本技術(shù)涉及免疫檢測，尤其涉及一種apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、載脂蛋白e（apolipoprotein?e，apoe）是體內(nèi)最重要的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，也是對脂質(zhì)代謝（主要是甘油三酯和膽固醇）影響最大的載脂蛋白，在人體的大多數(shù)組織均有分布。apoe成熟體是含有299個氨基酸的糖蛋白，分子量約為34kda。apoe有3種常見亞型，apoe2、apoe3、apoe4。編碼apoe三種亞型的基因位于人類19號染色體的長臂上，三種等位基因編碼的apoe在112和158的2個位點上殘基不同，造成其脂質(zhì)結(jié)合能力及受體親和度的差異。

2、其中，載脂蛋白e基因的等位基因ε4（apolipoprotein?ε4，apoe4）是阿爾茲海默癥（alzheimer’s?disease，ad）的強遺傳危險因素。ad是一種與認知功能下降相關(guān)的進行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，是最常見的癡呆類型之一。其可能機制為：apoe的碎片形成毒性產(chǎn)物，抑制神經(jīng)元的生長；apoe影響β淀粉樣蛋白（aβ）的產(chǎn)生和清除，造成aβ的異常沉積，形成斑塊。apoe?ε4增加了ad和認知功能障礙的患病風(fēng)險，與非apoe?ε4攜帶者比較，ad中的apoeε4攜帶者表現(xiàn)出更早的aβ沉積和臨床癥狀的出現(xiàn)，更嚴重的aβ斑塊負荷和腦萎縮，以及更快的疾病進展，提示apoe?ε4在ad發(fā)病機制中的突出作用。

3、apoe4存在于大約20%的全球人口和40~60%的ad患者中。apoe基因中一個等位基因ε4的存在會使罹患ad的風(fēng)險增加3~5倍，而ε4純合子則會使風(fēng)險增加8~12倍。此外，與apoeε4非攜帶者相比，apoe?ε4攜帶者發(fā)病更早，而且他們從ad的前驅(qū)階段（輕度認知障礙，mci）發(fā)展到ad的速度更快。因此，apoe?ε4的測定可為醫(yī)生提供有關(guān)患者罹患腦淀粉樣變性和ad風(fēng)險的有意義的信息。

4、通過聚合酶鏈反應(yīng)（pcr）進行基因分型是確定apoe等位基因狀態(tài)的最常用方法，準確性高，但需要對樣本進行預(yù)處理、易污染、自動化程度低、通量低、需要額外的設(shè)備以及成本高等因素，限制了其在臨床實驗室中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決或部分解決相關(guān)技術(shù)中存在的問題，本技術(shù)提供一種apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑、試劑盒及應(yīng)用，通過三種抗體分子的配合，能夠同時檢測apoe4亞型蛋白apoe各亞型蛋白，從而實現(xiàn)是否存在apoe?ε4?基因型的高效檢測；且通過調(diào)整該試劑中金屬鹽和表面活性劑能夠顯著改善apoe4檢測體系中的非特異性吸附，提升樣本區(qū)分度，滿足apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測需求。

2、本技術(shù)第一方面提供一種apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑，包括包被于發(fā)光微球的第一抗體、以及標記有特異性結(jié)合配對成員之一的第二抗體和第三抗體組成的系列抗體試劑；

