本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，提出了一種用于茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法。

背景技術(shù)：
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茶葉的農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直受到重視，各種檢測(cè)殘留的技術(shù)也層出不窮。有相當(dāng)一部分實(shí)驗(yàn)室具備了檢測(cè)多達(dá)數(shù)百種農(nóng)藥殘留的能力，但在實(shí)際操作中，由于茶葉基質(zhì)復(fù)雜，所含有機(jī)化學(xué)成分達(dá)450多種，無(wú)機(jī)礦物元素40多種，用次生代謝產(chǎn)物多，基質(zhì)效應(yīng)明顯，易對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)造成干擾。在進(jìn)行多殘留檢測(cè)時(shí)往往需要繁瑣的樣品提取與凈化步驟以去除干擾，使得前處理步驟繁瑣、檢測(cè)成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大。因此，開(kāi)發(fā)新型新處理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)真正意義上的快速篩查，具有十分重要的意義。

黃雪等（改進(jìn)的石墨烯分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中15種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留量[j]，食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017年第5期）中公開(kāi)了以石墨烯為吸附劑，建立分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定茶葉中多種氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥殘留量，其對(duì)茶葉樣品前處理是：準(zhǔn)確稱(chēng)取茶葉樣品1g(精確至0.01g)于50ml塑料離心管中，加入約5ml超純水，浸泡30rain后，準(zhǔn)確加入10ml乙腈和約4g氯化鈉，渦旋3min，離心，取上層乙腈約1ml，加入20mg石墨烯，渦旋1min，高速離心，取上層溶液過(guò)膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

專(zhuān)利cn106124674a公開(kāi)了一種快速測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的前處理方法及其定量分析方法，步驟如下：1)提?。簩⒉枞~浸泡于水中，加入乙腈提取農(nóng)藥殘留，然后加入醋酸鈉進(jìn)行鹽析使有機(jī)相和水相進(jìn)行相分離，所得乙腈層即為茶葉提取液；2)凈化：將步驟1)所得茶葉提取液中加入活性炭、n-丙基乙二胺和硫酸鎂進(jìn)行凈化，所得上清液即為快速測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測(cè)液；3)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法經(jīng)氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。

而本發(fā)明的樣品前處理與前二者有很大的同，首先是本發(fā)明中乙腈提取后，經(jīng)氮吹揮干乙腈后，轉(zhuǎn)換乙酸乙酯溶解殘?jiān)?，換相過(guò)程也是凈化過(guò)程，可有效去除部分雜質(zhì)；其次本發(fā)明采用無(wú)水氯化鈣+gcb+磁性石墨烯（或psa），無(wú)水氯化鈣可與茶葉中主要基質(zhì)成分多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、色素、部分生物堿等形成螯合物沉淀，有效去除相當(dāng)一部分雜質(zhì)，提高凈化效率，結(jié)合gcb+磁性石墨烯（或psa）進(jìn)一步凈化，相較其它凈化方式更為高效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提出一種用于茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的高效前處理方法，結(jié)合氣相色譜/電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，在1小時(shí)內(nèi)完成茶葉中百余種農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確可靠。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于茶葉中多種農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法，具體步驟為：

（1）提?。悍Q(chēng)取茶葉樣品，加入飽和氯化鈉溶液，渦旋30s混勻后，浸潤(rùn)5min，以乙腈高速均質(zhì)提取1min，4000rpm離心3min，殘?jiān)僖砸译鏈u動(dòng)提取，合并上清液；向上清液加入無(wú)水氯化鈣，渦旋30s，4000rpm離心3min，取上清液以氮?dú)獯抵两桑?/p>

（2）凈化：然后向步驟（1）得到的液體加入2ml乙酸乙酯，再加入rgo@fe3o4，再加入gcb或psa，渦旋30s；

（3）將步驟（2）得到的液體用磁鐵將固體物吸附至離心管底部與側(cè)壁或采用4000rpm離心3min；取1ml分離后的液體過(guò)0.22μm濾膜，得到用于測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測(cè)液。

