專利名稱：膽汁酸結(jié)合劑、血清膽固醇量降低劑以及使血清膽固醇量降低的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以具有膽汁酸結(jié)合能力的來(lái)源于蜂王漿的蛋白質(zhì)作為有效成分的膽汁酸結(jié)合劑以及血清膽固醇量降低劑，還涉及使用該蛋白質(zhì)降低血清膽固醇量的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，世界上排在第一位的死因是動(dòng)脈硬化癥等心血管疾病。認(rèn)為血液中的LDL-膽固醇濃度過(guò)高是動(dòng)脈硬化癥的主要原因，為了改善膽固醇代謝， 急需研發(fā)出更有效的醫(yī)藥品以及功能性食品。近年來(lái)，有報(bào)道稱通過(guò)攝取蜂王漿，可以改善高膽固醇血癥(例如，參考非專利文獻(xiàn)1 4)。此外，還有報(bào)道稱蜂王漿中除了含有12 15%的一般性成分粗蛋白質(zhì)以夕卜，還含有特殊成分10-羥基癸烯酸和蜂王漿抗菌蛋白(royalisin)，所述10-羥基癸烯酸可以使高脂血癥大鼠血液中的甘油三酯、總膽固醇的量減少(例如，參考非專利文獻(xiàn)5)。另一方面，公開了如下方法使用填充了結(jié)合有膽酸的載體的柱子作為膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱(用于具有膽汁酸結(jié)合能力的成分的親和色譜柱)，將血清白蛋白分離的方法(例如，參考非專利文獻(xiàn)6)；使用膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱，從大豆蛋白質(zhì)中分離并鑒定具有膽汁酸結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的方法(例如，參考非專利文獻(xiàn)7和8)等。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 =Nakajin,其他4人，生藥學(xué)雜志，1982年，第36卷，第65-69頁(yè)。非專利文獻(xiàn)2 =Vittek, Experientia, 1995 年，第 51 卷，第 927-935 頁(yè)。非專利文獻(xiàn) 3 :Guo,其他 6 人，Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2007 年，第 53 卷，第 345-348 頁(yè)。4 :Kamakura, ^ftk 2 Α Journal of pharmacy and pharmacology, 2006 年，第 58 卷，第 1683-1689 頁(yè)。非專利文獻(xiàn)5 :Xu，其他 2 人，Zhong Yao Cai (Journal of Chinese medicinal materials)，2002 年，第 25 卷，第 346-347 頁(yè)。非專利文獻(xiàn)6 :Pattinson，其他2人，Journal of Chromatography，1980年，第 187 卷，第409-412頁(yè)。非專利文獻(xiàn)7 :Makino，其他4人，Agricultural and Biological Chemistry, 1988 年，第52卷，第803-809頁(yè)。非專利文獻(xiàn)8 :Minami，其他3人，Agricultural and Biological Chemistry, 1990 年，第M卷，第511-517頁(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問(wèn)題
此外，蜂王漿(以下稱作RJ)是從工蜂的下咽頭腺和大顎腺分泌的乳白色膠狀營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。蜂王漿是女王蜂幼蟲的唯一食糧，含有各種維生素類、礦物質(zhì)、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值非常高。此外，雖然未經(jīng)科學(xué)證明，但一直以來(lái)被認(rèn)為具有疲勞恢復(fù)作用、 抗過(guò)敏作用、抗癌作用、增強(qiáng)免疫力作用等多種藥理作用，被廣泛用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品、醫(yī)藥品原料等。因此，通過(guò)將RJ來(lái)源的成分作為有效成分，期待能夠研發(fā)出用于預(yù)防/改善高膽固醇血癥的安全的新食品、醫(yī)藥品。RJ中含有各種成分，因此，為了研發(fā)新的醫(yī)藥品、功能性食品，RJ中有效成分的確定是不可或缺的。然而，在非專利文獻(xiàn)1 4中，可以明確RJ本身對(duì)膽固醇血癥具有改善效果，但對(duì)于其有效成分卻完全不明確，其作用機(jī)制也是未知的。本發(fā)明的目的在于提供一種以RJ中含有的特定成分作為有效成分的膽汁酸結(jié)合劑以及使用該特定成分使血清膽固醇量降低的方法，所述特定成分具備膽汁酸結(jié)合能力、 高膽固醇血癥改善能力。解決問(wèn)題的方法為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人等進(jìn)行了深入的研究，使用膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱從RJ中確定了多個(gè)具有膽汁酸結(jié)合能力的成分，并對(duì)這些成分的膽汁酸結(jié)合能力、對(duì)血清膽固醇的影響進(jìn)行了研究，從而完成了本發(fā)明。gp，本發(fā)明提供(1) 一種膽汁酸結(jié)合劑，其特征在于，以選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分。(2) 一種血清膽固醇量降低劑，其特征在于，以MRJPl作為有效成分。(3) 一種膽固醇膠束的溶解抑制劑，其特征在于，以MRJPl作為有效成分。(4) 一種使血清膽固醇量降低的方法，其特征在于，口服攝取MRJP1。發(fā)明的效果對(duì)于本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑、使血清膽固醇量降低的方法，可以通過(guò)口服RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合劑，安全地使血清膽固醇量降低。因此，期待本發(fā)明的膽汁酸結(jié)等，對(duì)于血清中膽固醇量增加引起的疾病，特別是高膽固醇血癥、動(dòng)脈硬化癥等具有預(yù)防/治療效^ ο


