專利名稱：抗人iv型膠原蛋白酶聯(lián)免疫定量測(cè)定試劑盒及制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人IV型膠原蛋白酶聯(lián)免疫定量測(cè)定試劑盒，用于各種原因?qū)е赂卫w維化、糖尿病和矽肺等疾病的診斷及其病程的監(jiān)控。
本發(fā)明還涉及該試劑盒的制作方法和測(cè)定方法。
肝纖維化是由多種原因引起的肝臟慢性損傷，肝臟細(xì)胞外質(zhì)間成分異常沉積，導(dǎo)致肝功能受損的綜合癥，隨著肝纖維化研究的深入，不斷地揭示了膠原結(jié)構(gòu)，功能與病理學(xué)的內(nèi)在關(guān)系，尤其是在對(duì)IV型膠原蛋白(英文縮寫(xiě)IV-CL)的研究更加深入，在診斷上更有價(jià)值，因此檢測(cè)血液中的IV型膠原蛋白的含量對(duì)肝纖維化的診斷、治療效果和愈后的判斷具有重要意義，目前在治療和診斷以及病程監(jiān)控，多數(shù)采用肝刺穿的辦法，不僅病人痛苦，而且在治療過(guò)程中不能定期進(jìn)行，因此，損傷了病人的體質(zhì)，同時(shí)也非常麻煩，有一種進(jìn)口的試劑盒，它即把抗人IV型膠原氨基端7S單抗包被在小珠子上，再采用雙抗體夾心二步法操作，該試劑盒價(jià)格昂貴，操作麻煩。
本發(fā)明的目的正是為了克服上述已有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足采用抗人IV型膠原單抗包被酶標(biāo)板上的一種雙抗體夾心一步法測(cè)定人血清中IV型膠原蛋白含量的抗人IV型膠原蛋白酶聯(lián)免疫定量測(cè)定試劑盒，從而可迅速、準(zhǔn)確的判斷和監(jiān)控病程。
本發(fā)明還提供了該試劑盒的制作方法和定量測(cè)定方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的抗人IV型膠原蛋白酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于它由抗人IV型膠原蛋白單克隆抗體包被的酶標(biāo)板和測(cè)定試劑組成，測(cè)定試劑為標(biāo)準(zhǔn)抗原凍干品酶標(biāo)抗體結(jié)合物，稀釋液磷酸鹽緩沖液，洗液吐溫磷酸鹽緩沖液，
顯色液A四甲基聯(lián)苯胺，B雙氧水，終止液2M硫酸溶液。
本發(fā)明試劑盒的制作方法，包括標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備，單克隆抗體的制備，單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的制作，酶標(biāo)抗體結(jié)合物的制備和試劑的配制。
標(biāo)準(zhǔn)抗原是從人胎盤(pán)提取制備的，它將胎盤(pán)洗凈后制漿，用中性鹽提取數(shù)次，經(jīng)胃蛋白酶消化、氯化鈉沉淀，并過(guò)離子交換柱層析CM-24纖維柱，采用氯化鈉線性梯度洗脫IV型膠原即得標(biāo)準(zhǔn)抗原。
此品用于測(cè)定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲的制作，可將標(biāo)準(zhǔn)抗原凍干品用磷酸鹽緩沖液稀釋不同濃度為1000、500、250、125、62、31、16、0ng/ml，八個(gè)點(diǎn)作為曲線的橫坐標(biāo)，以A450OD平均值為縱坐標(biāo)，用對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙繪制曲線。
本發(fā)明試劑盒的單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的制作是將單克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋加入酶標(biāo)板孔中，每孔可加100μl，吸附過(guò)夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用牛、馬血清封閉液在37℃溫度封閉1小時(shí)，甩干，吹干，即將單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上。
