本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學病理技術領域，具體涉及一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液及其制備方法。

背景技術：

宮頸癌是婦科最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，位居女性惡性腫瘤第二位，嚴重威脅著女性的身體健康和生活質(zhì)量。中國是宮頸癌的高發(fā)國家，發(fā)生率及死亡率約占全世界的1/3。宮頸癌也是目前唯一病因明確，通過有效的早期診斷及治療可以完全治愈的癌癥。

當前宮頸癌及癌前的病變的早期診斷分為“三階梯”。第一步為陰道脫落細胞學檢查，篩查出可疑病例。第二步為陰道鏡檢查，在陰道鏡下對可疑病例取活檢組織。然后進行第三步活體組織檢查，最終確診。做為宮頸癌及癌前病變診斷的第一步，陰道脫落細胞學檢查起著非常重要的門戶作用，當前脫落細胞學的主要檢查技術為液基薄層制片技術。液基薄層細胞制片術改良自傳統(tǒng)“巴氏涂片法”，使用獨特的細胞保存液和液基薄層制片機器，代替?zhèn)鹘y(tǒng)巴氏的手工涂片法，可制出均勻薄層的細胞有利于病理醫(yī)院鏡下觀察，降低了傳統(tǒng)巴氏的漏診率和假陽性、假陰性率。

然而液基薄層細胞制片術采用的依舊是非特異性的巴氏/he染色，并未從根源上彌補細胞學檢查的技術缺陷。受取材、染色、及病理醫(yī)生的主觀判斷等因素的影響，仍存在假陰性率高、靈敏度和特異性不理想等缺點。特別是對病理醫(yī)生的要求較高，且我國病理醫(yī)生缺乏、病理醫(yī)生的工作量大，易出現(xiàn)人為因素導致漏檢的情況。

尋找新的靈敏度和特異度更好的分子生物標志物用于宮頸癌的早期診斷具有重要意義。

液基細胞學的技術缺陷促進了宮頸癌及癌前病變篩查輔助技術的發(fā)展，當前主要的輔助篩查技術為hpv檢測，目前hpv的檢測方法有多種，靈敏度和特異度較高的有雜交捕獲二代檢測系統(tǒng)(hc-ii)、熒光定量pcr技術等。

研究己揭示高危型人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)的持續(xù)感染是導致宮頸癌的主要原因。目前已知的hpv亞型有近200種，大多數(shù)不會引起宮頸癌，只有14種高危型，是引起宮頸癌的主要原因。女性的一生中，感染hpv的風險超過50％，而這些感染者有90％以上可在一至兩年內(nèi)通過人體自身的免疫力清楚掉hpv，即轉陰自愈。因而hpv檢測作為一個篩查指標明顯缺乏特異性，易導致病人的心理恐慌和過渡醫(yī)療。且hpv分子生物學檢測技術對實驗環(huán)境和人員的要求較高，檢測價格較貴，限制了其在臨床上的廣泛應用。

已知宮頸癌發(fā)生的主要原因是持續(xù)性的人乳頭瘤病毒(hpv)感染(99％以上)。hpv的持續(xù)感染會導致病毒的致癌基因蛋白e6和e7含量升高，e6和e7作用是可分別與人體抑癌基因蛋白p53和prb結合，e6通過抑制p53而阻斷凋亡，e7通過抑制prb使細胞周期失控，并導致p16^ink4a表達上調(diào)。

任力等人在“p16^ink4a和人乳頭瘤病毒檢測在液基細胞學篩查宮頸病變中的應用”中通過選取8933名宮頸炎患者進行液基薄層細胞學檢查，其中有64例呈不良反應，應用免疫組織化學sp方法檢測其p16^ink4a表達，同時采用實時定量pcr法檢測hpv表達，實驗結果證明的p16^ink4a表達與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展相關，并與宮頸病變分級及hpv感染高度相關，是篩查液基細胞學組織標本宮頸病變的一個有用指標(任力，狄文，何以豐等.p16～(ink4a)和人乳頭瘤病毒檢測在液基細胞學篩查宮頸病變中的應用[j].診斷學理論與實踐，2008，7(1):80-82.)