3、其中，所述第一抗體、第三抗體能夠特異性識別和結(jié)合apoe各亞型蛋白，所述第二抗體能夠特異性識別和結(jié)合apoe4亞型蛋白。

4、在一些實施方式中，所述發(fā)光微球與第一抗體的質(zhì)量比為10:（0.05~0.5）。

5、在一些實施方式中，所述系列抗體試劑還包括0.01~0.1m?的緩沖液、0.01%~5%(w/v)的bsa、0.01%~5%(w/v)的葡聚糖。

6、在一些實施方式中，所述緩沖液選自pbs緩沖液、tris-鹽酸緩沖液、hepes緩沖液、mes緩沖液中的至少一種；優(yōu)選為pbs緩沖液。

7、在一些實施方式中，所述bsa濃度優(yōu)選為0.1%~3%(w/v)；更優(yōu)選為0.5%~1%(w/v)。

8、在一些實施方式中，所述葡聚糖的濃度優(yōu)選為0.1%~3%(w/v)；更優(yōu)選為0.5%~2%(w/v)。

9、在一些實施方式中，所述試劑還包括不低于2.5m的金屬鹽、以及至少為0.01%(w/v)的表面活性劑。

10、在一些實施方式中，所述金屬鹽為氯化鈉、氯化鉀中的至少一種；優(yōu)選為氯化鈉。

11、在一些實施方式中，所述表面活性劑選自tween20、tritonx-100、tritonx-305、tritonx-405中的至少一種。

12、在一些實施方式中，所述表面活性劑包括tween20和tritonx-405；

13、優(yōu)選地，所述tween20的濃度為0.01~1%(w/v)；更優(yōu)選為0.1~0.6%(w/v)；

14、優(yōu)選地，所述tritonx-405濃度≥0.01%(w/v)；更優(yōu)選為≥0.2%(w/v)；進一步優(yōu)選為1%~2%(w/v)。

15、本技術(shù)第二方面提供一種apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括：

16、r1試劑，其包含第一抗體包被的發(fā)光微球、不低于2.5m氯化鈉、和至少1%(w/v)tritonx-405；

17、r2試劑，其包含標記有生物素的第二抗體；

18、r3試劑，其包含標記有生物素的第三抗體；

19、r4試劑，其包含標記有鏈霉親和素的感光微球；

20、其中，所述第一抗體、第三抗體能夠特異性識別和結(jié)合apoe各亞型蛋白，所述第二抗體能夠特異性識別和結(jié)合apoe4亞型蛋白。

21、本技術(shù)第三方面提供上述試劑或試劑盒在檢測血液樣本中apoe4中的應(yīng)用。

22、在一些實施方式中，所述檢測方法包括以下步驟：

23、s1、將包含第一抗體的發(fā)光微球、第二抗體、感光微球與待測樣本混合，得到包含“發(fā)光微球-apoe4亞型蛋白-感光微球”的第一復(fù)合物；同時，將包含第一抗體的發(fā)光微球、第三抗體、感光微球與待測樣本混合，得到包含“發(fā)光微球-apoe蛋白-感光微球”的第二復(fù)合物；

24、s2、分別用特定波長的光照射兩復(fù)合物，并檢測第一復(fù)合物的發(fā)光值rlu1和第二復(fù)合物的發(fā)光值rlu2，得到apoe4和apoe的檢測結(jié)果；

25、s3、計算apoe4與apoe比值。

26、在一些實施方式中，所述檢測方法還包括：根據(jù)apoe4的檢測結(jié)果rlu1和apoe的檢測結(jié)果rlu2的比值對待測樣本屬性進行判斷；

27、若apoe4與apoe比值≤0.1，則判斷所述待測樣本為陰性樣本；

28、若0.1＜apoe4與apoe比值≤0.5，則判斷所述待測樣本為apoe?ε4基因雜合子陽性樣本；

29、若apoe4與apoe比值＞0.5，則判斷所述待測樣本為apoe?ε4基因純合子陽性樣本。

30、在一些實施方式中，所述步驟s1中，第三抗體濃度≥第二抗體濃度。

31、本技術(shù)提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：

32、通過三種抗體分子的配合，能夠分別檢測“發(fā)光微球-apoe4亞型蛋白-感光微球”和“發(fā)光微球-apoe蛋白-感光微球”復(fù)合物的信號值，從而通過計算兩復(fù)合物信號值的比值實現(xiàn)apoe?ε4基因型的分型檢測，且樣本區(qū)分程度高，能夠滿足apoe4陰性樣本、雜合子樣本、純合子樣本的區(qū)分需求。該apoe?ε4基因型分型檢測方法不僅可以檢測無核酸信息的過往樣本，而且簡便高效，無需復(fù)雜且昂貴的檢測設(shè)備，易操作，高通量，成本低，能夠廣泛應(yīng)用于apoe4的臨床診斷，及時為醫(yī)生提供有關(guān)患者罹患腦淀粉樣變性和ad風(fēng)險的相關(guān)信息。

33、通過調(diào)節(jié)apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測試劑中所包含組分例如金屬鹽的類型及濃度、表面活性劑的類型及濃度等，能夠顯著改善apoe4檢測體系中的非特異性吸附，從而提升樣本區(qū)分度，滿足apoe4的光激化學(xué)發(fā)光檢測需求。

34、應(yīng)當理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本技術(shù)。