本發(fā)明涉及檢測(cè)分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

甘膽酸(cholyglycine，簡稱cg)，別名n-(3,7,12-三羥基-24-羰基膽烷-24-基)-甘氨酸，是膽酸與甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸之一。甘膽酸是由肝細(xì)胞合成，同膽汁進(jìn)入腸道，經(jīng)門靜脈再回到肝臟；當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，肝細(xì)胞攝取甘膽酸的能力下降，致使血液中甘膽酸含量增加，因此，測(cè)定甘膽酸含量可以作為評(píng)價(jià)肝細(xì)胞功能及肝膽系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)功能的敏感指標(biāo)之一，也是肝病患者肝功能受損程度及肝病治療恢復(fù)效果評(píng)價(jià)的靈敏度及特異性較好的指標(biāo)之一。

目前，我國乙型肝炎病毒感染者較多，臨床上各類肝炎患者的數(shù)量巨大，乙型肝炎病毒感染者治療不當(dāng)可能會(huì)引起肝硬化等疾病，而甘膽酸含量的測(cè)定是診斷乙型肝炎病毒感染和肝硬化的一個(gè)重要依據(jù)。而且，肝硬化患者血清中甘膽酸(cg)含量與肝硬化代償期分級(jí)呈顯著正相關(guān)，cg含量指標(biāo)在判斷肝硬化進(jìn)展及預(yù)后方面優(yōu)于ggt(谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)、afp(甲胎蛋白)、ast(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、alt(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)和血液alb(白蛋白)含量指標(biāo)，因此，cg含量測(cè)定對(duì)肝硬化預(yù)后評(píng)估價(jià)值較大。

近年來，常用的體外定量測(cè)定甘膽酸的方法主要有放射免疫法(ria)、酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)、化學(xué)發(fā)光免疫法(cl)等。雖然這些方法準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，但是其同時(shí)還均存在較多缺陷，如酶聯(lián)免疫吸附法操作繁瑣、耗時(shí)較長，不利于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開展，臨床應(yīng)用局限性明顯；化學(xué)發(fā)光免疫法需要借助于復(fù)雜的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，不利于推廣使用；放射免疫法存在放射性污染、有效期較短且操作極為不便。因此，建立一種操作簡單快捷、成本低廉的定量測(cè)定甘膽酸的檢測(cè)分析方法對(duì)于臨床中相關(guān)疾病的診斷及監(jiān)控具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠簡便快捷、準(zhǔn)確的定量測(cè)定血清中的甘膽酸。

本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a)將血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測(cè)樣；

其中，甘膽酸熒光標(biāo)記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成；

所述甘膽酸衍生物具有式(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)：

所述甘膽酸熒光標(biāo)記物具有式(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)：

甘膽酸多克隆抗體是由所述甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)對(duì)所述檢測(cè)樣進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得偏振光強(qiáng)度；

c)根據(jù)所述偏振光強(qiáng)度與預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

優(yōu)選的，所述步驟a)中，甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度為1∶6500；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸多克隆抗體稀釋到一定稀釋度的稀釋液；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度為1∶750。

優(yōu)選的，所述步驟c)中，預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線通過以下方式獲得：

用pbs緩沖液將甘膽酸配制成系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液；

對(duì)所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的系列總混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列總混合液的系列偏振光強(qiáng)度mp；

對(duì)pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的總空白液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得總空白液的偏振光強(qiáng)度mp0；

根據(jù)mp/mp0的比值和相應(yīng)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，獲得甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

優(yōu)選的，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/l，ph值為7.0～8.5；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液中，硼酸鹽緩沖液的濃度為1～8mmol/l，ph值為7.0～8.5。

優(yōu)選的，所述pbs緩沖液的濃度為0.01mol/l，ph值為7.4。

優(yōu)選的，所述步驟a)中，血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10。

優(yōu)選的，所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合孵育時(shí)，甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10；

pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合孵育時(shí)，pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比為1：10：10。

優(yōu)選的，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物通過以下方式獲得：

將所述甘膽酸衍生物、n-羥基琥珀酰亞胺、二環(huán)己基二亞胺溶于二甲基甲酰胺中，形成混合液；

將所述混合液與4-胺甲基熒光素混合反應(yīng)，得到反應(yīng)液；

第一次以體積比為4∶1的chcl3和ch3oh的混合物為展開劑，第二次以ch2cl2為展開劑，采用tlc薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行兩次薄層層析和分離提純，得到甘膽酸熒光標(biāo)記物。