圖1為圖表，表示的是在參考例1中，通過(guò)使用了膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱的柱色譜對(duì)BSA溶液和卵清蛋白(Ovalbumin)溶液進(jìn)行分級(jí)時(shí)，各級(jí)分的遷移率和280nm的吸光度之間的關(guān)系。圖2為圖表，表示的是在實(shí)施例1中，通過(guò)使用了膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱的柱色譜對(duì)RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行分級(jí)時(shí)，各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關(guān)系。圖3表示的是在實(shí)施例1中，通過(guò)使用了膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱的柱色譜對(duì) RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行分級(jí)，并將所得各級(jí)分進(jìn)行10%的SDS-PAGE后得到的CBB染色圖像。
圖4為圖表，表示的是在實(shí)施例2中，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜對(duì)RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行分級(jí)時(shí)，各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關(guān)系。 圖5表示的是在實(shí)施例2中，由標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率和分子量得到的校正曲線的圖。
圖6表示的是在實(shí)施例2中，通過(guò)將分子量約為290kDa的級(jí)分進(jìn)行15%的 SDS-PAGE后得到的CBB染色圖像。圖7表示的是在實(shí)施例2中，通過(guò)將分子量約為51kDa的級(jí)分進(jìn)行15 %的 SDS-PAGE后得到的CBB染色像圖。圖8為圖表，表示的是在實(shí)施例2中，通過(guò)陰離子色譜對(duì)分子量約為51kDa的級(jí)分進(jìn)行分級(jí)時(shí)，各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關(guān)系。圖9表示的是在實(shí)施例2中，對(duì)通過(guò)陰離子色譜得到的峰1 4進(jìn)行15%的 SDS-PAGE后得到的CBB染色圖像。圖10表示的是在實(shí)施例2中，通過(guò)膽汁酸結(jié)合能力試驗(yàn)計(jì)算出的與各分子結(jié)合的膽汁酸的比例。圖11表示的是在實(shí)施例3中，膽固醇在膠束中的溶解比例。圖12表示的是在實(shí)施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)概要圖。圖13表示的是在實(shí)施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的體重變化圖。 圖14表示的是在實(shí)施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組每日攝食量的圖。圖15表示的是在實(shí)施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的肝臟
重量的圖。圖16表示的是在實(shí)施例4中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的血清總膽固醇量的圖。圖17表示的是在實(shí)施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的體重變化的圖。圖18表示的是在實(shí)施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組每日攝食量的圖。圖19表示的是在實(shí)施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的肝臟
重量的圖。圖20表示的是在實(shí)施例5中，向大鼠口服給藥MRJPl的試驗(yàn)中，各大鼠組的血清總膽固醇量的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑以選自MRJPl (Major royal jelly protein 1)、MRJP2和 MRJP3中的一種以上作為有效成分。如后文實(shí)施例所示，MRJPl、MRJP2和MRJP3是通過(guò)使用膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱，從RJ中首次分離/鑒定的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)。使用了膽汁酸結(jié)合親和色譜的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的分離/鑒定法，是本發(fā)明人首次應(yīng)用于RJ的。MRJPl是占RJ中所含全部蛋白質(zhì)的約39. 4%的蛋白質(zhì)，MRJP2是占RJ中所含全部蛋白質(zhì)的約21. 