本發(fā)明涉及一種哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒及其制備方法，適用于檢測診斷使用哌拉西林治療引起且正在發(fā)生的溶血，以及預測將要使用哌拉西林的治療是否可能引起溶血，指導臨床合理選擇使用抗生素。
背景技術：
：目前，藥物造成的不良反應日漸增多，其中藥源性溶血性貧血的病例也逐年增多。若不及時停藥或進行治療，將會加重病情甚至危及生命。哌拉西林為第三代半合成青霉素，具有廣譜抗菌作用，為臨床上最常用的抗菌藥物之一，臨床上主要用于綠膿桿菌及其他敏感的革蘭氏陰性桿菌所致的肺炎、敗血癥、呼吸道、膽道和泌尿系統(tǒng)感染、亞急性心內(nèi)膜炎及化膿性腦膜炎等。已有文獻報道，哌拉西林可誘導免疫性溶血性貧血的發(fā)生。柱凝膠檢測方法目前已廣泛用于abo血型、血清中不規(guī)則抗體的檢測以及其在交叉配血中，但在哌拉西林誘導型溶血的檢測中尚未見相關研究報道。微柱凝膠技術具有所需標本量少、無須洗滌、結果穩(wěn)定、易于判讀等優(yōu)點，有望成為哌拉西林誘導型溶血檢測的常規(guī)篩查技術，由于不需要大型儀器，且操作簡單，價格便宜，適合中小醫(yī)院及社區(qū)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院開展，為我們哌拉西林誘導型溶血前期篩查提供便利。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是針對上述現(xiàn)有技術提供一種靈敏度高、重復性好、操作簡便、價格便宜且質(zhì)量穩(wěn)定的哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒及其制備方法。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術方案為：一種哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒，它包括盒體和盒蓋，所述盒體底面上設置有防滑膠層，所述盒體內(nèi)設置有哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i和哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii，所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i和哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii均包括豎直固定板，所述豎直固定板頂部設置有水平支撐板，所述水平支撐板上設置有多個微柱型凝膠管，所述微柱型凝膠管包括反應腔和凝膠分離柱，所述反應腔位于凝膠分離柱上方，所述反應腔頂部設置有一圈凸緣，所述凝膠分離柱內(nèi)自上而下設置有多層分離網(wǎng)，所述凸緣擱置于水平支撐板上，所述水平支撐板下方設置有支撐架，所述微柱型凝膠管插裝于支撐架內(nèi)，所述水平支撐板上方設置有保護膜，所述保護膜覆蓋于多個微柱型凝膠管的凸緣上。所述反應腔內(nèi)壁上均勻設置有多個緩沖凸點。所述水平支撐板正面平行設置有多個隔條，所述隔條設置于相鄰兩個微柱型凝膠管之間。所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i有6個微柱型凝膠管，每個微柱管中均含有葡聚糖凝膠顆粒，凝膠顆粒中含有抗igg或抗c3d成分；所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii有8個微柱型凝膠管，每個微柱管中均含有葡聚糖凝膠顆粒，凝膠顆粒中含有抗igg+c3d成分。所述試劑盒的盒體內(nèi)還設置有哌拉西林處理紅細胞、非哌拉西林處理紅細胞、抗體陽性對照液和抗體陰性對照液，所述哌拉西林處理紅細胞是通過哌拉西林藥物溶液處理的正常o型rh陰性紅細胞，濃度為2～2.5%；所述非哌拉西林處理紅細胞是濃度為2～2.5%的正常o型rh陰性紅細胞；所述哌拉西林抗體陽性対照液是哌拉西林抗體陽性血清；所述哌拉西林抗體陰性對照液是哌拉西林抗體陰性血清。