優(yōu)選的，在采用tlc薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析和分離提純后，用甲醇萃取，得到具有不同rf值的分離物，選擇rf值為0.47的分離物為甘膽酸熒光標(biāo)記物。

優(yōu)選的，所述步驟a)中，甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度通過以下方式獲得：

用硼酸鹽緩沖液將所述甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋成系列稀釋度的標(biāo)記物供試液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列稀釋度的標(biāo)記物供試液的偏振光強(qiáng)度；

以硼酸鹽緩沖液為空白溶液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得空白溶液的偏振光強(qiáng)度；

選擇偏振光強(qiáng)度為空白溶液偏振光強(qiáng)度10～15倍的標(biāo)記物供試液的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度；

所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度通過以下方式獲得：

用硼酸鹽緩沖液將甘膽酸多克隆抗體稀釋成系列稀釋度的抗體供試液，分別與所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液混合、孵育，得到系列抗體-標(biāo)記物混合液；

分別對(duì)所述系列抗體-標(biāo)記物混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度；

根據(jù)系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度和相應(yīng)的抗體供試液的稀釋度，獲得抗體供試液曲線；

選擇抗體供試液曲線中最大偏振光強(qiáng)度的70％為標(biāo)準(zhǔn)偏振值，以所述標(biāo)準(zhǔn)偏振值所對(duì)應(yīng)的稀釋度為甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度。

本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法，a)將血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測(cè)樣；其中，甘膽酸熒光標(biāo)記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成；所述甘膽酸衍生物具有式(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)；所述甘膽酸熒光標(biāo)記物具有式(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)；甘膽酸多克隆抗體是由所述甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；b)對(duì)所述檢測(cè)樣進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得偏振光強(qiáng)度；c)根據(jù)所述偏振光強(qiáng)度與預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠簡便快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定血清中甘膽酸的濃度；而且，采用本發(fā)明檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)，在線檢測(cè)干擾因素少、線性范圍寬、靈敏度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的線性范圍為884.49～7655.74ng/ml，決定系數(shù)r²＝0.9992，ic50＝2602.20ng/ml，最低檢測(cè)限為480.28ng/ml，其線性范圍寬，檢出限低，靈敏度高；而且交叉反應(yīng)率低、特異性高；且其準(zhǔn)確度高；同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡便易行，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備，是一種易于高通量檢測(cè)且低成本的檢測(cè)方法。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為實(shí)施例1中不同rf值的分離物在加入抗體前后的熒光偏振檢測(cè)結(jié)果圖；

圖2為實(shí)施例1中抗體供試液曲線圖；

圖3為實(shí)施例1中甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖4為實(shí)施例3中兩種檢測(cè)方法的效果對(duì)比圖；

圖5為實(shí)施例4中不同人群血清中甘膽酸含量的測(cè)試對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種定量測(cè)定血清中甘膽酸的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a)將血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測(cè)樣；

其中，甘膽酸熒光標(biāo)記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成；

所述甘膽酸衍生物具有式(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)：

所述甘膽酸熒光標(biāo)記物具有式(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)：

甘膽酸多克隆抗體是由所述甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清；

b)對(duì)所述檢測(cè)樣進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得偏振光強(qiáng)度；

c)根據(jù)所述偏振光強(qiáng)度與預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

采用本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠簡便快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定血清中甘膽酸的濃度；而且，采用本發(fā)明檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)，在線檢測(cè)干擾因素少、線性范圍寬、靈敏度高，是一種易于高通量檢測(cè)且低成本的檢測(cè)方法。

按照本發(fā)明，將血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液混合、孵育，得到檢測(cè)樣。

血清可通過凝血后提取析出液或者離心等方式獲得，本發(fā)明中，血清待測(cè)樣優(yōu)選通過離心血液的方式獲得；在一些實(shí)施例中，可將抽取的血液在4℃及3000rpm下離心10min而獲得血清待測(cè)樣。