5%的蛋白質(zhì)，MRJP3是占RJ中所含全部蛋白質(zhì)的約21. 2%的蛋白質(zhì)(泉宏樹、米倉(cāng)政實(shí)著?！甫?—〗J 一夕> /、1質(zhì)Θ α歹才一 A解析」(“蜂王漿蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)組解析”)社團(tuán)法人全國(guó)蜂王漿公平交易協(xié)會(huì)、平成20年度報(bào)告書(2008年)、 第21頁(yè))。公知MRJPl是由432個(gè)氨基酸形成的蛋白質(zhì)，通常在SDS-PAGE中，其分子量約為 55kDa(J. khmitozova et.al，Cell. Mol. Life Sci.，vol54, pl020_1030 (1998))。 此外，在美利堅(jiān)合眾國(guó)的NCBI (國(guó)立生物工學(xué)信息中心)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，MRJPl注冊(cè)為Accession編號(hào)NP_001011579。公知MRJP2是由452個(gè)氨基酸形成的蛋白質(zhì)，通常在 SDS-PAGE 中，其分子量約為 49kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54, P1020-1030 (1998)) ο 此外，MRJP2 在 NCBI 的 Accession 編號(hào)為 NP_001011580。MRJP3 是由 544個(gè)氨基酸形成的蛋白質(zhì)，通常在SDS-PAGE中，其分子量為60 70kDa(J. Schmitozova et. al, Cell. Mol. Life Sci.，vol54，pl020_1030 (1998))。此外，MRJP3 在NCBI 的 Accession 編號(hào)為 NP_001011601。 以下，將上述蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為“本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)”。
進(jìn)一步地，在本發(fā)明中，只要不損害MRJPl、MRJP2或MRJP3所具有的膽汁酸結(jié)合能力，MRJP1、MRJP2或MRJP3中的1 數(shù)個(gè)氨基酸可以缺失、被取代或被加成。上述氨基酸被加成等的蛋白質(zhì)，也可以作為本發(fā)明膽汁酸結(jié)合劑的有效成分。例如，可以在MRJP1、MRJP2 或MRJP3的N末端、C末端分別加成1 10個(gè)，優(yōu)選1 5個(gè)氨基酸。作為加成于本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的N末端、C末端的氨基酸序列，可以列舉His-Tag等常規(guī)的用于生成重組蛋白的Tag序列等。在本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)中，MRJPl除了具有膽汁酸結(jié)合能力以夕卜，還具有降低對(duì)膽固醇膠束的溶解作用，和降低血清膽固醇量的作用。即，本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)適合用作膽固醇膠束的溶解抑制劑和血清膽固醇量的降低劑的有效成分。需要說(shuō)明的是，由MRJPl中1 數(shù)個(gè)氨基酸缺失、被取代或被加成的氨基酸序列形成且具有膽固醇膠束的溶解抑制能力、血清膽固醇量降低能力的蛋白質(zhì)，與MRJPl相同，也適合用作膽固醇膠束的溶解抑制劑和血清膽固醇量的降低劑的有效成分。食物來(lái)源的膽固醇，與卵磷脂、脂肪酸、膽汁酸等形成膠束，變?yōu)樗苄缘?，通過(guò)非攪拌水層(UWL)被小腸吸收。由所述膽固醇在小腸中的吸收機(jī)制，推測(cè)本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)通過(guò)在小腸內(nèi)與膽汁酸結(jié)合，可以抑制膽固醇膠束的形成，其結(jié)果，抑制膽固醇的吸收。作為本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑、膽固醇膠束的溶解抑制劑以及血清膽固醇量降低劑 (以下，膽汁酸結(jié)合劑等)的有效成分的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)，可以是由RJ純化的物質(zhì)，也可以是通過(guò)基因重組技術(shù)在公知的表達(dá)體系中合成的重組蛋白，還可以是通過(guò)肽合成得到的合成品。例如，通過(guò)膽汁酸結(jié)合型親和色譜對(duì)RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行分級(jí)時(shí)，回收含有RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的級(jí)分?？梢詫⑸鲜龌厥盏募?jí)分作為本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等有效成分。此外，通過(guò)凝膠過(guò)濾色譜對(duì)RJ蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行分級(jí)時(shí)，回收含有MRJP1、 MRJP2或MRJP3的級(jí)分?？梢詫⑸鲜龌厥盏募?jí)分作為本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等的有效成分。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等，可以作為醫(yī)藥品、補(bǔ)充劑等飲食品單獨(dú)攝入，也可以像其他的飲食用組合物、醫(yī)藥用組合物那樣，作為飲食品、醫(yī)藥品的添加劑使用。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等的劑型，沒(méi)有特別的限定。可以是例如軟膠囊劑、硬膠囊齊U、片劑、顆粒劑、散劑、液劑、軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑等。用于細(xì)胞培養(yǎng)等時(shí)，優(yōu)選干燥粉末、溶解在水、緩沖液等適當(dāng)溶液中形成的液劑。另一方面，用于生物個(gè)體時(shí)，優(yōu)選適于口服給藥的劑型，進(jìn)一步優(yōu)選腸溶劑。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等中含有的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)，可以僅是1種，
