專利名稱:肝功測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測定肝功的方法(即能在測試病人中鑒定肝臟疾病的性質(zhì))。
背景技術(shù)：
攝取和膽汁分泌膽汁酸是重要的肝臟功能，在幾種實(shí)質(zhì)型和膽汁郁積型肝病中，觀察到血清膽汁酸濃度升高。已經(jīng)有人顯示，在患有不同肝病的患者中，在削弱的血漿清除率和肝臟機(jī)能不良之間有很好相關(guān)性的天然膽汁酸[Korman等人《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(New Eng.J.Med.)(1975)292，1205]和放射標(biāo)記膽汁酸[Horak等人《胃腸病學(xué)》(Gastroenterology)(1976)71，809]從血漿中的快速清除。P.-H.Ekdahl等人[《原子光》(Atomlight)(1966)No.56，1-5 Coden，ATLGA4，XP002063328]公開了C14標(biāo)記的膽酸在肝功測試中的應(yīng)用，其中是用勻漿的人肝臟樣本來評價結(jié)合膽酸的能力。然而，所有這些方法都需要復(fù)雜的操作，并且在后兩種情況下，需要使用放射性化合物。
J.M.Crawford等人[《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》(Biochim.Biophys.Acta)，1991，1085(2)，223-34]公開了熒光丹?；哪懼}衍生物在測定甾環(huán)中羥基對肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移和膽汁分泌的影響中的應(yīng)用。
US 4848349公開了用于診斷和研究的熒光標(biāo)記的膽汁酸。其中一種所述應(yīng)用是間接測定肝臟血流量，該應(yīng)用包括，在一段時間內(nèi)取樣，并分析標(biāo)記的膽汁酸從血漿中清除的速率以測得肝臟血流量。
US 4264514公開了測定血清樣本中結(jié)合膽汁酸水平的分析法，該測試是這樣進(jìn)行的將血清樣本與對血清樣本內(nèi)其中一種結(jié)合膽汁酸顯特異性的抗血清、和含有已被標(biāo)記或標(biāo)志的相同結(jié)合膽汁酸的試劑混合，以將抗血清的抗體與樣本中特異性結(jié)合膽汁酸和被標(biāo)記的結(jié)合膽汁酸結(jié)合；將結(jié)合有抗體的物質(zhì)與未結(jié)合抗體的物質(zhì)分離開，然后在任一分離部分中測定被標(biāo)記衍生物的水平，這樣就能通過與標(biāo)準(zhǔn)比較而測定出樣本中特異性膽汁酸結(jié)合物的量。其中還公開了使用熒光化學(xué)品、放射性同位素或電子自旋共振化學(xué)品來標(biāo)記或標(biāo)志結(jié)合膽汁酸的可能性。然而，該方法操作起來相當(dāng)昂貴并且復(fù)雜，因?yàn)閷τ跇颖局袦y定的每一種結(jié)合膽汁酸，它都既使用特異性抗血清，又使用特異標(biāo)記的結(jié)合膽汁酸。
C.O.Mills等人在《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》(Biochimica etBiophysica Acta)，1115(1991)，151-156中描述了對熒光膽汁鹽-膽酰賴氨酰熒光素的研究，其中在大鼠中對膽汁動力學(xué)和肝提取進(jìn)行了體內(nèi)和體外研究。其中指出了膽酰賴氨酰熒光素的膽輸出和肝提取與天然膽汁酸膽酰甘氨酸的膽輸出和肝提取之間的類似性，并且提出，通過在肝病患者中采集血樣，使用膽酰賴氨酰熒光素可以非侵入性地測定肝臟血流量。他們從這些研究中還提出，合適的膽汁酸可用于將藥物靶向遞送到肝臟中而同時保持其物理化學(xué)性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供可克服或減輕上述缺點(diǎn)的測定肝功的方法。
本發(fā)明提供了測定患者肝功的方法，其中包括下述步驟(i)將有效量的有色或熒光膽汁酸衍生物靜脈內(nèi)給藥到患者體內(nèi)后，處理(使用)流過患者肝臟并且在一系列時間間隔采集的一系列血樣；和(ii)通過下述步驟測定每一樣本中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度(a)處理血樣以獲得含有所述膽汁酸衍生物的血漿，(b)測定血漿中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度，和(c)將在步驟(b)中獲得的測定結(jié)果擬合，以獲得血漿清除曲線，將所得血漿清除曲線與從具有已知肝功的個體中獲得的血漿清除曲線進(jìn)行比較，以測定出所述患者的肝功。