本發(fā)明中，甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液中的甘膽酸熒光標(biāo)記物由甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素(即amf)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成；其中，甘膽酸衍生物具有式(ⅰ)所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明中，所述式(ⅰ)所示甘膽酸衍生物優(yōu)選通過以下方式獲得：在三乙胺和氯甲酸異丁酯的催化作用下，將溶于四氫呋喃的膽酸與4-氨基丁酸發(fā)生反應(yīng)，得到甘膽酸衍生物。在一些實(shí)施例中，具體可通過以下方式獲得：s1)將膽酸、三乙胺、氯甲酸異丁酯和四氫呋喃混合攪拌，得到澄清混合液；s2)將所述澄清混合液與4-氨基丁酸混合反應(yīng)，得到反應(yīng)混合物；s3)去除所述反應(yīng)混合物中的四氫呋喃溶劑后，調(diào)整ph至酸性，再用乙酸乙酯萃取，之后進(jìn)行分離提純，獲得式(ⅰ)所示甘膽酸衍生物。

本發(fā)明中，甘膽酸熒光標(biāo)記物由式(ⅰ)所示的甘膽酸衍生物與4-胺甲基熒光素經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)形成，所得甘膽酸熒光標(biāo)記物具有式(ⅱ)所示結(jié)構(gòu)：

本發(fā)明中，所述式(ⅱ)所示甘膽酸熒光標(biāo)記物優(yōu)選通過以下方式獲得：

s1)將甘膽酸衍生物、n-羥基琥珀酰亞胺(即nhs)、二環(huán)己基碳二亞胺(即dcc)溶于二甲基甲酰胺(即dmf)中，形成混合液；

s2)將所述混合液與4-胺甲基熒光素(即amf)混合反應(yīng)，得到反應(yīng)液；

s3)以體積比為4∶1∶4的chcl3、ch3oh與ch2cl2的混合物為展開劑，采用tlc薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行薄層層析和分離提純，得到甘膽酸熒光標(biāo)記物。

其中，步驟s1)中，甘膽酸衍生物、n-羥基琥珀酰亞胺和二環(huán)己基碳二亞胺的質(zhì)量比優(yōu)選為(1～5)∶(1～5)∶(1～10)。步驟s1)中的甘膽酸衍生物與步驟s2)中的4-胺甲基熒光素的質(zhì)量比優(yōu)選為(1～5)∶1。

本發(fā)明中，所述步驟s3)中利用tlc薄層色譜純化方法進(jìn)行薄層層析和分離提純后，形成具有不同rf值的條帶，優(yōu)選利用甲醇進(jìn)行萃取溶解，得到具有不同rf值的分離物，優(yōu)選選擇rf值為0.47的分離物為甘膽酸熒光標(biāo)記物。

tlc是一種薄層色譜純化方法，將欲分離的樣品點(diǎn)在薄層板上，利用適宜的展開劑或?qū)游鲆赫归_，使樣品中的成分得以分離，在薄層板上形成具有不同rf值的條帶。本發(fā)明的一些實(shí)施例中，第一次以體積比為4∶1的chcl3和ch3oh的混合物為展開劑，第二次以ch2cl2為展開劑，采用tlc薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行兩次薄層層析和分離提純，形成了rf值分別為0.97、0.86和0.47的條帶，利用甲醇萃取后，得到了rf值分別為0.97、0.86和0.47的分離物，最終選擇rf值為0.47的分離物為甘膽酸熒光標(biāo)記物。

本發(fā)明中，優(yōu)選通過以下方式從不同rf值的分離物中篩選合適的甘膽酸熒光標(biāo)記物：將具有不同rf值的分離物分別與甘膽酸多克隆抗體混合，并進(jìn)行熒光偏振檢測(cè)，選擇熒光偏振值顯著增加的體系中所對(duì)應(yīng)的rf值分離物作為甘膽酸熒光標(biāo)記物。本發(fā)明通過標(biāo)記物與抗體的結(jié)合測(cè)試來篩選甘膽酸熒光標(biāo)記物，若標(biāo)記物與抗體發(fā)生結(jié)合，會(huì)形成大分子抗原抗體復(fù)合物，體系的熒光偏振值顯著增加，相反，若標(biāo)記物與抗體不發(fā)生結(jié)合，則熒光偏振值變化不大，通過以上方式篩選出合適的甘膽酸熒光標(biāo)記物。

本發(fā)明以式(ⅰ)所示的甘膽酸衍生物為半抗原，并選擇4-胺甲基熒光素與所述半抗原結(jié)合制備甘膽酸熒光標(biāo)記物，能夠使檢測(cè)方法具有高靈敏度。