6也可以是2種以上的組合。此外，上述膽汁酸結(jié)合劑等中含有的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的量，只要是能夠發(fā)揮出該RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的膽汁酸結(jié)合能力、膽固醇膠束溶解抑制能力或者血清膽固醇降低能力即可，并無(wú)特別限定，可以考慮RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的種類、劑型等適當(dāng)進(jìn)行決定。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等，可以僅由本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)形成， 也可以含有其他成分。作為其他成分，只要不損害本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的活性即可，可以是任何成分，例如，可以含有除本發(fā)明RJ來(lái)源膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)以外的RJ 來(lái)源的成分，也可以含有具備膽汁酸結(jié)合能力、血清膽固醇降低能力的功能性肽。此外，本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等可以含有醫(yī)藥品、飲食品中可添加的成分，例如賦形劑、粘合劑、表面活性劑、抗氧化劑、PH調(diào)節(jié)劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、防腐劑、殺菌劑、著色劑、矯味矯臭劑等。例如，以選自MRJP1、MRJP2和MRJP3的1種以上作為有效成分的血清膽固醇量降低劑，優(yōu)選進(jìn)一步含有10-羥基癸烯酸作為有效成分。其中，優(yōu)選以MRJPl和10-羥基癸烯酸作為有效成分的血清膽固醇量降低劑。如上所述，10-羥基癸烯酸具有降低高脂血癥大鼠血液中的甘油三酯、總膽固醇的效果，通過(guò)與MRJPl等組合使用，可以實(shí)現(xiàn)更加顯著地降低血清膽固醇的作用。對(duì)于血清膽固醇量降低劑中的MRJPl和10-羥基癸烯酸的含量，只要兩者是能夠各自發(fā)揮降低血清膽固醇作用的量即可，沒(méi)有特別的限定，可以根據(jù)一天的攝取量等來(lái)確定。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等的制造方法，只要是不損害含有的本發(fā)明的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)活性即可，沒(méi)有特別的限定，通常，可以使用在制造含有功能性蛋白質(zhì)的飲食用組合物或醫(yī)藥用組合物時(shí)所使用的方法。本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等的給藥量，只要可以發(fā)揮出RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的膽汁酸結(jié)合等活性即可，沒(méi)有特別的限定，可以考慮RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的種類、對(duì)象細(xì)胞的種類及狀態(tài)、劑型、給藥方法等適當(dāng)進(jìn)行確定。例如，用于培養(yǎng)細(xì)胞等生物個(gè)體外的細(xì)胞時(shí)，可以向培養(yǎng)液中添加本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑或膽固醇膠束溶解抑制劑，使得培養(yǎng)液中的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)含量為IOmg 100mg/mL。在生物個(gè)體攝取時(shí)，本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等的攝取量，只要是可以發(fā)揮出該RJ 來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的膽汁酸結(jié)合等活性的量即可，沒(méi)有特別限定，可以根據(jù)攝取的人、動(dòng)物的體重、年齡、性別、劑型等適當(dāng)進(jìn)行確定。例如，優(yōu)選分為1次或數(shù)次來(lái)攝取，使得 RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)每天的攝取量為300mg lg/kg。通過(guò)口服攝取，本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等在生物體內(nèi)與膽汁酸結(jié)合，進(jìn)一步地使攝取的飲食中的膽固醇膠束溶解性降低，其結(jié)果，使血清膽固醇的量降低。因此，本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等，適宜對(duì)高膽固醇血癥、動(dòng)脈硬化癥等由于血清的膽固醇量過(guò)剩等原因造成的疾病進(jìn)行治療、預(yù)防。