本發(fā)明還涉及有色或熒光膽汁酸衍生物在制備用于通過下述方法來測定肝功的診斷劑中的應(yīng)用，其中所述方法包括下述步驟(i)將有效量的含有所述有色或熒光膽汁酸衍生物的診斷劑靜脈內(nèi)給到患者體內(nèi)，(ii)進(jìn)行完步驟(i)后，在一系列時間間隔采集流過患者肝臟的血樣，和(iii)通過下述步驟測定每一樣本中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度(a)處理血樣以獲得含有所述膽汁酸衍生物的血漿，(b)測定血漿中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度，和(c)將在步驟(iii)(b)中獲得的測定結(jié)果擬合，以獲得血漿清除曲線，將所得血漿清除曲線與從具有已知肝功的個體中獲得的血漿清除曲線進(jìn)行比較，以測定出所述患者的肝功。
本發(fā)明膽汁酸衍生物優(yōu)選包含具有未保護(hù)的3-羥基、7-羥基或12-羥基取代基或所述取代基的任意組合、和通過酰胺連接在該甾族部分側(cè)鏈上的未保護(hù)羧基的甾族部分，和將被靶向遞送到肝臟中的活性部分，所述活性部分連接在α-碳上，其中該α-碳是相對于所述未保護(hù)羧基而言的。
所述化合物優(yōu)選具有通式(I)所示結(jié)構(gòu) 其中A是α-OH或β-OH；B是α-H或β-H；C是-H、α-OH或β-OH；或者B和C一起形成雙鍵；D是-H、α-OH或β-OH；E是-H、α-OH或β-OH；L是連接部分；J是所述有色或熒光部分；且n是0或1。
J優(yōu)選是或包括熒光素、若丹明、或其它發(fā)熒光部分。
連接部分在其與活性部分J相連的末端優(yōu)選是N-末端，L可以是-(CH2)nNH，其中n是3或4，-(CH2)4NH-(CH2)3NHC(＝NH)NH-，或-(CH2)2-CH(OH)CH2NH-。
或者，-NH-CH(COOH)-L-可以衍生自S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-氨基咪唑-4-甲酰胺、天冬酰胺、尸胺、胱胺、瓜氨酸、二氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、半胱胺、谷酰胺、3-羥基犬尿氨酸、犬尿氨酸、腐胺或負(fù)霉素?；蛘撸?dāng)活性部分J有一個氨基和/或J具有疏水性時，可使用酸性氨基酸來代替上述化合物。
本發(fā)明膽汁酸衍生物的甾族部分優(yōu)選基于膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、豬膽酸、α-鼠膽酸(muricholic acid)、β-鼠膽酸、ω-鼠膽酸、去甲膽汁酸、石膽酸、3β-羥基膽烯酸、烏索脫氧膽酸、別膽酸(5α-膽-24-烷酸)等。
本發(fā)明熒光膽汁酸衍生物最優(yōu)選為具有下述結(jié)構(gòu)的膽酰賴氨酰熒光素(CLF) 其中賴氨酰基和熒光素是通過硫代酰氨基-C(S)NH-連接在一起的。過去該化合物簡稱為“CLF”，在下文中，“CLF”就代表該化合物。
在動物模型中，膽汁酸的賴氨酰熒光素類似物表現(xiàn)出包括肝攝取在內(nèi)的與天然膽汁酸很相似的幾種物理和生理特性[Saraswat等人的Gut(1995)36(Suppl.1)，A18]。
本發(fā)明方法的步驟(a)可通過將樣本離心來完成。
對于熒光膽汁酸衍生物，步驟(a)優(yōu)選還包括將血蛋白從血漿中分離出，例如通過將甲醇加到血漿中來使蛋白沉淀，然后再離心來分離出血蛋白。如果不分離出血蛋白，它們就會與熒光膽汁酸衍生物形成復(fù)合物，并熄滅熒光，因此就會使熒光測定結(jié)果人為降低和易變。
在步驟(a)和(b)之間，可能還需要包括將血漿稀釋的步驟。
優(yōu)選將本發(fā)明有色或熒光膽汁酸衍生物以鹽水溶液的形式注射，所述溶液的體積優(yōu)選為1cm3-10cm3。