本發(fā)明中，在獲得甘膽酸熒光標(biāo)記物后，確定具有合適稀釋度的甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液。

本發(fā)明中，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液優(yōu)選為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋到一定稀釋度的稀釋液；所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度優(yōu)選為1∶6500。稀釋度是指稀釋前樣品體積與稀釋后樣品體積的比例，如稀釋度1∶10是指將1體積份的樣品與稀釋劑混合，使體積擴(kuò)大至10體積份。

本發(fā)明中，所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度優(yōu)選通過以下方式獲得：s1)用硼酸鹽緩沖液將所述甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋成系列稀釋度的標(biāo)記物供試液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列稀釋度的標(biāo)記物供試液的偏振光強(qiáng)度；s2)以硼酸鹽緩沖液為空白溶液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得空白溶液的偏振光強(qiáng)度；步驟s1)與步驟s2)沒有順序限制；s3)選擇偏振光強(qiáng)度為空白溶液偏振光強(qiáng)度10～15倍的標(biāo)記物供試液的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度。在一些實(shí)施例中，所述系列稀釋度的標(biāo)記物供試液的稀釋度可以分別為1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶6500和1∶7000；在一些實(shí)施例中，可以根據(jù)系列稀釋度的標(biāo)記物供試液的偏振光強(qiáng)度和標(biāo)記物供試液的稀釋度繪制標(biāo)記物供試液曲線，將10～15倍于空白溶液偏振光強(qiáng)度的熒光偏振值與所得標(biāo)記物供試液曲線比對(duì)，選擇相應(yīng)的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度。在一些實(shí)施例中，選擇偏振光強(qiáng)度為空白溶液偏振光強(qiáng)度11倍的標(biāo)記物供試液的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度。

本發(fā)明中，在稀釋甘膽酸熒光標(biāo)記物時(shí)，所用硼酸鹽緩沖液稀釋劑的濃度優(yōu)選為1～8mmol/l，ph值優(yōu)選為7.0～8.5。

本發(fā)明中，甘膽酸多克隆抗體工作溶液中的甘膽酸多克隆抗體是由所述式(ⅰ)所示甘膽酸衍生物與牛血清蛋白偶聯(lián)所得的免疫抗原免疫兔子后所得的抗血清。

其中，所述免疫抗原優(yōu)選通過以下方式獲得：

s1)將式(ⅰ)所示甘膽酸衍生物、n,n-二甲基甲酰胺、三正丁胺和氯甲酸異丁酯混合，得到a液；

將碳酸鹽緩沖液、n,n-二甲基甲酰胺和牛血清蛋白混合，得到b液；

s2)將a液與b液混合，攪拌過夜后，用磷酸鹽緩沖液(即pbs緩沖液)透析，得到免疫抗原。

得到免疫抗原后，用所述免疫抗原免疫兔子制取甘膽酸多克隆抗體，其過程優(yōu)選如下：

s1)用pbs緩沖液將所得免疫抗原配制成免疫抗原溶液；

將所述免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑混合乳化，得到乳液?。?/p>

將所述免疫抗原溶液與弗氏不完全佐劑混合乳化，得到乳液ⅱ；

s2)采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)兔子注射乳液ⅰ，即首次免疫；首次免疫兩周后，采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)兔子注射乳液ⅱ，即首次加強(qiáng)免疫；之后，每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫四次，于最后一次加強(qiáng)免疫一周后對(duì)兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液離心分離，取上清液，即為甘膽酸多克隆抗體。

在一些實(shí)施例中，用免疫抗原免疫兔子制取甘膽酸多克隆抗體的具體過程如下：用濃度為0.01mol/l、ph值為7.4的pbs緩沖液將所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液；將所述免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，得到乳液ⅰ；將所述免疫抗原溶液與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，得到乳液ⅱ；采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)兔子注射2ml乳液ⅰ，即首次免疫；首次免疫兩周后，采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)兔子注射2ml乳液ⅱ，即首次加強(qiáng)免疫；之后，每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫四次，于最后一次加強(qiáng)免疫一周后對(duì)兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液于4℃下過夜后，再以10000r/min的離心速度離心分離10min，取上清液，即得甘膽酸多克隆抗體；所得甘膽酸多克隆抗體優(yōu)選置于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明中，在獲得甘膽酸多克隆抗體后，確定具有合適稀釋度的甘膽酸多克隆抗體工作溶液。