本發(fā)明的降低血清膽固醇量的方法(以下叫做血清膽固醇量的降低方法)，其特征在于通過(guò)口服攝取選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的1種以上?？诜z取RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的生物，只要是具有小腸、膽管等組織的動(dòng)物即可，可以是人，也可以是小鼠、 大鼠、狗、貓、猿、牛等的除人以外的動(dòng)物。實(shí)施例下文將通過(guò)實(shí)施例等對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，本發(fā)明并不限定于以下的實(shí)施例。參考例1<膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱的制造>膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱，是以碳二亞胺作為間隔臂，將膽酸結(jié)合在作為柱載體的EAH-kpharose 4B上來(lái)制造的。膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱的制造方法，按照I^attinson 等的方法(非專利文獻(xiàn)6)進(jìn)行。具體而言，首先，使625mL的膽汁酸溶液(含作為間隔臂的33. 4mM的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(l-Ethyl-3-(3' -dimethylaminopropyl) carbodiimide HCl)和3. 7mM的膽酸的50%乙醇溶液)在pH6. 4條件下相對(duì)于容量為50mL 的EAH-kpharose 4B載體反應(yīng)16小時(shí)，使膽酸結(jié)合在載體上。然后，將用含有0. 5MNaCl 的50%乙醇對(duì)未吸附的過(guò)量的膽酸溶液進(jìn)行洗滌后得到的物質(zhì)填充至色譜柱內(nèi)，制造膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱(色譜柱的柱床容量50mL)。需要說(shuō)明的是，使用前，使用0. 02% NaN3 溶液對(duì)色譜柱進(jìn)行平衡化。 <通過(guò)膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱進(jìn)行分級(jí)>接著，通過(guò)使用BSA和卵清蛋白來(lái)確認(rèn)制造的色譜柱對(duì)于具有膽汁酸結(jié)合能的化合物是否實(shí)際具備親和性。從色譜柱洗脫的條件，按照7 ^ 7等的方法(非專利文獻(xiàn)7)進(jìn)行。首先，將1.5mg/mL的BSA溶液和卵清蛋白溶液應(yīng)用于制造的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱上。接著，使第1次洗滌液(0. 5M NaClUOmM Tris-HCl, pH 8. 0)通過(guò)該色譜柱，洗滌除去未吸附在該柱中的載體上的物質(zhì)。接著，使洗脫液(0. 5%脫氧膽酸鈉、IOmM Tris-HCl, PH8. 0)通過(guò)該柱，將與膽酸結(jié)合的蛋白質(zhì)即具有膽汁酸結(jié)合能力的蛋白質(zhì)洗脫。最后，使第 2次洗滌液(8M尿素、IOmM Tris-HCl,pH8. 0)通過(guò)該色譜柱，將非特異性地結(jié)合于該色譜柱上的物質(zhì)洗脫。各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關(guān)系如圖1所示。在圖1中，“⑴”為第1次洗滌液的級(jí)分，“ (2) ”為洗脫液的級(jí)分，“ (3) ”為第2次洗滌液的級(jí)分。其結(jié)果，卵清蛋白在第1次洗滌液級(jí)分中被洗脫，BSA在洗脫液的級(jí)分中被洗脫。由上述結(jié)果可知，制造的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱與非專利文獻(xiàn)7中記載的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱相同，不吸附卵清蛋白，吸附BSA。[實(shí)施例1]<通過(guò)膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱對(duì)RJ蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)>使用參考例1中制造的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱，對(duì)RJ蛋白質(zhì)進(jìn)行分級(jí)時(shí)，對(duì)具有膽汁酸結(jié)合能力的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、純化。關(guān)于使用該膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱對(duì)RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的分離純化，目前為止還沒(méi)有報(bào)道，其是一種非常高效的純化方法。首先，制備RJ蛋白質(zhì)溶液。具體而言，使用孔徑為IOkDa的透析膜，對(duì)向RJ(中國(guó)產(chǎn))中加入純水得到的懸濁物通過(guò)純水透析72小時(shí)?；厥胀肝瞿?nèi)液體，冷凍干燥后，再將其懸濁于含有NaR的Tris緩沖液(0. 2% NaN3^lOmM Tris-HCl (pH8. 0))中，制備 117mg/25mL的RJ蛋白質(zhì)溶液(RJ的截?cái)嘀禐镮OkDa)。接著，將RJ蛋白質(zhì)溶液應(yīng)用于參考例1中制造的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱上以后，按照與參考例1相同的方式，依次使第1次洗滌液、洗脫液、第2次洗滌液通過(guò)該色譜柱。各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度之間的關(guān)系如圖2所示。在圖2中，“(1)”、“(2)” 和“⑶”與圖1相同。進(jìn)一步地，回收由洗脫液洗脫的級(jí)分(圖2中的“A”，以下稱作“級(jí)分A”)。<通過(guò)膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱分離、純化的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)的鑒定