劑量優(yōu)選為至少0.02mg/kg體重，優(yōu)選為0.02-0.5mg/kg體重。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在一組肝臟正常的人、一組肝硬化患者、和一組脂肪肝患者之間，在注射CLF后30分鐘采集的樣本中，血清熒光強(qiáng)度表現(xiàn)出最高的差別值。因此，測定注射后約30分鐘采集的樣本，并與用至少一個標(biāo)準(zhǔn)所獲得的血清熒光強(qiáng)度值進(jìn)行比較，以獲得肝功指示可能是特別有利的。
因此，另一方面，本發(fā)明提供了測定患者肝功的方法，其中包括下述步驟(i)將有效量的有色或熒光膽汁酸衍生物靜脈內(nèi)給藥到患者體內(nèi)后，處理(使用)流過患者肝臟并且在預(yù)定時間間隔采集的血樣；和(ii)通過下述步驟測定該樣本中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度(a)處理血樣以獲得含育所述膽汁酸衍生物的血漿，(b)測定血漿中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度，和(c)將在步驟(b)中獲得的測定結(jié)果與至少一個標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，以測定出所述患者的肝功。
除了步驟(c)以外，所采用的操作可以與在包括處理與測定在給藥后一系列時間間隔采集的多個樣本的方法中使用的操作相同。
下面將通過關(guān)于附圖的實(shí)施例來描述本發(fā)明的實(shí)施方案，其中附圖1表示，健康志愿者的膽酰賴氨酰熒光素(CLF)血漿清除曲線，附圖2表示，健康個體和患有不同原因肝臟機(jī)能不良的患者的CLF血漿清除曲線。
具體實(shí)施方式按照在別的文獻(xiàn)中[Mills等人的《生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報》(Biochi.Biophys.Acta)，(1991)1115，151]描述的方法合成CLF，將其滅菌并測試是否存在熱原。
用6個年齡在30-53歲之間的健康志愿者(1名女性，5名男性)進(jìn)行研究。禁食過夜后讓受試者仰臥。采集出最初的基礎(chǔ)血樣后，用15秒將CLF以0.02mg/kg體重(b.w.)的劑量在生理鹽水中靜脈注射。在第2、3、4、6、10、15、20、30、60和90分鐘，從肘前對面靜脈中采集出靜脈血樣，置于凝膠和鋰肝素容器(商品名為Vacutainers，由Becton Dickinson Vacutainer Systems出售)中。然后將血樣離心，取出0.5ml等分試樣的血漿，并加到3.5ml甲醇中以沉淀出血漿蛋白，然后再次離心。用甲醇將上清液(1ml)稀釋至3ml，然后用分光計(jì)(Perkin Elmer LS5B Luminescence Spectrometer)測定熒光度。
從表示下述公式的校準(zhǔn)曲線中推出CLF濃度(μg/ml)y＝2566x-52.6其中y代表在490nm激發(fā)波長處(在520nm發(fā)射)測定的以熒光單位表示的熒光度，x代表以μg/ml為單位的CLF的濃度。由具有已知CLF濃度的溶液的熒光度測定值將校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，然后進(jìn)行線性回歸分析。
將以百分之給藥劑量/升血漿表示的非線性血漿清除曲線擬和成三指數(shù)模型。用下述公式計(jì)算第一相(t1/2第一相)、第二相(t1/2第二相)和第三相(t1/2第三相)的半衰期(t1/2時間)t1/2第一相＝0.693/k1t1/2第二相＝0.693/k2t1/2第三相＝0.693/k3其中k1、k2和k3分別是用下述公式計(jì)算的Ct=Ae-k1t+Be-k2t+Ce-k3t]]>其中Ct是在時間t時CLF的濃度，A、B和C是在t＝0時每一清除相的截距。
k1、k2和k3是3個清除相的分?jǐn)?shù)清除速率。
所得血漿清除曲線如附圖1所示。
CLF的活性部分(膽酰甘氨酸和熒光素)在人體中已有廣泛應(yīng)用。膽酰甘氨酸是人體內(nèi)的天然初級膽汁鹽，靜脈內(nèi)注射熒光素血管造影術(shù)通常用在眼科檢查中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，能使用非常少量的CLF。作為比較，在靜脈注射劑中常規(guī)應(yīng)用的甘氨膽酸鹽例如Vit K1或安定的劑量比可在本發(fā)明中使用的CLF的劑量要高約300倍，熒光素在眼底熒光素血管造影術(shù)中的劑量要高400倍。
