本發(fā)明涉及一種用于飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)蛋白和核酸的兩用芯片，能質(zhì)譜檢測(cè)蛋白和核酸分子，屬于質(zhì)譜檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是從整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、活動(dòng)規(guī)律及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，是功能基因組學(xué)時(shí)代一門新的科學(xué)。包括鑒定蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾形式、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。根據(jù)研究目的，蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)用于細(xì)胞內(nèi)蛋白樣品表達(dá)的定量研究。以繪制出蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或存在于一個(gè)特殊的細(xì)胞器中的蛋白為研究目的的蛋白質(zhì)組學(xué)稱為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)，用于建立細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)圖譜并解釋某些特定蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的作用[2]。功能蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能及蛋白質(zhì)之間的相互作用為研究目的，通過對(duì)選定的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究和分析，能夠提供有關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化、糖基化等重要信息。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心就是能夠系統(tǒng)的鑒定一個(gè)細(xì)胞或組織中表達(dá)的每一個(gè)蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)的性能。蛋白質(zhì)組學(xué)的主要相關(guān)技術(shù)有雙向凝膠電泳、雙向熒光差異凝膠電泳、質(zhì)譜分析等[2]。由于蛋白質(zhì)的高度復(fù)雜性和大量低豐度蛋白質(zhì)的存在，對(duì)分析技術(shù)提出了巨大挑戰(zhàn)，生物質(zhì)譜技術(shù)則是適應(yīng)這一挑戰(zhàn)的必然選擇，近期飛速發(fā)展的即為maldi-tof質(zhì)譜。

基于maldi-tof質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于微生物鑒定和分類與傳統(tǒng)的方法以及現(xiàn)在主要在用的自動(dòng)化儀器相比，具有以下特點(diǎn)：

①操作簡(jiǎn)單、快速?？蓪蝹€(gè)微生物菌落或其它生物材料直接加到maldi樣品靶上并使用maldi-tof質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，譜圖識(shí)別可以在幾分鐘內(nèi)完成，且數(shù)據(jù)評(píng)估同測(cè)定直接連接。這種簡(jiǎn)單且唯一的工作流程對(duì)于絕大多數(shù)微生物的鑒定是足夠的，且不需要進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶測(cè)試或pcr引物和條件選擇。

②重復(fù)性好。在很寬的條件范圍內(nèi)，maldi方法都被證明是很穩(wěn)定的。生長(zhǎng)培養(yǎng)基的不同組成對(duì)峰模式分布影響非常小，如在從4000到12000da的范圍內(nèi)，幾乎沒有觀察到培養(yǎng)基的影響。同樣，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)峰模式也沒有影響，緩慢生長(zhǎng)期的細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期或者死亡期的細(xì)胞具有相似的模式。在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行樣本制備和測(cè)量后，在不同的maldi-tof儀器上獲取的質(zhì)譜譜圖具有很高的可比性，如在3個(gè)不同的儀器上，對(duì)同一樣本靶測(cè)量的譜圖實(shí)際上是一致的。因此，來自于不同maldi-tof質(zhì)譜儀的譜圖可以用來建立真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)庫(kù)。這種高重復(fù)性是建立在對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的高豐度的蛋白質(zhì)測(cè)量基礎(chǔ)上的，如核糖體蛋白質(zhì)。在很少出現(xiàn)代謝物的2000到20000da質(zhì)量范圍內(nèi)，波譜圖可被觀察到。與活細(xì)胞相比，細(xì)菌芽孢可以產(chǎn)生明顯不同的峰模式，而且這些“芽孢譜圖”也具有重復(fù)性。目前，儀器的高靈敏度可以檢測(cè)到低至100ng或10⁵個(gè)細(xì)胞。而對(duì)于使用clin-tof儀器，25ng的生物材料就能滿足需求。