>對(duì)通過(guò)膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱分離、純化的RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。首先，使用孔徑為IOkDa的透析膜，在4°C條件下，以純水對(duì)級(jí)分A進(jìn)行透析、脫鹽 72小時(shí)?；厥胀肝瞿?nèi)的液體，通過(guò)冷凍干燥，制備脫鹽級(jí)分A。接著，將脫鹽級(jí)分A提供至10 %的SDS-PAGE，分離出其中含有的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE 的結(jié)果如圖3所示。在圖3中，“std”意指分子量標(biāo)準(zhǔn)，“A”意指脫鹽級(jí)分A，上述為分別使用的物質(zhì)。在該結(jié)果的A欄中，在約49 75kDa范圍內(nèi)檢測(cè)到3個(gè)條帶(圖3中(1) (3))。由該結(jié)果可知，脫鹽級(jí)分A溶液中含有與膽汁酸結(jié)合的3種RJ來(lái)源的蛋白質(zhì)。從SDS-PAGE的凝膠上將各條帶切下來(lái)，還原烷基化以后，通過(guò)胰蛋白酶處理進(jìn)行蛋白膠內(nèi)酶解(In-gel digestion)。然后，對(duì)通過(guò)凝膠提取的肽片段進(jìn)行脫鹽純化，使用 MALDI-T0F/MS進(jìn)行質(zhì)量分析。由該結(jié)果可以鑒定在圖3中，條帶(1)為MRJP3，條帶O) 為MRJP1，條帶(3)為MRJP2。對(duì)得到的SDS-PAGE的結(jié)果中的CBB染色圖像進(jìn)行圖像解析 (Image J分析)時(shí)，上述3種蛋白質(zhì)的比例為MRJP1為76%，MRJP2為22%，MRJP3為2%。[實(shí)施例2]測(cè)定由RJ分離純化的MRJPl和MRJP2的膽汁酸結(jié)合能力。<將MRJPl從RJ分離純化>首先，使用凝膠過(guò)濾色譜法從RJ中對(duì)MRJPl進(jìn)行分離純化。具體而言，首先，將5mL 的按照與實(shí)施例1相同方式制備的23. 5mg/5mL的RJ蛋白質(zhì)溶液(RJ的截?cái)嘀禐镮OkDa) 應(yīng)用于HiLoad superdex 200p. g(GEhealthcare公司制造)上。然后，將洗脫液QOmM Na2HPO4. 20mM NaH2PO4150mM NaCl、pH7. 5)以洗脫速度 1. 5mL/min通過(guò)該色譜柱，以每5mL為一個(gè)級(jí)分進(jìn)行回收。各級(jí)分的遷移率和^Onm的吸光度的關(guān)系如圖4所示。此外，使用RJ 蛋白質(zhì)溶液的同時(shí)，將36mg/ml的凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)品(Gel Filtration Standard) (BIO-RAD 公司制造)應(yīng)用至該色譜柱上，研究遷移率(從洗脫開始的總洗脫量)和該級(jí)分中含有的分子的大小之間的關(guān)系，制作校正曲線。制作的校正曲線如圖5所示。本發(fā)明人對(duì)從上述的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱洗脫的復(fù)合體進(jìn)行凝膠解析時(shí)發(fā)現(xiàn)，含量最多的是MRJPl級(jí)分。由圖5中所示標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率和分子量得到的校正曲線可知，圖4中所示的凝膠過(guò)濾色譜中的級(jí)分B(級(jí)分B 圖4中的虛線所包圍的級(jí)分)的分子量接近于約290kDa。將該級(jí)分提供至15%的SDS-PAGE，如圖6所示，在約55kDa的位置檢測(cè)出單一的條帶。此外，使用MALDI-T0F/MS對(duì)該級(jí)分中含有的分子進(jìn)行質(zhì)量分析，可以判定其為含有MRJPl的級(jí)分。由上述結(jié)果可以確認(rèn)MRJP1約為55kDa，RJ中存在5 6聚體。 以下將該級(jí)分稱作MRJPl級(jí)分。需要說(shuō)明的是，通過(guò)定量可知在該MRJPl級(jí)分中不含有非專利文獻(xiàn)5中所報(bào)道的可以降低高血脂癥大鼠的血液中的甘油三酯、總膽固醇的10-羥基癸烯酸。<將MRJP2從RJ分離純化>
本發(fā)明人對(duì)從上述的膽汁酸結(jié)合型親和色譜柱洗脫的復(fù)合體進(jìn)行凝膠解析時(shí)發(fā)現(xiàn)，其含量?jī)H次于含量最多的MRJPl級(jí)分的級(jí)分是MRJP2級(jí)分。對(duì)圖4中所示的凝膠過(guò)濾色譜中的級(jí)分E(級(jí)分E 圖4中的點(diǎn)虛線所包圍的級(jí)分)中所含有的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。由圖5 中所示標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率和分子量得到的校正曲線可知，該級(jí)分E的分子量接近于約51kDa。 將該級(jí)分E提供至15%的SDS-PAGE時(shí)，如圖7所示，在約46 66kDa的位置檢測(cè)出2條條