韓雪松等人在“宮頸薄層液基細胞中p16^ink4a的表達在宮頸癌篩查中的意義”中通過選擇96例hpv陽性的宮頸液基層細胞學剩余標本，制作液基薄片，利用sp免疫組化法檢測lct標本中p16蛋白，并與組織活檢結果進行對照，最終結果證明，p16蛋白異常表達與宮頸上皮內(nèi)瘤病變的發(fā)生有關，其可以作為宮頸上皮內(nèi)瘤的標志物，輔助細胞學篩查(韓雪松，王鈁，徐琳等.宮頸薄層液基細胞中p16^ink4a的表達在宮頸癌篩查中的意義[j].中國實驗診斷學，2011，15(4):656-659.)

目前，p16^ink4a做為高危hpv的代表和宮頸癌前病變的發(fā)展密切相關，具有較高的特異性和靈敏度，在宮頸組織活檢樣本中，已經(jīng)得到普遍被認可與應用。

液基細胞p16^ink4a免疫標記染色即是利用p16^ink4a蛋白抗原與抗體的特異性結合原理，可從根本解決當前液基細胞學的非特異性染色問題，避免宮頸癌前篩查易受病理醫(yī)生經(jīng)驗和人員缺乏等影響因素。

p16^ink4a在細胞學中的應用，首先需要一種合適的細胞保存液，傳統(tǒng)的液基細胞保存液具有裂解紅細胞、稀釋粘液、固定細胞等作用，可滿足液基薄層的制技術的要求，然而所使用的化學試劑易導致p16^ink4a抗原決定簇的封閉，對p16^ink4a抗原不能起到很好的保護作用，易導致染色結果的假陰性。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液。本發(fā)明保存液不僅適用于傳統(tǒng)的液基細胞制片、染色，還適用于宮頸液基細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色，利用抗原抗體的特異性結合，為液基細胞學技術提供特異性的染色方法，避免了傳統(tǒng)非特異性巴氏染色的缺陷。本發(fā)明還提供了用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法。

本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，包括以下成分及其濃度：nacl60-100mmol/l、kcl2-10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1-5mmol/l、尿素30-50mmol/l、檸檬酸鈉1-5mmol/l、蔗糖5-20mmol/l、peg-4004-10mmol/l、多聚甲醛2％-3％、甘油2-10mmol/l和二硫蘇糖醇10-20mmol/l。

優(yōu)選地，所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液包括以下成分及其濃度：nacl75-90mmol/l、kcl6-8mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3-4mmol/l、尿素40-45mmol/l、檸檬酸鈉2.5-4mmol/l、蔗糖12-17mmol/l、peg-4005.6-8.4mmol/l、多聚甲醛2-3％、甘油7.5-9mmol/l和二硫蘇糖醇13-18mmol/l。

優(yōu)選地，所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液包括以下成分及其濃度：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

一種用于液基層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法，包括以下步驟：

s1.準確稱取nacl、kcl和尿素，依次溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液i；

s2.準確稱取乙二胺四乙酸二鈉并溶于純化水中，加熱使其完全溶解后冷卻至室溫，得溶液ii；

s3.準確稱取檸檬酸鈉、蔗糖溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液iii。

s4.將上述溶液i、溶液ii和溶液iii混合均勻后，然后加入peg-400、多聚甲醛和甘油，攪拌使其混合均勻，得溶液iv；

s5.將上述溶液iv調(diào)節(jié)ph值至7.5-8.0，得溶液v；

s6.向上述溶液v中添加二硫蘇糖醇，攪拌使其完全溶解，即得。

優(yōu)選地，所述步驟(5)中用乙酸/naoh調(diào)節(jié)ph值至7.8，所述步驟(6)所得溶液ph為7.0-8.0。

在本發(fā)明用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液中，nacl和kcl作為滲透壓穩(wěn)定劑，能夠有效維持體系滲透壓；尿素作為紅細胞處理劑，使本發(fā)明保存液中其無需添加裂解液即可將全部紅細胞徹底清除，同時完美保存有診斷價值的各種有核細胞形態(tài)；二硫蘇糖醇是本發(fā)明主要的粘液處理劑，其與其它成分有效結合，使本發(fā)明保存液分解粘液能力強，能夠最大限度釋放有診斷價值的細胞，并能防止堵塞膜孔。