單克隆抗體制備是用人胎盤(pán)提取IV型膠原蛋白的抗原進(jìn)行免疫BaCB/小鼠后取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合培養(yǎng)，經(jīng)篩選克隆，選擇特異性抗人IV型膠原單克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔制備腹水，得到單克隆腹水，再用正辛酸沉淀純化得到單克隆抗體。
酶標(biāo)抗體結(jié)合物的制備它是將辣根過(guò)氧化酶溶于醋酸緩沖液中，加入NaIO4溶液，乙二醇和純化抗人IV型膠原，過(guò)夜，加NaHB4溶液，用硫酸銨沉淀、離心、脫鹽即得到酶標(biāo)抗體結(jié)合物，加等體積甘油保存，使用時(shí)選擇適宜的稀釋度。
洗液為吐溫磷酸鹽緩沖液，用于洗板，可在2-8℃保存6個(gè)月。
顯色液用于顯色，在2-8℃保存6個(gè)月。
終止液用2M硫酸溶液，在2-8℃保存6個(gè)月。
IV型膠原蛋白單克隆抗體可以是氨基端7S，羧基NC1，三螺旋中心區(qū)，IV型膠原全抗體的其中任意一種。
試劑盒的測(cè)定方法，其特征在于它依次按下述步驟進(jìn)行a)在酶標(biāo)板上孔內(nèi)加稀釋液，b)再加入人血清樣品，在37℃水浴上靜置10-20分鐘，c)再加入酶標(biāo)抗體結(jié)合物，在37℃水浴上靜置60分鐘；d)用洗液洗板并甩干、吹干；e)依次加顯色液A、B，在37℃水浴上靜置5-10分鐘；f)加終止液，結(jié)束反應(yīng)；g)測(cè)OD450值，計(jì)算結(jié)果。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BACB/C小鼠體重12-14g，由北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，酶標(biāo)板為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)兩種，酶標(biāo)儀為BIO-RAD。
臨床應(yīng)用結(jié)果1、試劑盒臨床應(yīng)用結(jié)果檢測(cè)臨床標(biāo)本436例，其中健康對(duì)照162例，肝炎36例，糖尿病患者92例，肝癌患者77例，肝硬化69例，結(jié)果見(jiàn)表(1)表1 試劑盒臨床應(yīng)用結(jié)果組別 例數(shù) 均值標(biāo)準(zhǔn)差 超過(guò)上限正常例數(shù)*及其百分率X SD X±SD健康對(duì)照 162 44.9659.410 6.2％糖尿病組 92 225.949 53％肝炎組 36 237.920 55.5％肝硬化組 69 527.88 54 78.3％肝癌組 77 325..6 55 71.4％結(jié)果顯示各患者均顯著高于健康對(duì)照組(P＜0.01)，在各患者組中肝硬化組顯著高于其它組(P＜0.01)。
2、18例經(jīng)病理確診酒精性肝病患者血清IV型膠原測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2表2 酒精性肝病患者血清IV型膠原測(cè)定結(jié)果組別例數(shù)均值 超過(guò)正常上限例數(shù)及其百分率輕度酒精性肝病3 69.40 0％酒精性肝炎21050.7 2100％(合并IIBV感染)酒精性肝纖維化II 5148.61 20％酒精性肝纖維化III 4143.62 50％酒精性肝纖維化IV 4176.44100％從表2中可以看出，在13例肝纖維化患者中II級(jí)纖維化有20％患者高于正常，III級(jí)纖維化患者中有50％高于正常，IV級(jí)纖維化患者中100％高于正常；在2例合并HBV感染的酒精性肝炎患者血清IV-CL濃度也均高于正常，結(jié)果顯示血清IV-CL水平與肝纖維化程度呈正相關(guān)，且與肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度密切相關(guān)。