③準(zhǔn)確度高。maldi-tofms獲得的蛋白指紋圖譜用作模式匹配，匹配分值用作鑒定結(jié)果的分級(jí)和歸類。maldi軟件對(duì)所得的圖譜進(jìn)行分析統(tǒng)一化，這種校正和統(tǒng)計(jì)運(yùn)算保證了鑒定的精確性，目前可鑒定背離了5000ppm的質(zhì)譜圖。蛋白指紋主要集中在2-20kda受到微生物生長(zhǎng)環(huán)境和狀態(tài)影響很小的持續(xù)高表達(dá)蛋白。

生物質(zhì)譜以其無可比擬的優(yōu)越性成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必不可少的技術(shù)平臺(tái)。隨著質(zhì)譜的靈敏度、精確度和高通量的不斷發(fā)展，質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中扮演者越來越重要的角色。它在蛋白質(zhì)鑒定、序列分析、定量、翻譯后加工及蛋白質(zhì)的相互作用等方面已得到了較廣泛的應(yīng)用。同樣，maldi-tof質(zhì)譜的高靈敏度、高精確度和高通量在基因組學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域優(yōu)勢(shì)也尤為突出。

基因組研究應(yīng)該包括兩方面的內(nèi)容：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structuralgenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(functionalgenomics)，又被稱為后基因組(postgenome)研究，成為系統(tǒng)生物學(xué)的重要方法。

基因組dna測(cè)序是人類對(duì)自身基因組認(rèn)識(shí)的第一步。隨著測(cè)序的完成，功能基因組學(xué)研究成為研究的主流，它從基因組信息與外界環(huán)境相互作用的高度，闡明基因組的功能。功能基因組學(xué)的研究?jī)?nèi)容：人類基因組dna序列變異性研究、基因組表達(dá)調(diào)控的研究、模式生物體的研究和生物信息學(xué)的研究等。

(1)基因組表達(dá)及調(diào)控的研究。在全細(xì)胞的水平，識(shí)別所有基因組表達(dá)產(chǎn)物mrna和蛋白質(zhì)，以及兩者的相互作用，闡明基因組表達(dá)在發(fā)育過程和不同環(huán)境壓力下的時(shí)、空的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

(2)人類基因信息的識(shí)別和鑒定。要提取基因組功能信息，識(shí)別和鑒定基因序列是必不可少的基礎(chǔ)工作?；蜃R(shí)別需采用生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)技術(shù)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手段，并將理論方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來。基于理論的方法主要從已經(jīng)掌握的大量核酸序列數(shù)據(jù)入手，發(fā)展序列比較、基因組比較及基因預(yù)測(cè)理論方法。識(shí)別基因的生物學(xué)手段主要基于以下的原理和思路：根據(jù)可表達(dá)序列標(biāo)簽(sts)；對(duì)染色體特異性cosmid進(jìn)行直接的cdna選擇；根據(jù)cpg島；差異顯示及相關(guān)原理；外顯子捕獲及相關(guān)原理；基因芯片技術(shù)；基因組掃描；突變檢測(cè)體系，等等。

(3)基因功能信息的提取和鑒定。包括：人類基因突變體的系統(tǒng)鑒定；基因表達(dá)譜的繪制；“基因改變-功能改變”的鑒定；蛋白質(zhì)水平、修飾狀態(tài)和相互作用的檢測(cè)。

(4)在測(cè)序和基因多樣性分析。人類基因組計(jì)劃得到的基因組序列雖然具有代表性，但是每個(gè)人的基因組并非完全一樣，基因組序列存在著差異?；蚪M的差異反映在表型上就形成個(gè)體的差異，如黑人與白人的差異，高個(gè)與矮個(gè)的差異，健康人與遺傳病人的差異，等等。出現(xiàn)最多基因多態(tài)性就是單核苷酸多態(tài)性(snps)。