本發(fā)明中，所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液優(yōu)選為以硼酸鹽緩沖液為稀釋劑，將甘膽酸多克隆抗體稀釋到一定稀釋度的稀釋液；所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度優(yōu)選為1∶750。

本發(fā)明中，所述甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度優(yōu)選通過以下方式獲得：s1)用硼酸鹽緩沖液將甘膽酸多克隆抗體稀釋成系列稀釋度的抗體供試液，分別與所述甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液混合、孵育，得到系列抗體-標(biāo)記物混合液；s2)分別對(duì)所述系列抗體-標(biāo)記物混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度；s3)根據(jù)系列抗體-標(biāo)記物混合液的偏振光強(qiáng)度和相應(yīng)的抗體供試液的稀釋度，獲得抗體供試液曲線；s4)選擇抗體供試液曲線中最大偏振光強(qiáng)度的70％為標(biāo)準(zhǔn)偏振值，以所述標(biāo)準(zhǔn)偏振值所對(duì)應(yīng)的稀釋度為甘膽酸多克隆抗體工作溶液的稀釋度。在一些實(shí)施例中，所述系列稀釋度的抗體供試液的稀釋度可以分別為1∶143、1∶167、1∶200、1∶250、1∶333、1∶500和1∶1000。本發(fā)明中，抗體供試液與甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液優(yōu)選等體積混合；一些實(shí)施例中，二者的體積均為500μl。

本發(fā)明中，在稀釋甘膽酸多克隆抗體時(shí)，所用硼酸鹽緩沖液稀釋劑的濃度優(yōu)選為1～8mmol/l，ph值優(yōu)選為7.0～8.5。

本發(fā)明中，采用所得稀釋度的甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液能夠使檢測(cè)方法準(zhǔn)確、靈敏。

按照本發(fā)明，在獲得血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液后，將三者混合，得到檢測(cè)樣。本發(fā)明中，所述血清待測(cè)樣、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比優(yōu)選為1：10：10；在一些實(shí)施例中，具體可分別為50μl、500μl和500μl。

按照本發(fā)明，在獲得檢測(cè)樣后，對(duì)所述檢測(cè)樣進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得偏振光強(qiáng)度。所述熒光偏振光檢測(cè)可借助熒光偏振光測(cè)試儀，經(jīng)檢測(cè)后，獲得偏振光強(qiáng)度。

按照本發(fā)明，在獲得檢測(cè)樣的偏振光強(qiáng)度后，根據(jù)所得偏振光強(qiáng)度與預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

本發(fā)明中，所述預(yù)設(shè)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)選通過以下方式獲得：

s1)用pbs緩沖液將甘膽酸配制成系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液；

s2)對(duì)所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的系列總混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列總混合液的系列偏振光強(qiáng)度mp；

s3)對(duì)pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液經(jīng)混合孵育所得的總空白液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得總空白液的偏振光強(qiáng)度mp0；

步驟s2)和步驟s3)沒有順序限制；

s4)根據(jù)mp/mp0的比值和相應(yīng)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，獲得甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明中，所述步驟s1)中，pbs緩沖液的濃度優(yōu)選為0.01mol/l，ph值優(yōu)選為7.4。在一些實(shí)施例中，可利用pbs緩沖液將甘膽酸配制成如下系列濃的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液：10⁶ng/ml、10⁵ng/ml、10⁴ng/ml、10³ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml。

在得到系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液后，將所述系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液進(jìn)行混合孵育，得到系列總混合液；對(duì)所得系列總混合液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列總混合液所對(duì)應(yīng)的系列偏振光強(qiáng)度mp。其中，甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比優(yōu)選為1：10：10；在一些實(shí)施例中，可分別為50μl、500μl和500μl。本發(fā)明中，所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為1～10min。

本發(fā)明還將pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液進(jìn)行混合孵育，得到總空白液；對(duì)所得總空白液進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得總空白液的偏振光強(qiáng)度mp0。本發(fā)明中，pbs緩沖液、甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液與甘膽酸多克隆抗體工作溶液的體積比優(yōu)選為1∶10∶10；在一些實(shí)施例中，可分別為50μl、500μl和500μl。本發(fā)明中，所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為1～10min。

