點，這又是另一個污染的風(fēng)險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0032] 本發(fā)明的目的是提出一種解決了上述的缺點的設(shè)備。
[0033] 為此，本發(fā)明提出一種用于收集包含在流體中的微生物的裝置，所述裝置包括：
[0034] ?包含一組珠子的反應(yīng)模塊，
[0035] ?至少一個流體導(dǎo)入導(dǎo)管，其允許流體流進入所述模塊，
[0036] ?至少一個用于排出流體的導(dǎo)管，其允許已經(jīng)通過所述模塊內(nèi)部的所述流體流排 出，
[0037] ?在所述模塊內(nèi)的珠子保持裝置，
[0038] ?用于導(dǎo)入至少一種反應(yīng)液體的至少一個通道，
[0039] ?