本發(fā)明涉及一種增強型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，屬于免疫熒光。

背景技術(shù)：

1、免疫熒光原位雜交技術(shù)（immunofluorescence?in?situ?hybridizationtechnique，immuno-fish），簡稱免疫?fish，是利用抗原與抗體反應(yīng)的原理，將特異性抗原或抗體定位于試驗細胞或細胞中的染色體上的一種常用標(biāo)記技術(shù)，用于對特異蛋白抗原或抗體在細胞或染色體上的分布、表達量等情況進行研究，以達到定量、定位檢測的效果。該技術(shù)已在人、小鼠、斑馬魚、果蠅等模式生物的染色體免疫熒光定位分析中有較多報道。

2、長期以來，熒光染料的淬滅，也就是染色后細胞或組織切片上熒光的衰減一直是困擾細胞或組織熒光染色的主要問題。熒光染料的淬滅原因主要有兩種：第一，染料本身的屬性。熒光衰減是一個不可避免的過程，熒光染料之間的衰減速度也差別很大。目前市場上常見的alexa?fluor系列染料如488、555、594和647等和傳統(tǒng)的染料比起來不僅亮度增加，而且衰減速度明顯變慢。第二，在顯微照相時顯微鏡的激發(fā)光尤其是共聚焦顯微鏡的激光會加速熒光染料的淬滅速度。這一點對于表達豐度很低的蛋白非常明顯，因為蛋白表達量低導(dǎo)致熒光信號很弱，在用共聚焦顯微鏡照相時往往需要加大激光能量輸出的強度而導(dǎo)致熒光信號迅速衰減。

3、熒光的減弱或淬滅不僅嚴(yán)重影響圖片的質(zhì)量（最佳分辨率低）和實驗結(jié)果的可靠性。目前市場上現(xiàn)有的大部分封片劑都不能解決強激發(fā)光或拍攝時間過長造成的熒光信號衰減的問題，即使有少部分抗熒光淬滅的封片劑也只對某些熒光染料有保護作用，做不到全覆蓋，且當(dāng)靶向蛋白的豐度過低時，這個問題尤其突出。因此，亟需研究出一種可以增強整體熒光亮度并減緩熒光染料的衰減的抗淬滅的封片劑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種增強型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，可以增強整體熒光亮度，在激發(fā)光下維持熒光的穩(wěn)定，從而實現(xiàn)對熒光信號更準(zhǔn)確的定量。

2、為達到上述目的，本發(fā)明是采用下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種增強型抗熒光淬滅的封片劑，每100ml封片劑中包括15~30ml酸堿緩沖液、10~20ml粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及0.1~1g增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。

4、可選的，所述酸堿緩沖液的ph范圍為7.0~9.0，其包括磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷中的一種或多種。

5、可選的，所述酸堿緩沖液為檸檬酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷的混合物。

6、可選的，所述粘度調(diào)節(jié)劑為甘油和/或聚乙二醇。

7、可選的，所述聚乙二醇為低分子量聚乙二醇、中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇中的一種或多種，其中，所述低分子量聚乙二醇的分子量為200、400、600和800，所述中分子量聚乙二醇的分子量為1000、1500、2000和4000，所述高分子量聚乙二醇的分子量為6000、8000、10000和20000。

8、可選的，所述抗熒光淬滅復(fù)合物中三乙烯二胺和乙二胺四乙酸的質(zhì)量比為1:?3~6。

9、可選的，所述增效劑為丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯經(jīng)二甲基亞砜溶解后的溶液。

10、第二方面，本發(fā)明提供一種增強型抗熒光淬滅的封片劑的制備方法，包括：

11、將酸堿緩沖液、粘度調(diào)節(jié)劑、抗熒光淬滅復(fù)合物以及蒸餾水混合得到溶液a；

12、將溶液a與增效劑混合得到增強型抗熒光淬滅的封片劑。

13、第三方面，本發(fā)明提供一種增強型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，包括：

14、細胞或組織用目標(biāo)第一抗體孵育結(jié)合，并進行熒光染色標(biāo)記操作；

15、將細胞或組織滴加于載玻片上，并將封片劑滴加在細胞或組織上，

16、在蓋玻片的下表面均勻涂抹密封劑以密封蓋玻片所有側(cè)面，并將其蓋于載玻片上，完成封片。

17、進一步的，在蓋上蓋玻片前還包括復(fù)染操作，所述復(fù)染操作包括向封片劑內(nèi)加入細胞核熒光染料，所述細胞核熒光染料為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，其濃度范圍為0.5~10μg/ml。