本發(fā)明中，獲得mp與mp0的順序沒有限制。

本發(fā)明中，獲得mp與mp0后，根據(jù)mp與mp0的比值(即抑制率mp/mp0)和相應(yīng)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，獲得甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一些實(shí)施例中，以mp/mp0的比值為縱坐標(biāo)，以每個(gè)mp所對(duì)應(yīng)的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制得到甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按照本發(fā)明，在獲得甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)樣的偏振光強(qiáng)度后，根據(jù)二者的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即得檢測(cè)樣中血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。具體的，在獲得檢測(cè)樣的偏振光強(qiáng)度mpx后，將mpx/mp0的比值與甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)，吻合點(diǎn)對(duì)應(yīng)的甘膽酸濃度即為血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠簡便快捷、準(zhǔn)確的測(cè)定血清中甘膽酸的濃度；而且，采用本發(fā)明檢測(cè)方法進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)，在線檢測(cè)干擾因素少、線性范圍寬、靈敏度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的線性范圍為884.49～7655.74ng/ml，決定系數(shù)r²＝0.9992，ic50＝2602.20ng/ml，最低檢測(cè)限為480.28ng/ml，其線性范圍寬，相關(guān)性和重復(fù)性好，檢出限低，靈敏度高；而且交叉反應(yīng)率低、特異性高；且其準(zhǔn)確度高；同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡便易行，無需復(fù)雜昂貴的設(shè)備，且檢測(cè)快速便捷，在十幾分鐘甚至數(shù)分鐘即可完成檢測(cè)，是一種易于高通量檢測(cè)且低成本的檢測(cè)方法。

為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，這些描述只是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)，而不是對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。

實(shí)施例1

1.1甘膽酸熒光標(biāo)記物的制備

(1)甘膽酸衍生物的制備：

稱取1.5g膽酸加到燒瓶中，依次加入3ml無水四氫呋喃、509μl三乙胺和464μl氯甲酸異丁酯，室溫?cái)嚢?0min，待溶液變澄清后，再加入379mg4-氨基丁酸，繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3天；反應(yīng)完成后，加入去離子水，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，然后用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的ph至酸性，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，收集乙酸乙酯層，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗產(chǎn)品；再以二氯甲烷：甲醇：乙酸＝10:1:0.01的體積比的混合物為展開劑將上述粗產(chǎn)品通過硅膠柱進(jìn)行分離提純，得到式(ⅰ)所示甘膽酸衍生物。

(2)熒光標(biāo)記物的制備：

稱取3mg所得甘膽酸衍生物、3mgnhs、5.4mgdcc溶于500μldmf中，攪拌過夜，得到混合液；向200μl所述混合液中加入1mgamf，震蕩并常溫避光攪拌3h，得到反應(yīng)液；第一次以體積比為4∶1的chcl3和ch3oh混合物為展開劑，第二次以ch2cl2為展開劑，采用tlc薄層色譜純化方法對(duì)所得反應(yīng)液進(jìn)行兩次薄層層析和分離提純，在紫外透射儀下觀察，并用200μl甲醇萃取，得到rf值分別為0.97、0.86和0.47的3種分離物。

(3)熒光標(biāo)記物的篩選：

將所得3種分離物分別與甘膽酸多克隆抗體(制備方法參見下文1.3節(jié))混合，在加入抗體前后，分別進(jìn)行熒光偏振檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示(圖1為不同rf值的分離物在加入抗體前后的熒光偏振檢測(cè)結(jié)果圖；每組柱形圖中，左側(cè)為加入抗體前的分離物空白樣，右側(cè)為加入抗體后的試樣)。由圖1可以看出，rf值為0.47的分離物在加入抗體后，熒光偏振強(qiáng)度顯著增加，說明其上成功偶聯(lián)熒光素，且與抗體結(jié)合形成了大分子抗原抗體復(fù)合物，選擇rf值為0.47的分離物為甘膽酸熒光標(biāo)記物，其結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示。

1.2甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的確定

用濃度為4mmol/l、ph值為8.5的硼酸鹽緩沖液將所得甘膽酸熒光標(biāo)記物稀釋成如下系列稀釋度的供試溶液：1∶3000、1∶4000、1∶5000、1∶6000、1∶6500和1∶7000；檢測(cè)并記錄各供試溶液的偏振光強(qiáng)度。以硼酸鹽緩沖液為空白溶液并進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得空白溶液的偏振光強(qiáng)度。選擇偏振光強(qiáng)度為空白溶液偏振光強(qiáng)度11倍的標(biāo)記物供試液的稀釋度為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液的稀釋度，所得稀釋度為1∶6500，選擇該稀釋度的供試溶液為甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液。