3、126例肝病患者IV型膠原檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表(1)，126例肝病患者病因檢查結(jié)果見(jiàn)表(3)表3 肝病病因檢查結(jié)果例數(shù) 乙肝 丙肝 乙+丙 戊肝病毒性肝炎 110 8816 51酒精性肝炎 12病毒性+酒精肝病 4 2 1 1
檢查結(jié)果表明病毒性肝炎110例，酒精性肝炎12例，4例為混合性肝炎。
(2).IV型膠原對(duì)2級(jí)以上肝纖維化的診斷價(jià)值對(duì)上述126便肝病患者肝穿刺組織標(biāo)本進(jìn)行電鏡病理檢查。對(duì)2級(jí)以上肝纖維化患者血清標(biāo)本采用多種血清IV-CL進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定數(shù)據(jù)處理后其界值、敏感性、特異性和準(zhǔn)確性結(jié)果列表(4)表4血清IV型膠原對(duì)2級(jí)以上肝纖維化的診斷價(jià)值指標(biāo) 界值 敏感性％ 特異性％ 準(zhǔn)確性％PCIII600ng/ml81.6 81.8 81.7HA-Ch80ng/ml 81.3 77.8 80.2HA 20ng/ml 76.9 78.6 77.5TIMP 240ng/ml69.2 81.9 73.4PIIIP0.9u/ml 71.4 75.0 72.6IV-Ch150ng/ml71.4 72.7 71.8LN 2.4u/ml 70.1 73.9 71.3IV-C 120ng/ml65.2 65.8 65.3PH 20ng/ml 70.0 55.6 65.3表4中結(jié)果指出試劑盒對(duì)2級(jí)以上肝纖維化的診斷敏感性為71.4％，特異性為72.7％，準(zhǔn)確性為71.8％。
5.IV型膠原對(duì)3級(jí)以上肝纖維化的診斷價(jià)值結(jié)果見(jiàn)表5
表5 血清IV型膠原對(duì)3級(jí)以上肝纖維化的診斷價(jià)值PCIII700ng/ml60.065.263.1HA-Ch220ng/ml78.380.079.3HA 40ng/ml 77.880.679.5TIMP 280ng/ml68.170.072.2PIIIP1.0u/ml 73.968.770.8IV-Ch180ng/ml74.261.766.7LN 2.6u/ml 60.064.062.4IV-C 200ng/ml71.187.380.8PH 35ng/ml 75.060.066.0表5中結(jié)果指出試劑盒對(duì)3級(jí)以上肝纖維化的診斷敏感性為74.2％，特異性為61.7％，準(zhǔn)確性為66.7％。
本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果a)本試劑盒可用于臨床檢測(cè)肝、肺纖維化腎臟病和糖尿病，尤其對(duì)肝纖維化的診斷治療效果和病后的判斷具有重要的現(xiàn)實(shí)意義；b)具有較高的靈敏度，特異性好，可重復(fù)性，達(dá)到臨床檢測(cè)要求；c)使用操作方法，快速準(zhǔn)確，價(jià)格便宜，易推廣普及；下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)試劑盒的抗人IV型膠原蛋白單抗包被板用可折條形96孔酶標(biāo)板，將單克隆抗體干包被各孔底面上，每盒一塊，標(biāo)原凍干品2瓶，樣品稀釋液每瓶20ml/瓶，酶抗體結(jié)合物1瓶，結(jié)合物稀釋液12ml一瓶，洗液一瓶，顯色液A、B兩瓶，每瓶6ml，終止液1瓶，每瓶6ml，測(cè)定時(shí)，在酶標(biāo)板上作標(biāo)準(zhǔn)曲線的8孔內(nèi)加入用稀釋液稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原凍干品，依次濃度為1000、500、250、125、63、31、16、0ng/ml，每孔加50μl，置水浴上，放置10分鐘，每孔再加用結(jié)合物稀釋液稀釋50倍的酶標(biāo)抗體結(jié)合物100μl，在水浴上放置1小時(shí)，將洗液瓶中的洗液加蒸餾稀釋20倍，洗板，再在各孔加顯色液A、B各50μl在水浴上放置10分鐘，加終止液50μl，終止反應(yīng)，測(cè)各孔用酶標(biāo)儀測(cè)OD450值，繪制曲線，在同一板上測(cè)定人血液中的IV型膠原，取人血，制血清，先在孔內(nèi)加血清樣品稀釋液50μl，再加血清50μl，在水浴上37℃放置10分鐘，加入上述稀釋酶標(biāo)抗體結(jié)合物100μl，繼續(xù)在水浴上37℃放置60分鐘，用洗液洗板并甩干，吹干，依次加入顯然液A、B，在水浴上37℃放置10分鐘加終止液，終止反應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)A450OD值，計(jì)算結(jié)果。