18、有益效果

19、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑可以強勁地穩(wěn)定細胞或組織樣品中的熒光表征，并大大提高捕獲熒光信號的敏感度，維持熒光染色樣品較長的時間保存，有效解決細胞或組織樣品中熒光染料的光穩(wěn)定性問題，大大提高捕獲的熒光信號的敏感度，從而為實現(xiàn)熒光信號更準(zhǔn)確的定量提供了保障，并且本發(fā)明的抗淬滅劑可以有效地減緩熒光染料在強激發(fā)光照射下的淬滅程度；

20、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑的復(fù)合配方獨特，其中，三乙烯二胺具有減緩熒光淬滅的作用，和聚乙二醇類物質(zhì)在試劑中起到催化作用；丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯作為高效、毒副作用小的抗氧化劑，有利于試劑和玻片的長期保存；

21、本發(fā)明所提供的抗熒光淬滅的封片劑的制備方法簡單便捷，經(jīng)濟性高，可廣泛應(yīng)用于細胞的熒光信號保護中，且利用本發(fā)明的封片劑在實施封片時使用方便，封片后即可成像拍照，在封片前加入細胞核熒光染料還可將封片與復(fù)染一步完成，省略了核染的步驟，節(jié)約了時間和成本。

技術(shù)特征：

1.一種增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，每100ml封片劑中包括15~30ml酸堿緩沖液、10~20ml粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及1~15ml增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述酸堿緩沖液的ph范圍為7.0~9.0，其包括磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液和三羥甲基氨基甲烷中的一種或多種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述酸堿緩沖液為檸檬酸緩沖液和三羥甲基氨基甲烷的混合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述粘度調(diào)節(jié)劑為甘油和/或聚乙二醇。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述聚乙二醇為低分子量聚乙二醇、中分子量聚乙二醇和高分子量聚乙二醇中的一種或多種，其中，所述低分子量聚乙二醇的分子量為200、400、600和800，所述中分子量聚乙二醇的分子量為1000、1500、2000和4000，所述高分子量聚乙二醇的分子量為6000、8000、10000和20000。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述抗熒光淬滅復(fù)合物中三乙烯二胺和乙二胺四乙酸的質(zhì)量比為1：3~6。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑，其特征在于，所述增效劑為丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯經(jīng)二甲基亞砜溶解后的溶液。

8.一種如權(quán)利要求1~7任一項所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑的制備方法，其特征在于，包括：

9.一種如權(quán)利要求1~7任一項所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，其特征在于，包括：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的增強型抗熒光淬滅的封片劑的封片方法，其特征在于，在蓋上蓋玻片前還包括復(fù)染操作，所述復(fù)染操作包括向封片劑內(nèi)加入細胞核熒光染料，所述細胞核熒光染料為4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，其濃度范圍為0.5~10μg/ml。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種增強型抗熒光淬滅的封片劑及其制備方法、封片方法，具體涉及免疫熒光技術(shù)領(lǐng)域，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中熒光染料在強激發(fā)光照射下迅速衰減等問題，其每100mL封片劑中包括15~30mL酸堿緩沖液、10~20mL粘度調(diào)節(jié)劑、0.5~5g抗熒光淬滅復(fù)合物以及1~15mL增效劑，其余為蒸餾水，其中，所述抗熒光淬滅復(fù)合物包括三乙烯二胺和乙二胺四乙酸。本發(fā)明所提供的封片劑可以增強整體熒光亮度，在激發(fā)光下維持熒光的穩(wěn)定，從而實現(xiàn)對熒光信號更準(zhǔn)確的定量。

技術(shù)研發(fā)人員：孫益軍,王月平,張峰,章春薺
受保護的技術(shù)使用者：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19