本發(fā)明使用多聚甲醛固定液代替了傳統(tǒng)液基的乙醇/甲醇固定液，從而對p16^ink4a抗原具有更好的保護效果；乙二胺四乙酸二鈉是一種抗聚集試劑，能避免細胞堆積，peg-400不僅能保護細胞骨架的完整性，防止細胞水腫，而且作為保濕增容劑，其還能夠有效調(diào)和本發(fā)明保存液體系中其它成分，在本發(fā)明保存液體系濃度范圍內(nèi)，二者相互作用能夠發(fā)揮很好的穩(wěn)定和分散作用，保證保存液的穩(wěn)定性。

保存液體系中的化學物質(zhì)往往容易導致p16^ink4a抗原決定簇封閉，從而導致染色結果的假陰性。本發(fā)明保存液體系中添加有檸檬酸鈉、蔗糖和甘油，其與本發(fā)明體系中其它成分共同作用，能夠保護p16^ink4a抗原決定簇不受其它化學試劑的影響而封閉。

本發(fā)明保存液中各成分能夠有效結合在一起，使本發(fā)明保存液與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明保存液在普通液基薄層制片中不僅能夠很好的保存細胞的形態(tài)，對粘液樣本和血液樣本的也有很好的處理效果；

(2)本發(fā)明保存液不僅能保存細胞形態(tài)還能長時間保護p16ink4a抗原決定簇；

(3)本發(fā)明保存液成分簡單、價格低廉、操作方便，大大節(jié)省了制備樣品的時間，易于推廣。

附圖說明

圖1：本發(fā)明保存液對血液樣本中的紅細胞裂解情況；

圖2：本發(fā)明保存液對粘液樣本中粘液、細胞形態(tài)的觀察；

圖3：p16^ink4a免疫標記陰性染色；

圖4：p16^ink4a免疫標記陽性染色；

圖5：本發(fā)明保存液保存的細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色；

圖6：cps03細胞保存液保存的細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色；

圖7：thinprep保存液保存的細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色。

具體實施方式

下面將結合說明書附圖和實施例進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附權利要求書記載的內(nèi)容為準。

peg-400購于無錫市千聚恒貿(mào)易有限公司；cps03細胞保存液和thinprep細胞保存液由本公司廣州江元醫(yī)療科技有限公司提供。

實施例1一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.5mmol/l、尿素42mmol/l、檸檬酸鈉3.6mmol/l、蔗糖16mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％、甘油8.4mmol/l和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法，包括以下步驟：

s1.準確稱取nacl、kcl和尿素，依次溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液i；

s2.準確稱取乙二胺四乙酸二鈉并溶于純化水中，加熱使其完全溶解后冷卻至室溫，得溶液ii；

s3.準確稱取檸檬酸鈉、蔗糖溶于純化水中，攪拌使其全部溶解，得溶液iii。

s4.將上述溶液i、溶液ii和溶液iii混合均勻后，然后加入peg-400、多聚甲醛和甘油，攪拌使其混合均勻，得溶液iv；

s5.將上述溶液iv用乙酸/naoh調(diào)節(jié)ph值至7.8，得溶液v；

s6.向上述溶液v中添加二硫蘇糖醇，攪拌使其完全溶解，使溶液ph值為7.5，即得。

實施例2一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl60mmol/l、kcl2mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉1mmol/l、尿素30mmol/l、檸檬酸鈉1mmol/l、蔗糖5mmol/l、peg-4004mmol/l、多聚甲醛2％、甘油2mmol/l和二硫蘇糖醇10mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實施例1類似。

實施例3一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl100mmol/l、kcl10mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉5mmol/l、尿素50mmol/l、檸檬酸鈉5mmol/l、蔗糖20mmol/l、peg-40010mmol/l、多聚甲醛2.5％、甘油10mmol/l和二硫蘇糖醇20mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實施例1類似。

實施例4一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl75mmol/l、kcl6mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3mmol/l、尿素40mmol/l、檸檬酸鈉2.5mmol/l、蔗糖12mmol/l、peg-4005.6mmol/l、多聚甲醛3％、甘油7.5mmol/l和二硫蘇糖醇13mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實施例1類似。

實施例5一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl90mmol/l、kcl8mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉4mmol/l、尿素45mmol/l、檸檬酸鈉4mmol/l、蔗糖17mmol/l、peg-4008.4mmol/l、多聚甲醛2.3％、甘油9mmol/l和二硫蘇糖醇18mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實施例1類似。