其中步驟（1）中茶葉與飽和氯化鈉溶液的料液比為2:2~5，單位g/ml。

其中步驟（1）中茶葉與乙腈的料液比為2:5~10，單位g/ml；提取時(shí)間為3min。

其中步驟（1）中茶葉與無(wú)水氯化鈣的質(zhì)量比為2:1～5。

其中茶葉與rgo@fe3o4的質(zhì)量比為2:0.04~0.09。

其中茶葉與gcb的質(zhì)量比為2:0.1~0.2。

其中茶葉與psa的質(zhì)量比為2:0.1~0.2。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：

（1）本發(fā)明相對(duì)于傳統(tǒng)quechers方法及其它茶葉檢測(cè)中常用的方法相比，在提取過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)在于：a、提取與凈化效果更好。經(jīng)采用陽(yáng)性樣品比較，本法比傳統(tǒng)的quechers方法提取回收率高25～40%，且凈化效果更好（如圖2所示）；b、高效普適。本發(fā)明在不超過(guò)20min內(nèi)即可滿足166種農(nóng)藥的前處理要求（進(jìn)一步驗(yàn)證后還可擴(kuò)大化合物種類(lèi)），操作簡(jiǎn)便，對(duì)試劑消耗少。

（2）本發(fā)明前處理方法結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(gc-ms/ms)對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行分離檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，快速有效，結(jié)果可靠，對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的茶葉樣品，凈化效果良好，準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。

（3）本發(fā)明采用的無(wú)水氯化鈣+gcb+磁性石墨烯（或psa）相較其它凈化方式更為高效。如圖3所示，由圖可見(jiàn)，無(wú)水氯化鈣+gcb+磁性石墨烯（或psa）可起到很好的凈化效果。這是因?yàn)殁}離子可與茶葉中主要基質(zhì)成分多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、色素、部分生物堿等形成螯合物沉淀，有效去除相當(dāng)一部分雜質(zhì)。而單純使用gcb、psa、石墨烯、gcb+psa或gcb+石墨烯效果均不如無(wú)水氯化鈣+gcb+磁性石墨烯（或psa）理想。在色譜分離領(lǐng)域，活性炭因活性位點(diǎn)多、作用力復(fù)雜，導(dǎo)致回收率低且不穩(wěn)定，而gcb相比優(yōu)勢(shì)明顯?；衔镌趃cb上吸附和洗脫規(guī)律較容易掌握，且gcb對(duì)色素吸附力很強(qiáng)，只要樣品經(jīng)過(guò)gcb處理后肉眼仍可辨別出顏色，就不會(huì)對(duì)樣品中農(nóng)藥殘留回收率有影響。

附圖說(shuō)明

圖1為農(nóng)藥數(shù)據(jù)庫(kù)檢索流程圖。

圖2不同方法凈化效果比較圖：圖a為本發(fā)明方法，圖b為傳統(tǒng)quechers方法。

圖3為不同凈化方式的效果對(duì)比：其中各個(gè)編號(hào)具體樣品信息如下：

圖3中的a圖中：a-1為提取液氮吹干后加入2ml乙酸乙酯（其中未添加無(wú)水氯化鈣）；b-1為a-1中加入gcb；c-1為a-1中加入psa；d-1為a-1中加入rgo@fe3o4；e-1為a-1中加入gcb+psa；f-1為a-1中加入gcb+rgo@fe3o4；

圖3中b圖中：a-2為a-1處理中添加無(wú)水氯化鈣；b-2為a-2中加入gcb；c-2為a-2中加入psa；d-2為a-2中加入rgo@fe3o4；e-2為a-2中加入gcb+psa；f-2為a-2中加入gcb+rgo@fe3o4。

圖4為不同無(wú)水氯化鈣添加順序的前處理方法得到的凈化結(jié)果：

圖4中a表示的是均質(zhì)提取前添加無(wú)水氯化鈣，b表示的是均質(zhì)提取后添加無(wú)水氯化鈣，c表示的是凈化后離心分離后添加無(wú)水氯化鈣。