(5)比較基因組學(xué)。將人類基因組與模式生物基因組進(jìn)行比較，這一方面有助于根據(jù)同源性方法分析人類基因的功能，另一方面有助于發(fā)現(xiàn)人類和其他生物的本質(zhì)差異，探索遺傳語言的奧秘。

maldi-tof飛行時(shí)間質(zhì)譜完成的snp檢測(cè)準(zhǔn)確率可達(dá)99.9％，除了準(zhǔn)確性高、靈活性強(qiáng)、通量大、檢測(cè)周期短等優(yōu)勢(shì)外，最有吸引力的應(yīng)該還是它的性價(jià)比。maldi-tof飛行時(shí)間質(zhì)譜平臺(tái)是國(guó)際通用的基因單核苷酸多態(tài)性(snp)的研究平臺(tái)，該方法憑借其科學(xué)性和準(zhǔn)確性已經(jīng)成為該領(lǐng)域的新標(biāo)準(zhǔn)。

雖然maldi-tof飛行時(shí)間質(zhì)譜能夠用于檢測(cè)蛋白或核酸分子，但從應(yīng)用角度來看，傳統(tǒng)的maldi芯片應(yīng)用領(lǐng)域單一，如shimadzu生產(chǎn)的de1580ta鋼片靶板，只用于蛋白微生物鑒定，適用于shimadzu的maldi-tofaxima；agena生產(chǎn)的l24spectrochip芯片，只用于基因檢測(cè)，適用于agena的maldi-tofmassarry，目前未見到能同時(shí)覆蓋基因組學(xué)檢測(cè)或蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定兩種檢測(cè)領(lǐng)域的芯片。

從質(zhì)譜芯片材質(zhì)與表面特性角度來看，傳統(tǒng)的金屬芯片，反復(fù)使用，有劃痕，且表面沒有化學(xué)改性處理，結(jié)晶形態(tài)差，質(zhì)譜檢測(cè)樣本峰的準(zhǔn)確度低，信噪比低，基線高。并且對(duì)于核酸樣品而言，微小核酸殘留會(huì)影響質(zhì)譜結(jié)果。因此，金屬類芯片主要用于蛋白質(zhì)譜檢測(cè)，不能跨界檢測(cè)核酸樣品。而核酸芯片主要使用硅片材質(zhì)，但價(jià)格昂貴，并且基質(zhì)配方被國(guó)外壟斷，并且采購(gòu)的進(jìn)口芯片，表面已經(jīng)直接覆蓋基質(zhì)，限制了其不能用于蛋白質(zhì)譜。

因此，目前需要一種能用于飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)蛋白和核酸的通用芯片，以及芯片表面覆蓋的基質(zhì)配方。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的第一目的是提供一種能用于飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)蛋白和核酸的通用芯片，包括：

(1)芯片主體：主體表面具有微整列排列的親水性點(diǎn)樣孔和疏水性孔外區(qū)；

(2)由金屬底板構(gòu)成的芯片適配器，其中該適配器表面分布多個(gè)與芯片主體匹配的芯片卡槽；

其中，芯片主體選自質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的金剛石、單晶硅、石英晶體的芯片；

所述親水性點(diǎn)樣孔覆蓋150-800nm的親水性薄膜，疏水性孔外區(qū)覆蓋150nm-2μm疏水性薄膜，其表面水滴接觸角＞120°。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述親水性薄膜為二氧化硅氧化物薄膜、氧化鋅薄膜、氧化鋁薄膜等，疏水性孔外區(qū)通過硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行處理形成疏水性薄膜。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述硅烷偶聯(lián)劑選自乙烯基硅烷、氨基硅烷或二甲基二氯硅烷。

在另一實(shí)施方案中，所述芯片是單面拋光的硅芯片或石英芯片，所示親水性點(diǎn)樣孔層薄膜厚度為500nm，所述孔外區(qū)的接觸角為＞120°，優(yōu)選約135°、155°。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述芯片上的親水點(diǎn)樣孔數(shù)量為24、40、70、384等孔，或根據(jù)實(shí)際臨床試驗(yàn)或科研過程中生物樣本的檢測(cè)量設(shè)置，親水性點(diǎn)樣孔的形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述親水性點(diǎn)樣孔的孔徑范圍為0.5-2.8mm，所述芯片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實(shí)施方案中，親水點(diǎn)樣區(qū)為圓形，直徑為0.7mm，依據(jù)圓孔直徑選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)用量，如0.5μl，滴定生物標(biāo)志物樣本，結(jié)晶形態(tài)規(guī)則，晶向均一為最佳。