對比例1一種用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液，由以下成分及其濃度組成：nacl85mmol/l、kcl7.5mmol/l、乙二胺四乙酸二鈉3.75mmol/l、尿素42mmol/l、peg-4006.5mmol/l、多聚甲醛2％和二硫蘇糖醇16.5mmol/l。

所述用于液基薄層細胞的免疫p16^ink4a抗原保存液的制備方法與實施例1類似。

與實施例1的區(qū)別在于，保存液中不含有檸檬酸鈉、蔗糖及甘油。

試驗例1液基薄層制片觀察

按照標準取樣規(guī)程，用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細胞樣本(包含粘液較多樣本和血液樣本)，然后將取樣刷放入本發(fā)明實施例1制備得到的保存液中保存細胞。用全自動沉降式制片機(jy-3200)進行自動制片和巴氏染色，然后顯微鏡下拍照，試驗結果如圖1，圖2所示。

由圖1可知，經(jīng)實施例1制備得到的保存液保存的血液樣本中的紅細胞被全部裂解，制片和染色后觀察不會出現(xiàn)遮擋上皮細胞、干擾鏡下觀察現(xiàn)象。

由圖2可知，經(jīng)實施例1制備得到的保存液保存的粘液較多的樣本中粘液被打散，白細胞成均勻狀態(tài)，制片和染色后觀察不會出現(xiàn)遮擋上皮細胞、干擾鏡下觀察現(xiàn)象。

由圖1和圖2可知，經(jīng)實施例1制備得到的保存液在普通液基薄層制片中不僅能夠很好的保存細胞的形態(tài)，對粘液樣本和血液樣本的也有很好的處理效果。

試驗例2不同樣本p16^ink4a免疫標記染色觀察

按照標準取樣規(guī)程，用一次性宮頸刷刷取女性患者宮頸移形區(qū)的細胞樣本(包含組織學確診的宮頸病變樣本和無病變樣本)，然后將取樣刷放入本發(fā)明實施例1制備得到的保存液中保存細胞。用全自動沉降式制片機(jy-3200)進行自動制片、用組織染色機(jy-6000)進行p16^ink4a免疫標記染色，然后顯微鏡下拍照，試驗結果如圖3、圖4所示。

由圖3可知，p16^ink4a免疫標記陰性染色，細胞形態(tài)清晰，無背景干擾；由圖4可知，p16^ink4a免疫標記陽性染色，細胞形態(tài)清晰，陽性著色清晰易辨，p16^ink4a抗原保存較好。

試驗例3宮頸癌細胞株sihap16^ink4a免疫標記染色觀察

將宮頸癌細胞株siha分別在本發(fā)明實施例1制備得到的保存液、cps03細胞保存液和thinprep保存液中常溫保存5天后進行液基薄層制片和p16^ink4a蛋白免疫標記染色。結果如圖5、圖6及圖7所示。

由圖5、圖6及圖7可知，發(fā)明實施例1制備得到的保存液保存的細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色程度和效果明顯優(yōu)于cps03細胞保存液和thinprep細胞保存液。

試驗例4不同保存液對保存細胞的影響觀察

將宮頸癌細胞株siha分別在本發(fā)明實施例1制備得到的保存液、cps03細胞保存液、thinprep保存液以及對比例1制備得到的保存液中常溫保存5天后進行液基薄層制片和p16^ink4a蛋白免疫標記染色，同時進行細胞形態(tài)觀察，對p16^ink4a蛋白免疫標記染色程度以及陽性染色細胞比例進行觀察和統(tǒng)計分析，結果如表1所述。

表1不同保存液對保存細胞的影響觀察

由表1可知，實施例1保存液不僅能保存細胞形態(tài)還能長時間保護p16^ink4a抗原決定簇；cps03保存液、thinprep保存液及對比例1保存液僅能保存細胞的形態(tài)。實施例1與對比例1相比，說明在本發(fā)明保存液中檸檬酸鈉、蔗糖和甘油的添加對p16^ink4a抗原決定簇具有明顯的保護作用。

綜上可知，本發(fā)明保存液不僅適用于傳統(tǒng)的液基細胞制片、染色，還適用于宮頸液基細胞p16^ink4a蛋白免疫標記染色，利用抗原抗體的特異性結合，為液基細胞學技術提供特異性的染色方法，避免了傳統(tǒng)非特異性巴氏染色的缺陷。