市ο此外，將該級(jí)分E提供至陰離子色譜，對(duì)單一的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。具體而言，使用結(jié)合用溶液OOmM Tris-HCl、pH8. 0)將級(jí)分E稀釋為125mg/5mL，然后將5mL應(yīng)用于Hift^p Q FF(GE Healthcare 公司制造)。接著，使用洗脫液(20mM Tris-HCl、0· 5M NaCl、pH8.0)， 以圖8中虛線所示的流動(dòng)相中氯化鈉濃度為0 0. 5M范圍的梯度濃度施加流動(dòng)相，使蛋白質(zhì)洗脫。需要說(shuō)明的是，流動(dòng)相的流動(dòng)速度為1.5mL/min。各級(jí)分的遷移率和280nm的吸光度之間的關(guān)系如圖8所示。將圖8中所示的峰 1 4分別提供至15%的SDS-PAGE時(shí)，如圖9所示，檢測(cè)出峰1至峰2為單一的條帶。因此，將峰1和峰2合并回收，使用MALDI-T0F/MS對(duì)該級(jí)分中含有的分子進(jìn)行質(zhì)量分析，可以判定其為含有MRJP2的級(jí)分。以下將該級(jí)分稱作MRJP2級(jí)分。<利用透析法進(jìn)行膽汁酸結(jié)合試驗(yàn)>通過(guò)透析法對(duì)上述純化了的MRJPl和MRJP2的膽汁酸結(jié)合能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。分別使用抗高膽固醇劑消膽胺作為陽(yáng)性對(duì)照，使用酪蛋白作為陰性對(duì)照。具體而言，向含有牛磺膽酸的磷酸緩沖液(50mM?；悄懰帷OOmM磷酸緩沖液、 PH7. 4)中分別添加消膽胺、酪蛋白、MRJPl級(jí)分、MRJP2級(jí)分、或者將未經(jīng)處理的RJ(生RJ) 冷凍干燥得到的物質(zhì)，使其濃度分別為100mg/mL，將其作為反應(yīng)溶液。將這些反應(yīng)溶液于 37°C培養(yǎng)2小時(shí)后，在室溫下透析72小時(shí)。通過(guò)測(cè)定透析膜外液中含有的總膽汁酸量，可以計(jì)算出透析膜內(nèi)液體中含有(即，與各分子結(jié)合)的膽汁酸的比例。計(jì)算出的與各分子結(jié)合的膽汁酸的比例如圖10所示。圖10中的“htactRJ”是添加了將未經(jīng)處理的RJ冷凍干燥后得到的物質(zhì)的反應(yīng)溶液的結(jié)果。其結(jié)果為與陰性對(duì)照組的酪蛋白(33% )相比，MRJPl的膽汁酸結(jié)合能力為46%，MRJP2的膽汁酸結(jié)合能力為 37%。S卩，MRJPl顯示出比MRJP2更高的膽汁酸結(jié)合能力。[實(shí)施例3]〈膽固醇膠束溶解性試驗(yàn)>測(cè)定由RJ分離純化的MRJPl和MRJP2對(duì)膽固醇膠束溶解的抑制能力。MRJPl和 MRJP2分別使用實(shí)施例2中制備的MRJPl級(jí)分和MRJP2級(jí)分。此外，使用酪蛋白作為陰性對(duì)照。首先，在20mL的玻璃管內(nèi)取以下級(jí)分[4_14C]膽固醇/氯仿(Perkin Elmer Life Science公司制造)并使其最終濃度為3. 7kBq/mL(2. lGbq/mmol, NEN)，膽固醇(片山化學(xué)工業(yè)公司制造)/氯仿并使其最終濃度為2 μ M，油酸(SIGMA公司制造)/氯仿并使其最終濃度為20 μ Μ,單油酰反式甘油(MONO 0LE0YL-RAC GLYCEROL) (SIGMA公司制造)/氯仿并使其最終濃度為5 μ M，L- α -卵磷脂(SIGMA公司制造)/氯仿并使其最終濃度為0. 6mM,將其充分混合后，吹入氮?dú)馐蛊涓稍?。然后，將得到的干燥固體物溶解在含有6. 6mM的?；悄懰?SIGMA公司制造)和132mM的NaCl的15mM磷酸緩沖液(pH7. 4)中。使用旋渦混合器
10(vortex mixer)攪拌2分鐘后，進(jìn)行超聲波處理(25W，輸出功率6，3分鐘)，然后在37°C — 邊振蕩一邊進(jìn)行培養(yǎng)M小時(shí)，制備[14C]膽固醇膠束溶液。在膽固醇膠束溶解性試驗(yàn)中，具體而言，向[14C]膽固醇膠束溶液中添加酪蛋白、 MRJP1、或MRJP2使其最終濃度為10mg/mL，并將其作為反應(yīng)溶液。使用旋渦混合器對(duì)各反應(yīng)溶液攪拌2分鐘后，進(jìn)行超聲波處理(25W，輸出功率6，3分鐘)，然后在37°C培養(yǎng)1小時(shí)，接著，在37°C、100，000 Xg條件下，對(duì)380 μ L溶液進(jìn)行離心分離1小時(shí)，并回收上清液。向回收的50 μ L上清液中加入IOmL乳化閃爍劑(乳化〉> f > 一夕一)，通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定上清液中的[14C]膽固醇。上清液中存在著在水溶液中穩(wěn)定溶解的膽固醇膠束。因此， 通過(guò)上清液中的[14C]膽固醇量占反應(yīng)溶液中預(yù)先添加的[14C]膽固醇量的比例，可以計(jì)算出在水溶液中穩(wěn)定溶解的膽固醇膠束的比例。膽固醇在膠束中的溶解比例如圖11中所示。通過(guò)Duncan多范圍檢驗(yàn)，以ρ <0. 05 對(duì)各試驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性差異檢驗(yàn)處理。與陰性對(duì)照組的酪蛋白(79%)相比， MRJPl為46%，顯著降低。與其相比，MRJP2為93%，顯著增加。即，可以明確MRJPl具有膽固醇膠束溶解抑制能力。[實(shí)施例4]〈大鼠口服給藥試驗(yàn)〉對(duì)作為高脂血癥模型的攝取膽固醇的大鼠，口服給藥從RJ分離純化的MRJP1， 研究其對(duì)血清膽固醇帶來(lái)的影響。MRJPl使用實(shí)施例2中制備的MRJPl級(jí)分。此外，使用酪蛋白作為陰性對(duì)照。如圖12所示，在試驗(yàn)的3天時(shí)間里，向攝取含有膽固醇的食物的大鼠一天一次地口服給藥MRJPl或酪蛋白。在第三次給藥開始經(jīng)過(guò)M小時(shí)后，禁食4小時(shí)，然后通過(guò)心臟采血將大鼠處死。