CLF的血漿清除曲線呈現(xiàn)成3個清除相。第一清除相、第二清除相和第三清除相的t1/2分別為1.7±0.9分鐘、6.7±1.6分鐘和68±17分鐘。在Cowen等人[《胃腸病學(xué)》(Gastroenterology)(1975)68，1567]報道的放射標(biāo)記的膽酰甘氨酸的數(shù)據(jù)中，第一和第二指數(shù)的t1/2分別是1.7±0.1分鐘和7±0.1分鐘。其中是將膽酰甘氨酸擬和成基于雙指數(shù)模型的清除曲線，都是現(xiàn)在認(rèn)為采用三指數(shù)分析更合適[Engelking等人的《臨床科學(xué)》(Clinical Science)(1979)57，499]。當(dāng)以百分之給藥劑量/升血漿表示時，在90分鐘時CLF的血漿保留值是2.2％。
為了進(jìn)一步測定所選劑量的適當(dāng)性以及CLF的安全性，在5個健康志愿者中，注射25倍劑量的CLF(0.5mg/kg體重)。注射后，包括基本肝功測試的血清生化、電解質(zhì)以及腎功能沒有顯著改變。表1表示了注射高劑量的CLF之前和之后，標(biāo)準(zhǔn)肝功測試值和脲與肌酸酐的血漿濃度。雖然注射CLF后，血漿堿性磷酸酶水平有一致降低，但是這種差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(p＝0.06)。
表1.在將CLF以0.5mg/kg體重的劑量注射到5個健康個體中之前和之后的肝功測試
1AST＝天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶2AlkP＝堿性磷酸酶3NS＝不顯著用上述25倍的增加劑量所獲得的清除曲線證實(shí)，肝臟清除率沒有改變。這反映出Korman等人(參見上文)所觀察到的天然膽汁酸的性質(zhì)。然而，CLF在本發(fā)明中所用的劑量遠(yuǎn)低于Korman等人所用的天然膽汁酸的劑量(0.02-0.5mg/kg體重對5mM/kg體重(≈2.4g/kg體重))。按照Thiordleifsson等人[Gut(1977)18，697]提出的方法計(jì)算出的CLF的分布體積為2214±147ml，這與其它人[Gilmore等人的Gut(1978)19，1110]所報道的放射標(biāo)記的膽酰甘氨酸的分布體積值相似。
通過將第60分鐘的熒光度與第10分鐘的熒光度進(jìn)行比較，計(jì)算以百分比表示的上述結(jié)果。對于放射標(biāo)記的膽酸(Horak等人，參見上文)，健康志愿者在第60分鐘的血漿保留值是8±1％，而隨后去世的暴發(fā)性肝衰竭(FHF)患者在第60分鐘的血漿保留值是71％，隨后仍幸存的FHF患者在第60分鐘的血漿保留值是60％(這兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義)。對于本發(fā)明，60分鐘后13.1±1.6％的熒光度百分比類似于在Horak的研究工作中從健康志愿者中獲得的數(shù)據(jù)。表明CLF血漿清除與天然膽汁酸血漿清除非常類似的這些數(shù)據(jù)中可讓人想起，在健康個體和肝臟機(jī)能不良患者之間，CLF的血漿清除率有顯著性差異。附圖2所示數(shù)據(jù)證實(shí)了這一點(diǎn)。附圖2所示清除曲線表示健康個體(i)、脂肪肝患者(ii)、肝硬化患者(iii)和近期肝移植患者(iv)(肝臟移植后5天)的不同CLF清除速率。因此，本發(fā)明不僅提供了測試患者肝功的有用方法，而且還能診斷肝臟機(jī)能不良的病因。
在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，將CLF以0.02mg/kg體重的劑量對下述45個受試者靜脈給藥肝硬化患者(n＝24)、脂肪肝患者(n＝12)和9個健康志愿者。注射前開始采集血樣，在60分鐘期間內(nèi)每10分鐘采集1次。通過熒光分光計(jì)測定血漿熒光度，并比較每一組中在實(shí)驗(yàn)期間的剩余熒光度。每一注射前都進(jìn)行常規(guī)肝功測試(rLFT’s)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，在肝硬化患者和脂肪肝患者中，CLF血漿清除率顯著降低。注射CLF后30分鐘(CLF30分鐘)，在各分析組之間血清熒光度有最大差別值(肝硬化患者對脂肪肝患者-p＜0.0001；肝硬化患者對健康對照組-p＜0.0001；脂肪肝患者對健康對照組-p＜0.0025)。在檢查脂肪肝患者的輕度異常的肝功方面，CLF30分鐘比常規(guī)LTF’s更靈敏。沒有觀察到負(fù)作用或副作用。