在其他實(shí)施方案中，所述芯片適配器可以根據(jù)芯片尺寸設(shè)計(jì)不同的卡槽，卡槽尺寸為20×30-83×125mm，以實(shí)現(xiàn)一個(gè)適配器保證不同規(guī)格的芯片進(jìn)入檢測(cè)室。

在另一實(shí)施方案中，所述適配器上的微陣列芯片卡槽，可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)不同的形狀，例如正方形，長(zhǎng)方形等，每個(gè)卡槽尺寸為20×20mm-25×60mm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，芯片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個(gè)。

在另外的實(shí)施方案中，所述芯片表面平面度小于10μm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述芯片預(yù)先通過化學(xué)機(jī)械拋光(chemicalmechanismpolish,cmp)被處理具有單面拋光鏡面效應(yīng)。通過cmp方法，對(duì)芯片進(jìn)行兩次拋光，粗拋與細(xì)拋。粗拋目的是去除芯片表面殘留的機(jī)械損傷，一般從表面除去30um范圍內(nèi)的厚度。細(xì)拋目的是去除第一次拋光在芯片表面留下的輕微損傷和云霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經(jīng)過兩次拋光的芯片表面具有鏡面效應(yīng)，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實(shí)時(shí)顯示，可以直接觀測(cè)芯片表面樣本被轟擊的情況，改變激光轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個(gè)更具體實(shí)施方案中，所述芯片是單面拋光的硅芯片或石英芯片。

本發(fā)明第二目的是提供一種對(duì)親水性點(diǎn)樣孔的表面進(jìn)行覆蓋基質(zhì)預(yù)處理的兩用芯片，其中在上述方案的基礎(chǔ)上，預(yù)先使用覆蓋基質(zhì)溶液對(duì)點(diǎn)樣孔進(jìn)行預(yù)處理。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自用于蛋白質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該芯片可用于質(zhì)譜檢測(cè)蛋白。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自用于核酸質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該芯片可用于質(zhì)譜檢測(cè)核酸。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，用于質(zhì)譜檢測(cè)蛋白的基質(zhì)選自α-氰-4-羥基肉桂酸(chca)、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sa)，用于質(zhì)譜檢測(cè)核酸的基質(zhì)是3-羥基-2-吡啶甲酸。

本發(fā)明第三目的是提供用于制備飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)蛋白和核酸的兩用芯片，包括：

(1)選用質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的芯片作為基底或芯片主體；

(2)對(duì)芯片表面進(jìn)行親水處理；

(3)用光刻膠對(duì)親水性點(diǎn)樣孔的封閉處理；

(4)用硅烷偶聯(lián)劑處理芯片；

(5)對(duì)光刻膠封閉的點(diǎn)樣區(qū)進(jìn)行恢復(fù)處理；

(6)將芯片與金屬芯片適配器進(jìn)行匹配安裝。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中通過氧氣流速60～140ml/min，功率100～300w，處理時(shí)間1～10min；再用高純水對(duì)基底表面超聲清洗2～3次，每次時(shí)間為2～5min，使表面徹底清潔并羥基化。

在另一實(shí)施方案中，步驟(3)中采用旋涂的方法將光刻膠旋涂于處理過的基底上，旋涂速度為1000～8000rpm，然后置于光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min后用相應(yīng)的顯影液洗脫后，從而構(gòu)筑出有序結(jié)構(gòu)的點(diǎn)樣孔區(qū)。其中光刻膠使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)、聚苯乙烯。

在其他實(shí)施方案中，步驟(4)中包括：

(i)清洗芯片：將先后浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分別清洗后，取出干燥；

(ii)在加熱條件下，將濃酸和雙氧水緩慢加入含有芯片的水溶液中，進(jìn)行充分氧化反應(yīng)后，分別在氯仿、超純水中進(jìn)行清洗，該步驟可重復(fù)多次；