一種哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒的制備方法，所述方法包括如下步驟：一、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i的制備：步驟一、量取按批量使用符合要求的器具將葡聚糖凝膠量取轉(zhuǎn)移至潔凈并滅菌的容器中；步驟二、洗滌用0.9%氯化鈉溶液洗滌葡聚糖凝膠，0.9%氯化鈉溶液與葡聚糖凝膠體積比為2:1，充分混勻，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作6~8次，得洗滌后凝膠，作好標識；作為優(yōu)選，洗滌后的凝膠中可添加乳糖0.02-0.1（v/v）%、以及檸檬酸三鉀20mg-40mg%，在試劑盒保存過程中穩(wěn)定體系的ph值，并保持良好的均勻度。步驟三、配制按批量分別量取抗人球蛋白試劑、抗人球蛋白試劑、0.9%氯化鈉溶液，按抗體與凝膠體積比1:5的比例，將上述試劑分別加入洗滌后凝膠中混合，分別用器具混合均勻成抗體凝膠，分別作好標識；步驟四、灌裝、離心將步驟三配制的凝膠按照每孔20～30μl的抗體凝膠量將各種凝膠加入微管中；微管序號123456抗體凝膠抗igg凝膠抗c3d凝膠空白凝膠抗igg凝膠抗c3d凝膠空白凝膠步驟五、封口離心結束后，卡轉(zhuǎn)移至封口機上封口；封口條件為：壓力3.0kg、溫度163±2℃，時間4秒/卡；二、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii的制備：步驟一、量取按批量使用符合要求的器具將葡聚糖凝膠量取轉(zhuǎn)移至潔凈并滅菌的容器中；步驟二、洗滌用0.9%氯化鈉溶液洗滌葡聚糖凝膠，0.9%氯化鈉溶液與葡聚糖凝膠ii，體積比為2:1，充分混勻，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作6～8次，再用凝膠浸泡液浸泡所得凝膠15分鐘，凝膠浸泡液與凝膠體積比為1:1，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，得洗滌后凝膠，作好標識；作為優(yōu)選，洗滌后的凝膠中可添加乳糖0.02-0.1（v/v）%、以及檸檬酸三鉀20mg-40mg%。步驟三、配制量取抗人球蛋白試劑，按抗體與凝膠體積比為1:5～1:2的比例，將抗人球蛋白試劑加入洗滌后的凝膠中混合，分別用器具混合均勻成抗體凝膠，作好標識待用；步驟四、灌裝、離心將步驟二配制的凝膠按照每孔25～35μl的抗體凝膠量將抗人球蛋白試劑凝膠加入微管中；微管序號12345678抗體凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠步驟五、封口離心結束后，卡轉(zhuǎn)移至封口機上封口；封口條件為：0.3～0.35mpa壓力、溫度158±1℃，時間3秒/卡；三、哌拉西林處理紅細胞的制備：步驟一、過濾、洗滌取o型原料血紅細胞，用一次性白細胞過濾器過濾，將三人份的o型原料血紅細胞混合，用0.9%氯化鈉溶液洗滌，原料血與0.9%氯化鈉溶液體積比為1:4，3000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作2～4次；步驟二、藥物致敏a、哌拉西林藥物溶液配制：稱取硼酸、氯化鉀，加純化水充分溶解，配制為0.1mol/lph為9.3～10.2的硼酸緩沖液，加入稱取的哌拉西林，充分溶解混勻，即得哌拉西林藥物溶液；b、哌拉西林藥物處理細胞：量取哌拉西林藥物溶液，加入o型紅細胞壓積，37℃孵育1小時，每隔10～20分鐘混勻一次，0.9%氯化鈉溶液洗滌致敏紅細胞2～4次或直到上清無溶血現(xiàn)象，用紅細胞保存液稀釋至2～2.5%濃度，2～8℃保存，所述紅細胞保存液中至少包括膽固醇200～600mg/l、人血清白蛋白5～20g/l、乳糖0.02-0.1（v/v）%、十八烷基胺乙酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、聚醚硫酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、堿金屬如鈉、鉀作為調(diào)節(jié)劑；膽固醇、人血清白蛋白可用于延長紅細胞有效性，十八烷基胺乙酸堿金屬鹽和聚醚硫酸堿金屬鹽一方面作為表面活性劑，另一方面可維持紅細胞的滲透壓在不溶解的有效范圍內(nèi)，提高檢測的靈敏度，這樣無需再額外添加無機堿金屬鹽類。