圖5為不同無(wú)水氯化鈣添加順序的前處理方法得到的檢測(cè)結(jié)果：

圖5中a表示的是均質(zhì)提取前添加無(wú)水氯化鈣，b表示的是均質(zhì)提取后添加無(wú)水氯化鈣；

圖6添加無(wú)水氯化鈣與無(wú)水硫酸鎂的凈化結(jié)果對(duì)比圖：

其中a表示為提取液中加入140mggcb，離心后取上清液；b表示為a中添加2g無(wú)水mgso4；c表示為a中添加2g無(wú)水cacl2。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步公開(kāi)而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與材料

乙腈、乙酸乙酯、氯化鈉、無(wú)水無(wú)水氯化鈣、磁性石墨烯（rgo@fe3o4）、石墨化炭黑（gcb）、n-丙基乙二胺固相吸附劑（psa）。

農(nóng)藥殘留標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥97%，購(gòu)自dr.ehrenstorfergmbh公司。

實(shí)驗(yàn)儀器

agilent7890a/7200gc-qtof/ms氣相色譜/電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配7693自動(dòng)進(jìn)樣器、agilentmasshunter工作站。

樣品前處理

（1）稱(chēng)取2g茶葉樣品，加入2～5ml飽和氯化鈉溶液，渦旋30s混勻后，浸潤(rùn)5min，以5～10ml乙腈渦旋提取3min，4000rpm離心3min，殘?jiān)僖砸译鏈u動(dòng)提取，合并上清液；向上清液加入1～5g無(wú)水氯化鈣，渦旋30s，4000rpm離心3min，取上清液以氮?dú)獯抵两桑?/p>

（2）然后向步驟（1）得到的液體加入2ml乙酸乙酯，再加入40～90mgrgo@fe3o4，再加入100～200mggcb或100～200mgpsa，渦旋30s；，用磁鐵將固體物吸附至離心管底部與側(cè)壁或4000rpm離心3min；

（3）取1ml步驟（2）得到的有機(jī)相過(guò)0.22μm濾膜，得到用于測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測(cè)液。

定量分析

（1）樣品前處理；

（2）以乙酸乙酯配制濃度依次為5、10、20、50、100μg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下測(cè)，以目標(biāo)化合物定量離子峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)建立線性標(biāo)準(zhǔn)曲線；

（3）將步驟(1)所得快速測(cè)定茶葉中農(nóng)藥殘留的待測(cè)液用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析，分別根據(jù)出峰時(shí)間和定性定量離子對(duì)確定農(nóng)藥種類(lèi)，并將其峰面積分別代入對(duì)應(yīng)農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得到待測(cè)液中各種農(nóng)藥的含量。

氣相色譜條件

色譜柱：vf-1701ms柱（30m×0.25mm，0.25μm）；色譜柱升溫程序：40℃保持1min，然后以30℃/min的升溫速率升至130℃，再以5℃/min升溫至250℃，而后以10℃/min升溫至300℃，保持5min；載氣為高純氦氣，流速為1.2ml/min；進(jìn)樣口溫度：290℃；進(jìn)樣量：1μl，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件

離子源：ei源；離子化能量：70ev；離子源溫度：250℃；氣相色譜與質(zhì)譜接口溫度：280℃；溶劑延遲：5min；掃描方式：全掃描與ms/ms掃描；一級(jí)質(zhì)量掃描范圍：50～600amu，采集速率2spectra/s；二級(jí)質(zhì)量掃描范圍：50～400，采集速率200ms/spectra；m/z分辨率為13500（fwhm）；環(huán)氧七氯校正保留時(shí)間。

數(shù)據(jù)庫(kù)建立與檢索

采用全掃描模式針對(duì)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品建立一級(jí)精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫(kù)，包括每種農(nóng)藥的保留時(shí)間、特征分子離子式與相應(yīng)的精確質(zhì)量數(shù)，每種農(nóng)藥包含3～5個(gè)特征分子離子。

對(duì)每種農(nóng)藥采集最佳cid（誘導(dǎo)碰撞解離）下的二級(jí)質(zhì)譜圖，每種農(nóng)藥選擇1個(gè)豐度最高（當(dāng)豐度最高的離子質(zhì)量數(shù)較低時(shí)，為獲取準(zhǔn)確的二級(jí)質(zhì)譜信息，采用豐度次高但質(zhì)量數(shù)較大的特征離子作為母離子）的特征離子作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜采集。