使用采集的血液，測(cè)定血清膽固醇。進(jìn)一步解剖，測(cè)定肝臟重量。其他的具體試驗(yàn)條件如下所示。試驗(yàn)組4周齡的Wistar系雄性大鼠(70g)試驗(yàn)組數(shù)η = 9開始給藥時(shí)間AM8 00試驗(yàn)飼養(yǎng)時(shí)間3天(預(yù)飼養(yǎng)3天)禁食時(shí)間4小時(shí)試驗(yàn)樣品酪蛋白鈉(CS)或MRJPl (MR)給藥量300mg/kg(B. W. ) / 天或 600mg/kg (B. W. ) / 天食物組成20%酪蛋白+1%膽固醇通過(guò)在3000rpm條件下進(jìn)行離心分離15分鐘來(lái)制備血清。使用酶法，具體而言使用市售的試劑盒(膽固醇Ε-test worker ；和光純藥工業(yè)公司制造)對(duì)血清膽固醇進(jìn)行定量測(cè)定。同樣地，使用HDL-膽固醇Ε-test worker (和光純藥工業(yè)公司制造)測(cè)定HDL-膽固醇。通過(guò)計(jì)算求出LDL+VLDL-膽固醇。各種測(cè)定結(jié)果等如圖13 16所示。需要說(shuō)明的是，各數(shù)值為1組9只的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差，在試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，使用Duncan多范圍檢驗(yàn)和Mudent’ s t檢驗(yàn)。分別將各試驗(yàn)組的體重變化示于圖13中，將每天的食物攝取量示于圖14中，將肝臟重量示于圖15中。其結(jié)果，在各組中，酪蛋白鈉(CS)給藥組和MRJPl (MR)給藥組之間并未發(fā)現(xiàn)有顯著性差異。另一方面，如圖16所示，在300mg/kg(B. W.)/天的給藥組和600mg/kg (B. W.) /天的給藥組的任意給藥組中，與酪蛋白鈉(⑶)給藥組相比，MRJPl(MR)給藥組觀察到了血清總膽固醇量降低的傾向。特別是600mg/kg(B.W.)/天的給藥組，與酪蛋白鈉(CS)給藥組相比，MRJPl(MR)給藥組的血清總膽固醇量顯著(Duncan多范圍檢驗(yàn)和Mudent’ s t檢驗(yàn)兩者中的P < 0. 05)降低。由上述結(jié)果可知，通過(guò)口服給藥分離純化的MRJP1，可以使血清總膽固醇量降低。[實(shí)施例5]〈大鼠口服給藥試驗(yàn)〉除了將試驗(yàn)組數(shù)設(shè)定為10只(n = 10)、試驗(yàn)飼養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為7天(預(yù)飼養(yǎng)3天)、 給藥量設(shè)定為600mg/kg(B. W.)/天以外，其它和實(shí)施例4相同，向高膽固醇血癥的模型，即攝取1 %膽固醇的大鼠口服給藥從MR分離純化的MRJPl持續(xù)7天。研究對(duì)其血清膽固醇帶來(lái)的影響。分別將各試驗(yàn)組的體重變化示于圖17中，將每天的食物攝取量示于圖18中，將肝臟重量示于圖19中，將血清總膽固醇量示于圖20中。需要說(shuō)明的是，各數(shù)值為1組10只的平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差，在試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，使用Mudent’ s t檢驗(yàn)。其結(jié)果，在體重的變化、每天的食物攝取量、以及肝臟重量方面，酪蛋白鈉(CS)給藥組和MRJPl(MR)給藥組未見(jiàn)明顯差異。另一方面，與酪蛋白鈉(CS)給藥組相比，MRJPl (MR)給藥組的血清總膽固醇量顯著(約)降低(Student's t檢驗(yàn)中，ρ < 0. 05)。特別是血清LDL膽固醇和血清VLDL 膽固醇的總量顯著降低。由上述結(jié)果可知，通過(guò)口服給藥分離純化的MRJPl持續(xù)7天，可以使血清總膽固醇量降低。工業(yè)實(shí)用性降低本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑、血清膽固醇量的方法，可通過(guò)口服給藥RJ來(lái)源的膽汁酸結(jié)合劑，使血清膽固醇的量安全地降低。因此，本發(fā)明的膽汁酸結(jié)合劑等，可以作為治療、預(yù)防特別是高膽固醇血癥、動(dòng)脈硬化癥的醫(yī)藥、功能性食品等的有效成分。
權(quán)利要求
1.一種膽汁酸結(jié)合劑，其以選自MRJPl、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分。
2.一種血清膽固醇量降低劑，其以MRJPl作為有效成分。
3.—種膽固醇量膠束的溶解抑制劑，其以MRJPl作為有效成分。
4.一種使血清膽固醇量降低的方法，該方法包括口服攝取MRJP1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以RJ中含有的特定成分作為有效成分的膽汁酸結(jié)合劑以及使用該特定成分使血清膽固醇量降低的方法，所述特定成分具備膽汁酸結(jié)合能力、高膽固醇血癥改善能力。本發(fā)明提供一種膽汁酸結(jié)合劑，其特征在于，以選自MRJP1、MRJP2和MRJP3中的一種以上作為有效成分；本發(fā)明提供一種血清膽固醇量降低劑，其特征在于，以MRJP1作為有效成分；本發(fā)明提供一種膽固醇量膠束的溶解性降低劑，其特征在于，以MRJP1作為有效成分；本發(fā)明提供一種使血清膽固醇量降低的方法，其特征在于，口服攝取MRJP1。
文檔編號(hào)A23L1/305GK102451464SQ20111032543
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者中村正, 兼松智, 加島優(yōu)里, 后藤剛, 川島拓司, 渡邊鈴代, 草田未央, 長(zhǎng)岡利 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人岐阜大學(xué), 株式會(huì)社秋田屋本店