步驟三、分裝取哌拉西林藥物處理細胞，分裝至滴瓶中，每瓶2.5ml，于2～8℃保存；四、非哌拉西林處理細胞的制備：步驟一、過濾、洗滌取o型原料血紅細胞，用一次性白細胞過濾器過濾，將三人份的o型原料血紅細胞混合，用0.9%氯化鈉溶液洗滌，原料血與0.9%氯化鈉溶液體積比為1:4，3000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作2～4次，用紅細胞保存液稀釋至2～2.5%濃度，2～8℃保存，所述紅細胞保存液中至少包括膽固醇200～600mg/l、人血清白蛋白5～20g/l、乳糖0.02-0.1（v/v）%、十八烷基胺乙酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、聚醚硫酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、堿金屬如鈉、鉀作為調(diào)節(jié)劑；步驟二、分裝取非哌拉西林藥物處理細胞，分裝至滴瓶中，每瓶1ml，于2～8℃保存；五、哌拉西林抗體陽性對照的制備：步驟一、過濾取哌拉西林抗體陽性血清，過濾；步驟二、分裝取過濾后的哌拉西林抗體陽性血清，分裝至聚乙烯瓶中，每瓶1.5ml，于2～8℃保存；六、哌拉西林抗體陰性對照的制備：步驟一、過濾取哌拉西林抗體陰性血清，過濾；步驟二、分裝取過濾后的哌拉西林抗體陰性血清，分裝至聚乙烯瓶中，每瓶1.5ml，于2～8℃保存。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明哌拉西林誘導型溶血檢測試劑盒靈敏度高，重復性好，質(zhì)量穩(wěn)定，檢測過程耗時短，方法簡便易行，結果易于判定，可同時對大量樣本進行檢測，易于自動化，能夠使哌拉西林誘導型溶血檢測技術成為臨床常規(guī)檢測項目。附圖說明圖1為本發(fā)明一種哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒的結構示意圖。圖2為哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡的結構示意圖。其中：盒體1盒蓋2防滑膠層3豎直固定板1水平支撐板5微柱型凝膠管6凸體6.1反應腔6.2凝膠分離柱6.3分離網(wǎng)6.4緩沖凸點6.5支撐架7保護膜8隔條9。具體實施方式以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。如圖1、圖2所示，本實施例中的一種哌拉西林誘導溶血檢測試劑盒，它包括盒體1和盒蓋2，所述盒體1底面上設置有防滑膠層3，所述盒體1內(nèi)設置有哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i和哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii，所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i和哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii均包括豎直固定板4，所述豎直固定板4頂部設置有水平支撐板5，所述水平支撐板5上設置有多個微柱型凝膠管6，所述微柱型凝膠管6包括反應腔6.1和凝膠分離柱6.2，所述反應腔6.1位于凝膠分離柱6.2上方，所述反應腔6.1頂部設置有一圈凸緣6.3，所述凝膠分離柱6.2內(nèi)自上而下設置有多層分離網(wǎng)6.4，所述凸緣6.3擱置于水平支撐板5上，所述水平支撐板5下方設置有支撐架7，所述微柱型凝膠管6插裝于支撐架7內(nèi)，所述水平支撐板5上方設置有保護膜8，所述保護膜8覆蓋于多個微柱型凝膠管6的凸緣6.3上；所述反應腔6.1內(nèi)壁上均勻設置有多個緩沖凸點6.5；所述水平支撐板5正面平行設置有多個隔條9，所述隔條9設置于相鄰兩個微柱型凝膠管6之間；所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i有6個微柱型凝膠管6，每個微柱管中均含有葡聚糖凝膠顆粒，凝膠顆粒中含有抗igg或抗c3d成分；所述哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii有8個微柱型凝膠管6，每個微柱管中均含有葡聚糖凝膠顆粒，凝膠顆粒中含有抗igg+c3d成分；所述試劑盒的盒體內(nèi)還設置有哌拉西林處理紅細胞、非哌拉西林處理紅細胞、抗體陽性對照液和抗體陰性對照液，所述哌拉西林處理紅細胞是通過哌拉西林藥物溶液處理的正常o型rh陰性紅細胞，濃度為2～2.5%；所述非哌拉西林處理紅細胞是濃度為2～2.5%的正常o型rh陰性紅細胞；所述哌拉西林抗體陽性対照液是哌拉西林抗體陽性血清；所述哌拉西林抗體陰性對照液是哌拉西林抗體陰性血清。