本發(fā)明涉及醫(yī)藥檢測
技術領域：
，具體涉及利用液質聯(lián)用方法檢測和鑒定芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法。
背景技術：
：芍藥苷來源于芍藥科植物芍藥根、牡丹根、紫牡丹根，芍藥苷的分子式是c23h28o11，分子量為480，熔點196℃，具有擴張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、解熱解痙、利尿的作用。關于中藥赤芍的研究與開發(fā)已經(jīng)做了大量的工作，從研究內容看，以赤芍的化學成分、質量控制及藥理作用機制研究為主，涉及赤芍中活性部位單萜苷類物質的體內代謝研究相對較少。國內外學者對赤芍和芍藥苷的體內代謝做了研究，檢測和鑒定芍藥苷在體內的代謝產(chǎn)物從而根據(jù)代謝產(chǎn)物推測芍藥苷的體內主要代謝類型為水解反應、氧化反應和結合反應。藥物體內代謝是研究藥物在生物體內的吸收、分布、轉化和排泄等過程的特點和規(guī)律的一門科學，即藥物分子被機體吸收后，在機體作用下發(fā)生的化學結構的變化。目前化學藥物的代謝研究已經(jīng)深入到藥物代謝酶的表達和調控以及利用體外研究預測藥物在體內的相互作用階段。藥物經(jīng)合適的給藥途徑進入機體后，在體內發(fā)生一系列的變化，藥物體內代謝主要是ⅰ相和ⅱ相反應，ⅰ相反應主要是官能團反應，ⅱ相反應主要是結合反應。藥物在體內經(jīng)過一系列酶的代謝，很多酶除了催化藥物代謝也催化內源性物質的代謝，藥物和內源性物質的代謝有競爭和干擾，因很多內源性物質在體內不斷變化，故給體內分析增加了一定的難度。我國擁有十分豐富的中草藥資源，所以研究中草藥在體內轉化過程中母核結構復雜易變的天然活性成分的藥物代謝，通過藥物的代謝轉化研究，認識藥物在體內的結構變化，進而了解藥物在體內產(chǎn)生作用的分子形式，了解藥物的代謝機制，推測其作用靶點或作用方式具有重要的意義。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有研究的空缺，提供利用液質聯(lián)用方法檢測和鑒定芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法。本發(fā)明具有操作簡便、樣品處理簡單、分析速度快、特異性強、靈敏度高，且可分析比較芍藥苷在體內血液、尿液及糞便中的代謝情況，進而進行鑒定。本發(fā)明采用的技術方案為：一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟：灌胃給予主體芍藥苷標準溶液，灌胃給藥兩天，給藥間隔為24h；收集樣品及進行前處理；液質聯(lián)用對收集的樣品進行檢測和鑒定。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集樣品及進行前處理包括收集尿樣樣品及進行前處理、收集糞樣樣品及進行前處理和收集血樣樣品及進行前處理。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集尿樣樣品及進行前處理是：第一次灌胃給藥后24小時期間收集尿液，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的尿液混合，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至干，加入甲醇溶液超聲提取，離心，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，為尿樣樣品。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集糞樣樣品及進行前處理是：第一次灌胃給藥后24小時期間收集糞便，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的糞樣混合，加入甲醇溶液超聲提取，濾紙濾過，離心，取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，為糞便樣品。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的收集血樣樣品及進行前處理是：第二次灌胃給藥后，在一定間隔時間內分5次眼眶靜脈叢取血，置肝素化試管中，充分混勻，離心，取血漿，合并各組血漿，置-20℃冰箱中冷凍保存；將凍存血漿取出置于室溫下緩慢溶解，加入甲醇溶液沉淀蛋白，混勻振蕩1min，離心，吸取上清液，0.22μm微孔濾膜過濾，為血樣樣品。