試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的工作范圍16-1000ng/l，靈敏度為16ng/l。
權(quán)利要求
1.抗人IV型膠原蛋白酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于它由抗人IV型膠原蛋白單克隆抗體包被的酶標(biāo)板和測(cè)定試劑組成，測(cè)定試劑為標(biāo)準(zhǔn)抗原凍干品酶標(biāo)抗體結(jié)合物，稀釋液磷酸鹽緩沖液，洗液吐溫磷酸鹽緩沖液，顯色液A四甲基聯(lián)苯胺，B雙氧水，終止液2M硫酸溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒制作方法，包括標(biāo)準(zhǔn)抗原的制備，單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的制作，酶標(biāo)抗體結(jié)合物的制備和試劑的配制，其特征在于a)單克隆抗體的制備，是將人胎盤(pán)提取的IV型膠原蛋白抗原進(jìn)行免疫BACB/C小鼠，再取免疫小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)，篩選克隆，選擇特異性抗人IV型膠原單克隆細(xì)胞株注入小鼠腹腔制備腹水，得到單克隆抗體腹水用正辛酸純化得到單克隆抗體；b)單克隆抗體包被的酶標(biāo)板的制作，將單克隆抗體用碳酸鹽緩沖液釋釋后滴入酶標(biāo)板各孔內(nèi)，過(guò)夜吸附，用洗液洗板，再用牛、馬血清封閉液在37℃溫度封閉，甩干，吹干，即制成單克隆抗體包被的酶標(biāo)板。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于IV型膠原蛋白單克隆抗體可以是氨基端7S，羧基NC1，三螺旋中心區(qū)，IV型膠原全抗體的其中任意一種。
4.如權(quán)利要求1所述的試劑盒的測(cè)定方法，其特征在于它依次按下述步驟進(jìn)行a)在酶標(biāo)板上孔內(nèi)加稀釋液，b)再加入人血清樣品，在37℃水浴上靜置10-20分鐘，c)再加入酶標(biāo)抗體結(jié)合物，在37℃水浴上靜置60分鐘；d)用洗液洗板并甩干、吹干；e)依次加顯色液A、B，在37℃水浴上靜置5-10分鐘；f)加終止液，結(jié)束反應(yīng)；g)測(cè)OD450值，計(jì)算結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人Ⅳ型膠原蛋白酶聯(lián)免疫定量測(cè)定試劑盒及制作方法,它由酶標(biāo)板和檢測(cè)試劑組成,用人胎盤(pán)提?、裟z原采用細(xì)胞工程——雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體用酶聯(lián)免疫吸附原理將單抗包被酶標(biāo)板上,采用雙抗體夾心法,定量測(cè)定人血清中Ⅳ型膠原蛋白的含量,可用于肝纖維化的診斷、治療和病后的判斷,具有較好靈敏度,特異性好,可重復(fù)性,準(zhǔn)確快速,達(dá)到臨床檢測(cè)的要求。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1188235SQ9712205
公開(kāi)日1998年7月22日 申請(qǐng)日期1997年12月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月19日
發(fā)明者蔣盤(pán)宏, 莫畏 申請(qǐng)人:北京化學(xué)試劑研究所