其制備方法包括以下步驟：一、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i的制備：步驟一、量取按批量使用符合要求的器具將葡聚糖凝膠（溶脹膠）量取轉(zhuǎn)移至潔凈并滅菌的容器中；步驟二、洗滌用0.9%氯化鈉溶液洗滌葡聚糖凝膠（溶脹膠），0.9%氯化鈉溶液與葡聚糖凝膠（溶脹膠）體積比為2:1，充分混勻，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作6~8次，得洗滌后凝膠，作好標識；作為優(yōu)選，洗滌后的凝膠中可添加乳糖0.02-0.1（v/v）%、以及檸檬酸三鉀20mg-40mg%，在試劑盒保存過程中穩(wěn)定體系的ph值，并保持良好的均勻度。步驟三、配制按批量分別量取抗人球蛋白試劑（抗igg）、抗人球蛋白試劑（抗c3d）、0.9%氯化鈉溶液，按抗體與凝膠體積比1:5的比例，將上述試劑分別加入洗滌后凝膠中混合，分別用器具混合均勻成抗體凝膠，分別作好標識；步驟四、灌裝、離心微管序號123456抗體凝膠抗igg凝膠抗c3d凝膠空白凝膠抗igg凝膠抗c3d凝膠空白凝膠將步驟三配制的凝膠按照每孔20～30μl的抗體凝膠量將各種凝膠加入微管中。步驟五、封口離心結束后，卡轉(zhuǎn)移至封口機上封口。封口條件為：壓力3.0kg、溫度163±2℃，時間4秒/卡；二、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii的制備：步驟一、量取按批量使用符合要求的器具將葡聚糖凝膠（溶脹膠）量取轉(zhuǎn)移至潔凈并滅菌的容器中；步驟二、洗滌用0.9%氯化鈉溶液洗滌葡聚糖凝膠（溶脹膠），0.9%氯化鈉溶液與葡聚糖凝膠ii（溶脹膠）體積比為2:1，充分混勻，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，重復操作6～8次，再用凝膠浸泡液浸泡所得凝膠15分鐘，凝膠浸泡液與凝膠體積比為1:1，2000rpm離心1分鐘后移去上清液，得洗滌后凝膠，作好標識；作為優(yōu)選，洗滌后的凝膠中可添加乳糖0.02-0.1（v/v）%、以及檸檬酸三鉀20mg-40mg%，在試劑盒保存過程中穩(wěn)定體系的ph值，并保持良好的均勻度。步驟三、配制量取抗人球蛋白試劑（抗igg＋c3d），按抗體與凝膠體積比為1:5～1:2的比例，將抗人球蛋白試劑（抗igg＋c3d）加入洗滌后的凝膠中混合，分別用器具混合均勻成抗體凝膠，作好標識待用；步驟四、灌裝、離心微管序號12345678抗體凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠抗igg＋c3d凝膠將步驟二配制的凝膠按照每孔25～35μl的抗體凝膠量將抗人球蛋白試劑（抗igg＋c3d）凝膠加入微管中。步驟五、封口離心結束后，卡轉(zhuǎn)移至封口機上封口。封口條件為：0.3～0.35mpa壓力、溫度158±1℃，時間3秒/卡；三、哌拉西林處理紅細胞的制備：步驟一、過濾、洗滌取o型原料血紅細胞，用一次性白細胞過濾器過濾。將三人份的o型原料血紅細胞混合，用0.9%氯化鈉溶液洗滌（原料血與0.9%氯化鈉溶液體積比為1:4），3000rpm離心1分鐘后移去上清液。重復操作2～4次。步驟二、藥物致敏a哌拉西林藥物溶液配制：稱取硼酸、氯化鉀，加純化水充分溶解，配制為0.1mol/lph為9.3～10.2的硼酸緩沖液，加入稱取的哌拉西林，充分溶解混勻，即得哌拉西林藥物溶液。b哌拉西林藥物處理細胞：量取哌拉西林藥物溶液，加入o型紅細胞壓積，37℃孵育1小時，每隔10～20分鐘混勻一次。0.9%氯化鈉溶液洗滌致敏紅細胞2～4次（或直到上清無溶血現(xiàn)象），用紅細胞保存液稀釋至2～2.5%濃度，2～8℃保存。所述紅細胞保存液中至少包括膽固醇200～600mg/l、人血清白蛋白5～20g/l、乳糖0.02-0.1（v/v）%、十八烷基胺乙酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、聚醚硫酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、堿金屬如鈉、鉀作為調(diào)節(jié)劑。