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，第二次灌胃給藥后，于0.5h，1h，2h，12h，18h分5次從眼眶靜脈叢取血。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的主體是人體、鼠、兔、或狗。上述的一種利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，所述的液質聯(lián)用對收集的樣品進行檢測，檢測條件為：1)一級液質條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進樣量：0.6μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示：表1時間(min)a(％)b(％)05954.859513.289215892211288332575426040481000521000質譜條件：離子化模式：電噴霧電離負源模式；毛細管電壓為-3.5kv；霧化氣壓：5.0bar；霧化氣體：氮氣；氣體流量：10.0ml/min；干燥溫度：200℃；質量監(jiān)測范圍是100-1000m/z；2)二級液質條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進樣量：2μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示。質譜條件：離子化模式：電噴霧電離負源模式；毛細管電壓為-2.8kv；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：300℃；碰撞能量：15ev-35ev；質量監(jiān)測范圍：100-1000m/z；霧化氣體：氮氣；氣體流量：1.50ml/min。本發(fā)明，用ms-dial軟件分別對所有樣品原始數(shù)據(jù)進行讀取篩選以及總離子流和選擇離子色譜圖的檢識，篩選出新增加的色譜峰，即為代謝產(chǎn)物，并通過高分辨率的一級質譜數(shù)據(jù)結合軟件推導出代謝物的分子式。通過軟件ms2analyzerver2.1對樣品中的母離子和子離子存在一些特定的中性丟失，對化合物結構推導提供參考。用masslynxv4.1軟件對代謝產(chǎn)物二級離子碎片進行讀??；利用化合物數(shù)據(jù)庫結合上述軟件對化合物結構進行推導，并利用文獻和cfm-id軟件對結構進行佐證。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明采用對芍藥苷進行大鼠體內代謝，通過液質聯(lián)用檢測方法對芍藥苷代謝產(chǎn)物進行測定，并比對芍藥苷在大鼠體內血液、尿液和糞便中的代謝差異。結果表明：從芍藥苷代謝物中檢測到10個代謝物，10個代謝產(chǎn)物結構已被確定，其中有4個是首次發(fā)現(xiàn)的新的代謝產(chǎn)物，有6個代謝產(chǎn)物結構已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。其中首次發(fā)現(xiàn)的新的芍藥苷代謝物是：在大鼠糞樣中發(fā)現(xiàn)在體內經(jīng)過水解去葡萄糖，水解開環(huán)，脫苯甲?；?，還原反應，再發(fā)生閉環(huán)反應形成芍藥苷代謝素ⅱ(shuyz,hattorim,akaot,etal.metabolismofpaeoniflorinandrelatedcompoundsbyhumanintestinalbacteria.ii.:structuresof7s-and7r-paeonimetabolinesiandiiformedbybacteroidesfragilisandlactobacillusbrevis(pharmacognosy,chemical)[j].chemical&pharmaceuticalbulletin,1987,35:3726-3733.)，芍藥苷代謝素ⅱ被氧化，再與葡萄糖發(fā)生結合反應形成代謝產(chǎn)物3，經(jīng)ms1和ms2質譜分析確證，檢測到[m-h]-為377.1465，準分子離子丟失一個氧生成m/z361碎片離子峰，碎片離子m/z253再脫掉2個co形成m/z197，確定代謝產(chǎn)物a3為氧化芍藥苷代謝素ii葡萄糖苷；本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了在芍藥苷中的新的代謝產(chǎn)物a2、a3、a7、a8，對芍藥苷在大鼠體內代謝進行更完整的表述；通過采用高效液相色譜串聯(lián)質譜及其綜合數(shù)據(jù)處理分析的方法，可以同時準確定性多種芍藥苷體內代謝產(chǎn)物。由于中藥成分在體內代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有復雜性的特點，本發(fā)明建立了一種根據(jù)已有信息重點分析具有藥物活性的單體化合物在體內代謝情況的分析方法。通過液質聯(lián)用檢測系統(tǒng)得到基礎數(shù)據(jù)，利用液質聯(lián)用分析數(shù)據(jù)的龐大，建立一種通過幾種數(shù)據(jù)處理軟件ms-dialms-dial、ms2analyzerver2.1、watersmasslynxv4.1等處理數(shù)據(jù)，再利用數(shù)據(jù)庫分析數(shù)據(jù)的綜合數(shù)據(jù)處理分析方法，可以準確定性多種芍藥苷體內代謝產(chǎn)物，從而從一定程度上解決了目前中藥成分分析領域中存在的很難根據(jù)所獲得的結構信息準確推測出各化合物的具體分子結構的難題。通過比較芍藥苷單獨給藥后進入動物體內后的轉運和轉化，進而揭示芍藥苷的代謝過程，及體內代謝特征，闡明赤芍作用機制及其科學內涵、促進赤芍新藥開發(fā)和劑型改進以及控制中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。本發(fā)明通過比較芍藥苷進入動物體內后的轉運和轉化，進而揭示芍藥苷的代謝過程，及體內代謝特征，闡明赤芍作用機制及其科學內涵、促進赤芍新藥開發(fā)和劑型改進以及控制中醫(yī)的方藥理論均具有重要意義。附圖說明圖1為芍藥苷標準品體外對照組溶液總離子流色譜圖。圖2為大鼠空白尿樣總離子流色譜圖。圖3為芍藥苷在大鼠體內轉化的尿樣總離子流色譜圖。圖4為大鼠空白糞樣總離子流色譜圖。圖5為芍藥苷在大鼠體內轉化的糞樣總離子流色譜圖。圖6為大鼠空白血漿樣總離子流色譜圖。圖7為芍藥苷在大鼠體內轉化的血漿樣總離子流色譜圖。圖8-16分別為芍藥苷在大鼠體內轉化的代謝產(chǎn)物a1-a10的提取離子色譜圖。圖17為芍藥苷在大鼠體內轉化的代謝產(chǎn)物a1-a10的結構式。圖18為芍藥苷在大鼠體內轉化成代謝產(chǎn)物a3的途徑。具體實施方式實施例1利用液質聯(lián)用方法檢測芍藥苷體內代謝產(chǎn)物的方法，包括以下步驟：1)芍藥苷的制備將5kg赤芍藥材飲片粉碎，取250g，加入10倍量的70％乙醇，浸泡一夜，采用加熱回流方法對浸泡的赤芍提取，共提取三次，提取時間分別為2h，1h，1h。將提取液用三層紗布過濾藥渣，合并溶液，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，隨后用正丁醇萃取三次，合并正丁醇萃取液，旋轉蒸發(fā)，得到浸膏。然后采用色譜方法，包括吸附硅膠柱色譜、tlc、hplc、中壓制備液相等手段進行分離得到芍藥苷，其結構根據(jù)它們的光譜數(shù)據(jù)鑒定(uv,ir,ms,1h-nmr,13c-nmr)，經(jīng)hplc分析其純度大于98％。2)體外溶液和灌胃給藥溶液的制備芍藥苷標準溶液的配置：取芍藥苷標準品2.0g，用蒸餾水溶解，定容至10ml容量瓶中，搖勻，超聲溶解10min，即為0.20g/ml的芍藥苷供試品溶液，通過0.22μm微孔濾膜進行過濾。灌胃溶液的制備：取適量芍藥苷標準溶液，用蒸餾水溶解，制成6.25mg/ml的芍藥苷灌胃液。3)動物和給藥取12只健康sd大鼠，雄性，體重250g左右。禁食12h，期間自由飲水。隨機分為二組，每組6只，分別為空白對照組，芍藥苷給藥組。灌胃給藥兩天，給藥間隔為24h。芍藥苷給藥組劑量為50mg/kg大鼠(芍藥苷樣品濃度為6.25mg/ml，灌胃給藥2ml)，空白對照組給同樣體積的蒸餾水。4)樣品的采集和處理尿樣樣品的采集和處理：第一次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對照組)后24小時期間收集尿液，每次收集之后置-20℃冰箱保存，最終將收集到的尿液混合，用旋轉蒸發(fā)儀在50℃濃縮至干，加入20ml甲醇超聲提取30min，5000r/min離心15min，取上清液，過0.22μm微孔濾膜，為尿樣樣品，待液質分析。糞樣樣品的采集和處理：第一次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對照組)后24小時期間收集糞便，冷凍保存，加入20ml甲醇超聲提取20min，濾紙濾過，5000r/min離心10min，吸取上層溶液，過0.22μm濾膜，為糞樣樣品，待液質分析。血樣樣品的采集和處理：第二次灌胃給藥(包括芍藥苷組和空白對照組)后，分別在給藥后0.5h，1h，2h，12h，18h分5次眼眶靜脈叢取血各1ml，置肝素化試管中，充分混勻，以5000r/min離心10min，取血漿，合并各組血漿，置-20℃冰箱中冷凍保存。將凍存血漿取出置于室溫下緩慢溶解，加入15ml甲醇沉淀蛋白，渦旋混合1min，以14000r/min離心15min，吸取上清液，以0.22μm微孔濾膜過濾，為血樣樣品，待液質分析。5)樣品檢測，液質聯(lián)用對收集的樣品進行檢測，檢測條件為：一級液質條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進樣量：0.6μl；柱溫30℃；流速為0.21ml/min；流動相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示：表1時間(min)a(％)b(％)05954.859513.289215892211288332575426040481000521000質譜條件：離子化模式：電噴霧電離負源模式；毛細管電壓：-3.5kv；霧化氣壓：5.0bar；霧化氣體：氮氣；氣體流量：10.0ml/min；干燥溫度：200℃；質量監(jiān)測范圍是100-1000m/z。二級液質條件：色譜條件：色譜柱：diamonsiltmodsc18；進樣量：2μl；柱溫：30℃；流速：0.21ml/min；流動相：乙腈(a)和含0.1％甲酸的水溶液(b)；色譜梯度如表1所示。質譜條件：離子化模式：電噴霧電離負源模式；毛細管電壓：-2.8kv；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：300℃；碰撞能量為15ev-35ev；質量監(jiān)測范圍是100-1000m/z；霧化氣體：氮氣；氣體流量：1.50ml/min。6)數(shù)據(jù)處理方法用ms-dial軟件分別對所有樣品原始數(shù)據(jù)進行讀取、篩選以及總離子流和選擇離子色譜圖的檢識，篩選出新增加的色譜峰，即為代謝產(chǎn)物，并通過高分辨率的一級質譜數(shù)據(jù)結合軟件推導出代謝物的分子式。通過軟件ms2analyzerver2.1對樣品中的母離子和子離子存在一些特定的中性丟失，對化合物結構推導提供參考。用masslynxv4.1軟件對代謝產(chǎn)物二級離子碎片進行讀??；利用化合物數(shù)據(jù)庫結合上述軟件對化合物結構進行推導，并利用文獻和cfm-id軟件對結構進行佐證。圖1為芍藥苷標準品體外溶液總離子流色譜圖，圖2為大鼠空白尿樣總離子流色譜圖，圖3為芍藥苷在大鼠體內轉化的尿樣總離子流色譜圖，通過對比圖1和圖2，圖3可以看出，芍藥苷在大鼠體內轉化后，在保留時間分別為6.70、7.90、8.58、12.60、14.48和27.33min均出現(xiàn)了新增加的峰。圖4為大鼠空白糞樣總離子流色譜圖，圖5為芍藥苷在大鼠體內轉化的糞樣總離子流色譜圖，通過對比圖1和圖4，圖5可以看出，芍藥苷在大鼠體內轉化后，在保留時間為6.70、7.13、8.58、14.48、18.37和26.77min出現(xiàn)了新增加的峰。圖6為大鼠空白血漿樣總離子流色譜圖，圖7為芍藥苷在大鼠體內轉化的血漿樣總離子流色譜圖，同樣通過對比圖1，圖6和圖7可以看出，芍藥苷在大鼠體內轉化后，在保留時間為4.26min出現(xiàn)了新增加的峰。對比圖1可以看出芍藥苷已經(jīng)完全轉化，即芍藥苷在大鼠體內轉化后，通過液質聯(lián)用檢測方法，得到了10個代謝產(chǎn)物；圖8-16分別為芍藥苷在大鼠體內的代謝產(chǎn)物a1-a10的提取離子色譜圖，可以看到在保留時間依次為4.26、6.70、7.13、7.90、8.58、12.60、14.48、18.37、26.77和27.33min的代謝物，并通過液質二級碎片的推測，如圖17所示得到了代謝產(chǎn)物a1-a10的結構。圖18為芍藥苷的代謝產(chǎn)物a3的代謝途徑示意圖。圖中看出，通過實施例1的方法可以測定并得到芍藥苷在大鼠體內轉化的代謝產(chǎn)物。當前第1頁12