1.3甘膽酸多克隆抗體的制備

(1)免疫抗原的制備：

稱取10mg第1.1節(jié)所得甘膽酸衍生物溶于300μln,n-二甲基甲酰胺中，再加入4.7μl三正丁胺和3.8μl氯甲酸異丁酯，得到a液；向2ml碳酸緩沖液中加入400μln,n-二甲基甲酰胺和20mg牛血清蛋白，得到b液；將a液滴加到b液中，于4℃攪拌過夜后，將所得反應(yīng)液放入透析袋中，在4℃下用pbs緩沖液透析三天，每天換三次透析液，得到免疫抗原。

(2)抗體的制備：

提供2只新西蘭大白兔，雌性，月齡3個(gè)月，體重1.5～2公斤，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房內(nèi)，連續(xù)觀察一周，確定其狀態(tài)良好后，開始進(jìn)行免疫。

用濃度為0.01mol/l，ph值為7.4的pbs緩沖液將所得免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液；將免疫抗原溶液與弗氏完全佐劑等體積混合乳化，得到乳液??；將免疫抗原溶液與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，得到乳液ⅱ；采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)每只兔子注射2ml乳液ⅰ，即首次免疫；首次免疫兩周后，采用皮下多點(diǎn)注射的免疫方式對(duì)每只兔子注射2ml乳液ⅱ，即首次加強(qiáng)免疫；之后，每隔兩周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，共加強(qiáng)免疫四次，于最后一次加強(qiáng)免疫一周后對(duì)兔子耳部靜脈取血，將收集到的血液置于4℃冰箱過夜，第二天以10000r/min的離心速度離心分離10min，取上清液，即為甘膽酸多克隆抗體，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4甘膽酸多克隆抗體工作溶液的確定

用濃度為4mmol/l、ph值為8.5的硼酸鹽緩沖液將所得甘膽酸多克隆抗體稀釋成如下系列稀釋度的抗體供試液：1∶143、1∶167、1∶200、1∶250、1∶333、1∶500和1∶1000；取上述各稀釋度下的抗體供試液500μl分別置于7個(gè)試管中，再向每個(gè)試管中分別加入500μl甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液進(jìn)行混合，常溫下孵育1～10min，分別進(jìn)行熒光偏振光檢測(cè)，獲得系列偏振光強(qiáng)度。以系列抗體供試液的稀釋度為橫坐標(biāo)，以所得系列偏振光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制抗體供試液曲線，如圖2所示。選擇所得曲線中最大偏振光強(qiáng)度的70％為標(biāo)準(zhǔn)偏振值，該值所對(duì)應(yīng)的抗體供試液的稀釋度為1∶750，以該稀釋度下的抗體供試液為甘膽酸多克隆抗體工作溶液。

1.5甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將1mg甘膽酸溶于1mlpbs緩沖液中做貯存液(1mg/ml)；用濃度為0.01mol/l、ph為7.4的pbs緩沖液將上述貯存液配制成如下系列濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液：10⁶ng/ml、10⁵ng/ml、10⁴ng/ml、10³ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml。所得標(biāo)準(zhǔn)液避光保存，每次使用前搖勻3min。

取上述各濃度的甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液50μl分別置于8個(gè)試管中，再向每個(gè)試管中分別加入500μl甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和500μl多克隆抗體工作溶液，充分混勻，于常溫下孵育1～10min，分別檢測(cè)8個(gè)混合樣的偏振光強(qiáng)度mp。

取50μl未引入甘膽酸的pbs緩沖液、500μl甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和500μl甘膽酸多克隆抗體工作溶液充分混勻，于常溫下孵育1～10min，檢測(cè)器偏振光強(qiáng)度mp0。

以甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)液的系列濃度為橫坐標(biāo)，以mp/mp0的比值為縱坐標(biāo)，繪制甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示?？梢钥闯?，甘膽酸濃度與熒光偏振值之間存在良好的線性關(guān)系且重復(fù)性好，決定系數(shù)r²可達(dá)0.9992；最低檢測(cè)限為480.28ng/ml，具有高靈敏度；且具有較寬的線性范圍，為884.49～7655.74ng/ml，ic50＝2602.20ng/ml。