步驟三、分裝取哌拉西林藥物處理細胞，分裝至滴瓶中，每瓶2.5ml，于2～8℃保存。四、非哌拉西林處理細胞的制備：步驟一、過濾、洗滌取o型原料血紅細胞，用一次性白細胞過濾器過濾。將三人份的o型原料血紅細胞混合，用0.9%氯化鈉溶液洗滌（原料血與0.9%氯化鈉溶液體積比為1:4），3000rpm離心1分鐘后移去上清液。重復操作2～4次。用紅細胞保存液稀釋至2～2.5%濃度，2～8℃保存。所述紅細胞保存液中至少包括膽固醇200～600mg/l、人血清白蛋白5～20g/l、乳糖0.02-0.1（v/v）%、十八烷基胺乙酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、聚醚硫酸堿金屬鹽1000-1800mg/l、堿金屬如鈉、鉀作為調(diào)節(jié)劑。步驟二、分裝取非哌拉西林藥物處理細胞，分裝至滴瓶中，每瓶1ml，于2～8℃保存。五、哌拉西林抗體陽性對照的制備：步驟一、過濾取哌拉西林抗體陽性血清，過濾。步驟二、分裝取過濾后的哌拉西林抗體陽性血清，分裝至聚乙烯瓶中，每瓶1.5ml，于2～8℃保存。六、哌拉西林抗體陰性對照的制備：步驟一、過濾取哌拉西林抗體陰性血清，過濾。步驟二、分裝取過濾后的哌拉西林抗體陰性血清，分裝至聚乙烯瓶中，每瓶1.5ml，于2～8℃保存。哌拉西林誘導型溶血檢測試劑盒的使用1.哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i（直接抗人球蛋白試驗dat）檢驗方法：（1）患者紅細胞懸液的配制：患者新鮮血液樣本壓積紅細胞用0.9%氯化鈉溶液洗滌一次得到壓積紅細胞，用0.9%氯化鈉溶液配制0.5~1%濃度的紅細胞懸液（取壓積紅細胞8μl加入到1ml0.9%氯化鈉溶液中）；（2）取哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i，每份待檢患者樣本標記3孔（分別為抗igg、抗c3d及ctrl）；（3）向標記的每孔中加入患者樣本0.5~1.0%的紅細胞懸液50μl；（4）混勻，置微柱凝膠卡配套專用離心機離心5分鐘（900rpm×2min、1500rpm×3min），觀察結果并記錄。2.哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii檢驗方法（1）取哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii，4孔分別標記為“1”、“2”、“3”、“4”；（2）哌拉西林處理紅細胞懸液的配制：取試劑盒中哌拉西林處理紅細胞用0.9%氯化鈉溶液洗滌三次后得到壓積紅細胞，用0.9%氯化鈉溶液配制成2~2.5%濃度的紅細胞懸液；（3）向第1、2、3孔的每孔中加入哌拉西林處理的紅細胞懸液各25μl；（4）向第4孔中加入非哌拉西林處理的紅細胞懸液25μl；（5）向第1和第4孔中分別加入待檢樣本0.9%氯化鈉溶液1：5稀釋的血漿50μl，第2孔中加入陽性對照液50μl，第3孔中加入陰性對照液50μl；（6）混勻，置免疫微柱孵育器37±1°c孵育30分鐘；（7）置微柱凝膠卡配套專用離心機離心5分鐘(900rpm×2min,1500rpm×3min)，觀察結果并記錄。3、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡i—直接抗人球蛋白試驗(dat)結果判定：注：“+”表示陽性，紅細胞在凝膠表面或分散膠中；“0”表示陰性，紅細胞沉于微柱凝膠孔底部。4、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑卡ii檢測結果判定5、哌拉西林誘導型溶血檢測試劑盒（微柱凝膠法）檢測結果判定本發(fā)明哌拉西林誘導型溶血檢測試劑盒可以具有優(yōu)良的靈敏度、穩(wěn)定性，是在于整個體系中各種成分的協(xié)同作用：微柱凝膠卡上排列有多個微柱管可以完成多次檢測；緩沖體系可以維持微柱凝膠卡反應體系需要的ph；低鹽濃度體系可以保證凝膠顆粒得到充分溶脹且凝膠顆粒直徑在所需要的范圍內(nèi)；潤滑體系可以保證凝膠顆粒之間適當?shù)臐櫥芰?；酯類防腐劑可以防止凝膠或抗體因為細菌繁殖而失效；丙烯酰化的凝膠可以保證凝膠顆粒之間合適的間隙。除上述實施例外，本發(fā)明還包括有其他實施方式，凡采用等同變換或者等效替換方式形成的技術方案，均應落入本發(fā)明權利要求的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12