該CLF測試在這3個分析組之間區(qū)別得很清楚，并且在檢查輕度異常的肝功方面比rLTF’s更靈敏。該測試安全、易于操作和分析，因此是有用的和方便的肝功動力學(xué)測試。
權(quán)利要求
1.有色或熒光膽汁酸衍生物在用于測定肝功的診斷藥物制備中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求
1的應(yīng)用，其中所述診斷藥物是靜脈給藥用診斷藥物。
3.權(quán)利要求
2的應(yīng)用，其中所述診斷藥物是根據(jù)所述有色或熒光膽汁酸衍生物的血漿清除率測定肝功的診斷藥物。
4.權(quán)利要求
1-3任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述膽汁酸衍生物包含(a)甾族部分，其具有(i)至少一個獨(dú)立地選自未保護(hù)3-羥基、未保護(hù)7-羥基和未保護(hù)12-羥基的未保護(hù)取代基、和(ii)通過酰胺鍵連接在該甾族部分側(cè)鏈上的未保護(hù)羧基；和(b)將被靶向遞送到肝臟中的活性部分，所述活性部分連接在α-碳原子上，其中該α-碳原子是相對于所述未保護(hù)羧基而言的。
5.權(quán)利要求
1-3任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述膽汁酸衍生物具有通式(I)所示結(jié)構(gòu) 其中A選自α-OH和β-OH；B選自α-H和β-H；C選自-H、α-OH和β-OH；或者B和C一起形成雙鍵；D選自-H、α-OH和β-OH；E選自-H、α-OH和β-OH；L是連接部分；J是所述有色或熒光部分；且n是0或1。
6.權(quán)利要求
5的應(yīng)用，其中J是或包括熒光素、若丹明、或其它發(fā)熒光部分。
7.權(quán)利要求
5的應(yīng)用，其中連接部分在其與活性部分J相連的末端是N-末端，并且L選自-(CH2)nNH，其中n是3或4，-(CH2)4NH-(CH2)3NHC(＝NH)NH-，和-(CH2)2-CH(OH)CH2NH-。
8.權(quán)利要求
5的應(yīng)用，其中通式(I)中的-NH-CH(COOH)-L-衍生自選自下述化合物的化合物S-腺苷高半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、S-氨基咪唑-4-甲酰胺、天冬酰胺、尸胺、胱胺、瓜氨酸、二氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、半胱胺、谷酰胺、3-羥基犬尿氨酸、犬尿氨酸、腐胺和負(fù)霉素。
9.權(quán)利要求
4的應(yīng)用，其中所述膽汁酸衍生物上的甾族部分基于選自下述化合物的酸膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、豬膽酸、α-鼠膽酸、β-鼠膽酸、ω-鼠膽酸、去甲膽汁酸、石膽酸、3β-羥基膽烯酸、烏索脫氧膽酸和別膽酸。
10.權(quán)利要求
4的應(yīng)用，其中所述熒光膽汁酸衍生物是具有下述結(jié)構(gòu)的膽酰賴氨酰熒光素 其中賴氨?；蜔晒馑厥峭ㄟ^硫代酰氨基-C(S)NH-連接在一起的。
專利摘要
測定患者肝功的方法，其中包括下述步驟(i)將有效量的有色或熒光膽汁酸衍生物靜脈內(nèi)給到患者體內(nèi)后，處理流過患者肝臟并且在一系列時間間隔采集的一系列血樣；和(ii)通過下述步驟測定每一樣本中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度(a)處理血樣以獲得含有所述膽汁酸衍生物的血漿，(b)測定血漿中所述膽汁酸衍生物的顏色或熒光強(qiáng)度，和(c)將在步驟(b)中獲得的測定結(jié)果擬合，以獲得血漿清除曲線，將所得血漿清除曲線與從具有已知肝功的個體中獲得的血漿清除曲線進(jìn)行比較，以測定出所述患者的肝功。
文檔編號G01N21/64GK1991367SQ200610169336
公開日2007年7月4日 申請日期1998年8月3日
發(fā)明者C·O·米爾斯 申請人:諾金歐洲公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan