本發(fā)明屬于藥品檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種復(fù)生康片中莪術(shù)的薄層色譜檢測方法。

背景技術(shù)：

復(fù)生康片是以蒲葵子、喜樹果、莪術(shù)、柴胡、絞股藍、香菇、黃芪和甘草八味中藥配伍而成，功能主治活血化瘀、健脾消積，用于胃癌、肝癌，能增強療效、化療的療效，并能增強機體免疫功能，改善肝癌患者臨床癥狀。復(fù)生康作為一種抗癌中藥口服制劑，是全國獨家生產(chǎn)的純中藥抗惡性腫瘤藥物，應(yīng)具有重現(xiàn)性好、專屬性強的質(zhì)量檢測方法。

中藥莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)、溫郁金的干燥根莖，首載于《藥性論》。主要含有揮發(fā)油、姜黃素以及多糖類成分，具有行氣破血、消積止痛之功效，主要發(fā)揮抗腫瘤、抗血栓、抗病毒等作用，是復(fù)生康中的重要成分。

中華人民共和國國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的“國家食品藥品監(jiān)督管理局標準ybz09712008復(fù)生康片”于2008年9月28日起試行。該標準中規(guī)定了莪術(shù)的薄層色譜鑒別方法：取本品15片，研細，加乙醚10ml，超聲處理15分鐘，靜置30分鐘，吸取上清液作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材1g，加乙醚3ml，同法制得對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點在同一硅膠g薄層板上，在展開劑中預(yù)飽和30分鐘，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（9:1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同顏色的斑點。但在實際檢驗操作過程中發(fā)現(xiàn)該薄層色譜檢測方法存在對照品色譜斑點不清晰、供試品斑點不顯現(xiàn)、不清晰的問題，造成檢測結(jié)果假陰性，從而導(dǎo)致不能及時、準確地鑒別出復(fù)生康片樣品中莪術(shù)成分，造成復(fù)生康片成品出庫滯后，并由此帶來了經(jīng)濟上的損失。因此迫切需要一種更準確、高效的莪術(shù)檢測方法來保證復(fù)生康片產(chǎn)品的質(zhì)量。

此外標準莪術(shù)薄層色譜鑒別方法使用乙醚超聲處理樣品，存在以下幾個問題：（1）乙醚在玻璃器皿中容易糊化，造成過濾難度高；（2）超聲提取后的濾液需要揮發(fā)除去乙醚，因樣品中含有水，難以掌握乙醚最終的揮發(fā)程度，造成樣品成分提取不充分或重復(fù)性不好；（3）乙醚屬于易制毒有機溶劑，對試驗人員身體有一定危害：長期低濃度吸入可引起頭疼、頭暈、疲倦、嗜睡、蛋白尿、紅細胞增多等不良癥狀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種專屬性強、重現(xiàn)性好、安全、準確性高的復(fù)生康片中莪術(shù)的薄層色譜檢測方法，以使所得圖譜達到清晰度高、分離度好、斑點明顯、重現(xiàn)性好的要求。

本發(fā)明的方法包括以下步驟：

（1）供試品溶液的制備：取復(fù)生康成品15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液；

（2）對照藥材溶液的制備：取莪術(shù)對照藥材0.4g，同供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液；

（3）薄層色譜展開：吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠薄層板上，石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸按體積比（92-94）:5:（1-3）作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰；

（4）結(jié)果判定：如果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的主斑點，則說明復(fù)生康成品中含有莪術(shù)成分；而如果供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，若未顯示相同顏色的主斑點，則說明復(fù)生康成品中不含有莪術(shù)成分。

本發(fā)明的有益效果在于：（1）使用乙酸乙酯回流加熱處理樣品代替了使用乙醚超聲處理樣品，一方面解決了樣品糊化、黏附、過濾困難的問題，另一方面還減少了對人體健康的潛在危害；（2）顯色結(jié)果準確：斑點清晰、重現(xiàn)性好、準確性高；（3）改進后的樣品處理方法保證了與莪術(shù)藥材制劑過程的一致性，能更加準確、真實地反應(yīng)出樣品中莪術(shù)的含量。

附圖說明

圖1是對比例1的薄層展開圖。

圖2是對比例2的薄層展開圖。

圖3是對比例3的薄層展開圖。

圖4是對比例4的薄層展開圖。

圖5是對比例5的薄層展開圖。

圖6是對比例6的薄層展開圖。

圖7是對比例7的薄層展開圖。

圖8是對比例8的薄層展開圖。

圖9是實施例1的薄層展開圖。

圖10是實施例2的薄層展開圖。

圖11是實施例3的薄層展開圖。

圖12是實施例4的薄層展開圖。

圖13是實施例5的薄層展開圖。

圖14是實施例6的薄層展開圖。

圖15是實施例7的薄層展開圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖并通過對比例和具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。

以下復(fù)生康片的生產(chǎn)廠家均為青島華仁太醫(yī)藥業(yè)有限公司，對照藥材莪術(shù)（溫郁金）均由中國食品藥品檢定研究院供，批號：121304-201303；薄層板：預(yù)制硅膠g薄層板，規(guī)格為20cm×10cm，未特別注明均由默克化工技術(shù)（上海）有限公司提供。

對比例1：標準莪術(shù)薄層色譜鑒別方法。

取復(fù)生康片15片，研細，加乙醚10ml，超聲處理15分鐘，靜置30分鐘，吸取上清液作為供試品溶液。取莪術(shù)對照藥材1g，加乙醚3ml，同法制得對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點同一硅膠g薄層板上，在展開劑中預(yù)飽和30分鐘，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（體積比9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖1所示：左側(cè)的莪術(shù)對照藥材（d）的色譜斑點不清晰，斑點分離度不好；右側(cè)的復(fù)生康供試品（g）色譜斑點不清晰，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，雜質(zhì)較多，難以找到對應(yīng)斑點，易造成檢測結(jié)果的假陰性。

對比例2：采用正己烷處理樣品。

取本品15片，研細，加正己烷10ml，超聲處理15分鐘，靜置30分鐘，吸取上清液作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材1g，加乙醚3ml，同法制得對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15ul，分別點同一硅膠g薄層板上，在展開劑中預(yù)飽和30分鐘，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（體積比9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖2所示：將乙醚更換為正己烷后對照藥材d色譜斑點不清晰；供試品斑點g不清晰，雜質(zhì)較多，主斑點位置與對照藥材對應(yīng)不明顯。

對比例3：采用石油醚處理樣品。

取復(fù)生康片15片，研細，加石油醚（60-90℃）10ml，超聲處理15分鐘，靜置30分鐘，吸取上清液作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材1g，加乙醚3ml，同法制得對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15ul，分別點同一硅膠g薄層板上，在展開劑中預(yù)飽和30分鐘，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖3所示：對照藥材（d）色譜與供試品色譜主要成分均未被提取出來，此方法不可用。

對比例4：采用乙酸乙酯處理樣品。

取復(fù)生康片15片，研細，加乙酸乙酯10ml，超聲處理15分鐘，靜置30分鐘，吸取上清液作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材1g，加乙醚3ml，同法制得對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15ul，分別點同一硅膠g薄層板上，在展開劑中預(yù)飽和30分鐘，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（體積比9:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖4所示：對照藥材（d）色譜斑點不清晰；供試品（g）色譜斑點不清晰，雜質(zhì)較多，在對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，不能完全對應(yīng)。

對比例5：采用加熱回流提取樣品莪術(shù)揮發(fā)油處理樣品。

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，以石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯（體積比9:1）展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖5所示：對照藥材（d）、供試品（1，2，3）色譜斑點可以完全顯現(xiàn)，但供試品斑點清晰度欠佳。

相對于原標準莪術(shù)薄層色譜鑒別方法，對比例4的方法經(jīng)乙酸乙酯回流處理樣品后的薄層色譜鑒別結(jié)果大有改善，對照品和供試品的色譜斑點可以完全顯現(xiàn)出來，相比較清晰度也有一定地提高。但需要在此基礎(chǔ)上改進展開劑條件，以提高色譜斑點的清晰度和分離度。

對比例6：采用石油醚（30-60℃）-乙酸乙酯-丙酮（94:5:1）為展開劑。

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，石油醚（30-60℃）-乙酸乙酯-丙酮（體積比94:5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖6所示：對照藥材（d）分離顯色較為明顯，但不清晰；供試品（g）色譜不清晰，雜質(zhì)較多。

對比例7：采用石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-丙酮（1:7:2）為展開劑。

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-丙酮（體積比1:7:2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖7所示：對照藥材（d）色譜斑點分離顯色不清晰；供試品（g）色譜斑點不清晰、分離效果差。

對比例8：采用環(huán)己烷-乙酸乙酯（85:15）為展開劑。

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，a環(huán)己烷-乙酸乙酯（體積比85:15）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖8所示：對照藥材（d）色譜斑點不清晰；供試品（g）色譜斑點分離效果差，不清晰。

實施例1：

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比94:5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖9所示：對照藥材（d）色譜斑點清晰，供試品（1）色譜斑點清晰，在與對照藥材色d色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的主斑點。

實施例2-4：

供試品溶液的制備：取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液，點樣量：15μl。

對照藥材溶液的制備：取莪術(shù)（溫郁金）對照藥材約0.4g，同供試品溶液的制備方法制成對照藥材溶液，點樣量：15μl。

薄層板：預(yù)制硅膠g薄層板，規(guī)格：20cm×10cm，默克化工技術(shù)（上海）有限公司（批號：hc43300156），青島海洋化工廠分廠（批號20160411）。

展開劑：石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比94:5:1），展距：上行展開8cm；

顯色：噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

檢視：日光下

其它展開條件：

實施例2：默克板，溫度24℃，相對濕度55%。

實施例3：海洋板，溫度24℃，相對濕度55%。

實施例4：默克板，溫度40℃，相對濕度75%。

結(jié)果分別如圖10-12所示：供試品（1）色譜中，在與莪術(shù)對照藥材（d）色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點；而且不同廠家的薄層板及不同的溫濕度條件，結(jié)果色譜圖中均斑點清晰、分離效果較好。

實施例5：

取復(fù)生康片15片，除去包衣，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比92:5:3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖13所示：對照藥材（d）色譜斑點清晰，供試品（y4）色譜斑點清晰，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的主斑點。

實施例6：

取復(fù)生康片15片，研細，置圓底燒瓶中，加水300ml，連接揮發(fā)油測定器，自測定器上端加水使充滿刻度部分，并溢流入燒瓶時為止，再加乙酸乙酯1ml，連接冷凝管，緩緩加熱至沸，保持微沸2小時，放冷，分取乙酸乙酯液，作為供試品溶液。另取莪術(shù)對照藥材0.4g，同法制成對照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各15μl，分別點于同一硅膠g薄層板上，石油醚（60-90℃）-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比93:5:2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以新制的香草醛試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。

薄層色譜鑒別結(jié)果如圖14所示：對照藥材（d）色譜斑點清晰，供試品（1和2）色譜斑點清晰，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的主斑點。

實施例7：專屬性驗證。

（1）空白制劑的制備：

取相當于50片成品量的黃芪（6.25g），粉碎成細粉，備用。

取相當于50片成品量的蒲葵子（15g）、柴胡（18.75g）、絞股藍（6.25g）、甘草（2g）加10倍量水煎煮二次，每次2小時，合并煎液，濾過。濃縮至相對密度為1.04-1.05（80℃）的清膏，冷卻至室溫，加乙醇至含醇量達63%，攪勻，密閉，靜置12h以上，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.38~1.41（80℃）的稠膏。

取相當于50片成品量的香菇（4.5g），加8倍量水煎煮三次，每次1小時，濾過，合并濾液，濃縮至相對密度為1.38~1.41（80℃）的稠膏。

取相當于50片成品量的喜樹果（13.75g），用80%乙醇作溶劑，浸漬24小時后，滲漉，收集漉液，濃縮至相對密度為1.38-1.41（80℃）的稠膏。

空白制劑加入相當于50片成品量的清膏、輔料。

空白制劑（不含莪術(shù)）：取①項下細粉，加②、③、④項下稠膏和磷酸氫鈣3.5g，混勻，于50-60℃干燥成干膏，粉碎成細粉，混勻，即得。

取成品15片、相當于成品15片的空白制劑，按照實施例1中方法進行薄層試驗。

（2）供試品和莪術(shù)對照藥材試驗方法同實施例1。

結(jié)果如圖15所示，供試品（1）色譜中，在與莪術(shù)對照藥材（d）色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點，陰性對照（2）無干擾。

以上所述實施例僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。