農(nóng)藥檢索流程見(jiàn)圖1。

結(jié)果分析

2.1凈化方法的比較

本發(fā)明對(duì)所使用的各種凈化材料無(wú)水氯化鈣、gcb、磁性石墨烯及psa的凈化效果及不同材料的組合效果進(jìn)行了探討。結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖中可見(jiàn)，單獨(dú)的一種材料或常見(jiàn)的gcb+psa凈化均不能起到良好的凈化效果，本發(fā)明提出的無(wú)水氯化鈣+gcb+磁性石墨烯（或psa）效果最為理想。

本發(fā)明還對(duì)添加無(wú)水氯化鈣的操作節(jié)點(diǎn)進(jìn)行了探討。分別選擇均質(zhì)前（本發(fā)明方案中步驟（1）提取之前加入）、均質(zhì)后（本發(fā)明方案）以及離心分離后（本發(fā)明方案中步驟（3）離心分離后添加）等3個(gè)節(jié)點(diǎn)添加無(wú)水氯化鈣。從圖4凈化結(jié)果來(lái)看，在均質(zhì)前、后添加的效果基本相當(dāng)，而離心后添加凈化效果相對(duì)較差。但是對(duì)均質(zhì)前和均質(zhì)后兩種添加無(wú)水cacl2方式的結(jié)果進(jìn)行上機(jī)對(duì)比檢測(cè)結(jié)果，圖5為其中23種代表性農(nóng)藥殘留的檢測(cè)效果圖。從圖5中可以看出，均質(zhì)后添加無(wú)水cacl2的提取效率要比較高，而且凈化效果也比較好，故選擇在均質(zhì)后添加無(wú)水cacl2。

有多種金屬離子可以與多酚類(lèi)等化合物螯合甚至生成不溶絡(luò)合物，經(jīng)典的quechers方法中，通常采用無(wú)水硫酸鎂作為吸水劑。本發(fā)明也比較了無(wú)水氯化鈣與無(wú)水硫酸鎂的效果。在提取液中加入gcb后，分別加入無(wú)水氯化鈣與無(wú)水硫酸鎂，從圖6中可以看出，使用無(wú)水氯化鈣的效果比無(wú)水硫酸鎂更好。

基質(zhì)效應(yīng)考察

農(nóng)藥分析的基質(zhì)效應(yīng)是指樣品中除分析物之外其它基質(zhì)成分對(duì)待測(cè)物測(cè)定值的影響。在氣相色譜分析中，由于基質(zhì)成分的存在減少了色譜系統(tǒng)中活性位點(diǎn)與待測(cè)物分子作用的機(jī)會(huì)，通常會(huì)表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。茶葉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量多酚類(lèi)、脂質(zhì)、植物堿、糖類(lèi)等。需要開(kāi)發(fā)有效的凈化方法以去除基質(zhì)干擾。

本發(fā)明對(duì)開(kāi)發(fā)的高效凈化方法對(duì)166種農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)。采集未施藥的茶青制成成品，經(jīng)檢測(cè)未檢出含有農(nóng)藥殘留。以此樣品作為空白樣品，按1.3步驟進(jìn)行樣品前處理，獲得待測(cè)液，以此配制濃度為20μg/l的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，與同濃度的純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，基質(zhì)效應(yīng)按以下公式計(jì)算：基質(zhì)效應(yīng)me（%）=|（a2-a1）|/a1×100%，其中a1為乙酸乙酯溶液中農(nóng)藥的響應(yīng)值，a2為茶葉空白樣品溶液中農(nóng)藥的響應(yīng)值。

表1基質(zhì)效應(yīng)考察

基質(zhì)效應(yīng)處于0～20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，20～50%為中等基質(zhì)效應(yīng)，大于50%為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)，由表1可見(jiàn)，本發(fā)明開(kāi)發(fā)的前處理方法能有效去除茶葉樣品的基質(zhì)干擾。

回收率和精密度

按1.3步驟所述的樣品前處理方法，對(duì)空白茶葉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)。加標(biāo)量為20μg/kg，以3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的平均值作為回收率數(shù)據(jù)，以其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（rsd）值作為精密度數(shù)據(jù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2方法的回收率和精密度