實(shí)施例2血清中甘膽酸的測(cè)定及檢測(cè)方法精密度的考察

將醫(yī)院收集的某血樣在4℃下以3000rpm的離心速度離心分離10min，取上清液為血清待測(cè)樣。取50μl血清待測(cè)樣、500μl甘膽酸熒光標(biāo)記物工作溶液和500μl甘膽酸多克隆抗體工作溶液充分混合，室溫孵育1～10min，測(cè)試其熒光偏振值。將所得熒光偏振值與甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，得到血清待測(cè)樣中甘膽酸的濃度。

對(duì)上述血清待測(cè)樣重復(fù)檢測(cè)6次，其檢測(cè)結(jié)果和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差參見表1。

表1重復(fù)測(cè)定6次的檢測(cè)結(jié)果及偏差

由以上測(cè)試結(jié)果可知，本發(fā)明的檢測(cè)方法連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次待測(cè)樣所得檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過3％，表明本發(fā)明的檢測(cè)方法具有良好的精密度。

實(shí)施例3

交叉反應(yīng)性研究：選取9種甘膽酸類似物(即結(jié)構(gòu)和功能與甘膽酸類似的物質(zhì))“膽酸、石膽酸、鵝去氧膽酸、甘氨鵝去養(yǎng)膽酸、牛黃膽酸、去氧膽酸、維生素d3、牛黃脫氧膽酸、豬去氧膽酸”作為研究對(duì)象，分別與上述甘膽酸多克隆抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)。

對(duì)每種甘膽酸類似物，分別配制成如下系列濃度的供試溶液：10⁶ng/ml、10⁵ng/ml、10⁴ng/ml、10³ng/ml、500ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml；分別與甘膽酸多克隆抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)，獲得抗體對(duì)各種甘膽酸類似物的ic50′值，并與抗體對(duì)甘膽酸的ic50值進(jìn)行比較，獲得交叉反應(yīng)率cr(％)，cr＝ic50/ic50′；測(cè)試結(jié)果參見表2。

表2甘膽酸多克隆抗體與相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)率測(cè)試結(jié)果

由以上測(cè)試結(jié)果可知，甘膽酸類似物的交叉反應(yīng)率極低，基本無交叉反應(yīng)，這些甘膽酸類似物對(duì)檢測(cè)甘膽酸的干擾性極小，該檢測(cè)方法特異性高。

實(shí)施例4

分別用實(shí)施例1的檢測(cè)方法和現(xiàn)有技術(shù)中準(zhǔn)確度較高的酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)同一批血清待測(cè)樣進(jìn)行檢測(cè)，將本發(fā)明檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果(記為“方法1”)作為橫坐標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附法的檢測(cè)結(jié)果(記為“方法2”)作為縱坐標(biāo)，利用origin軟件建立兩種方法的對(duì)比圖，結(jié)果如圖4所示(圖4為兩種檢測(cè)方法的效果對(duì)比圖)。由圖4可以看出，兩種檢測(cè)方法具有很好的相似性，進(jìn)一步證明本發(fā)明的檢測(cè)方法具有高準(zhǔn)確度。

實(shí)施例5

采集一批健康人和肝炎患者的血樣，在4℃下以3000rpm的離心速度離心分離10min，取上清液，得到血清；健康人血清用pbs緩沖液稀釋5倍，肝炎患者血清用pbs緩沖液稀釋10倍；稀釋后的樣品在沸水中煮5min，得到一批血清待測(cè)樣。采用實(shí)施例1的檢測(cè)方法檢測(cè)該批血清待測(cè)樣，結(jié)果參見圖5(圖5為不同人群血清中甘膽酸含量的測(cè)試對(duì)比圖)。由圖5可以看出，肝硬化患者血清中甘膽酸含量明顯比健康人血清中甘膽酸含量高，進(jìn)一步證明甘膽酸含量可以作為肝炎的臨床檢測(cè)指標(biāo)。

以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。對(duì)這些實(shí)施例的多種修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實(shí)施例中實(shí)現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會(huì)被限制于本文所示的這些實(shí)施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點(diǎn)相一致的最寬的范圍。