(iii)將芯片置于干凈容器中，加入預(yù)先水解的硅烷偶聯(lián)劑溶液，并加入氨水催化，直至硅烷化反應(yīng)充分完成；

(iv)取出芯片，分別置于乙醇、超純水、氯仿中，超聲清洗；

(v)將清洗后的芯片，測(cè)量并選擇接觸角＞120°的芯片，作為合格芯片；

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(5)中包括：

(i)將硅烷化處理后的芯片，放入去膠液中，浸泡3小時(shí)；

(ii)芯片取出，放入丙酮溶液中，超聲處理2分鐘，

即可去掉光刻膠，恢復(fù)點(diǎn)樣區(qū)親水表面，形成有親疏水差異的微陣列芯片表面。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，去膠液為聚乙二醇單丁醚或聚二甲基硅氧烷溶液。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述芯片是質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的金剛石、單晶硅、石英晶體的芯片。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述芯片預(yù)先通過化學(xué)機(jī)械拋光(chemicalmechanismpolish,cmp)被處理具有單面拋光鏡面效應(yīng)。通過cmp方法，對(duì)芯片進(jìn)行兩次拋光，粗拋與細(xì)拋。粗拋目的是去除芯片表面殘留的機(jī)械損傷，一般從表面除去30um范圍內(nèi)的厚度。細(xì)拋目的是去除第一次拋光在芯片表面留下的輕微損傷和云霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經(jīng)過兩次拋光的芯片表面具有鏡面效應(yīng)，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實(shí)時(shí)顯示，可以直接觀測(cè)芯片表面樣本被轟擊的情況，改變激光轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個(gè)更具體實(shí)施方案中，所述芯片是單面拋光的硅芯片或石英芯片。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(4)所述硅烷偶聯(lián)劑選自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷。其中，二甲基二氯硅烷生長(zhǎng)疏水膜操作簡(jiǎn)單，接觸較大，疏水性佳，疏水層厚度能達(dá)到納米至微米量級(jí)，因此硅烷偶聯(lián)劑優(yōu)選是二甲基二氯硅烷。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，被所述偶聯(lián)劑整體硅烷化的疏水表面，其接觸角＞120°，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接觸角＞150°，以形成超疏水表面。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疏水表面的厚度在納米到微米量級(jí)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述芯片上的親水性點(diǎn)樣孔數(shù)量為24,、40、70、384等孔，或根據(jù)實(shí)際臨床試驗(yàn)或科研過程中生物樣本的檢測(cè)量設(shè)置，親水性點(diǎn)樣孔形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述親水性點(diǎn)樣孔的孔徑范圍為0.5-2.8mm，所述芯片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實(shí)施方案中，親水性點(diǎn)樣孔為圓形，直徑為0.7mm，依據(jù)圓孔直徑選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)用量，如0.5μl，滴定生物標(biāo)志物樣本，結(jié)晶形態(tài)規(guī)則，晶向均一為最佳。

在其他實(shí)施方案中，所述微陣列芯片卡槽可以根據(jù)需要選擇正方形，長(zhǎng)方形等，每個(gè)卡槽范圍為20×20mm-25×60mm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，芯片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個(gè)，甚至更多。

本發(fā)明第四目的是提供制備飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)蛋白或核酸的芯片，包括：上述任一方案的步驟，以及，預(yù)先使用覆蓋基質(zhì)溶液對(duì)點(diǎn)樣區(qū)進(jìn)行預(yù)處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自蛋白質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該芯片可用于質(zhì)譜檢測(cè)蛋白。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自核酸質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該芯片可用于質(zhì)譜檢測(cè)核酸。

本發(fā)明第五目的是提供包括上述芯片的質(zhì)譜兩用檢測(cè)試劑盒，包括：

真空包裝的多個(gè)兩用芯片以及金屬芯片適配器；

核酸和/或蛋白質(zhì)譜基質(zhì)溶液；

以及使用說明書。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩用芯片已經(jīng)預(yù)先插入金屬芯片適配器中。

在另一實(shí)施方案中，所述芯片已經(jīng)預(yù)先使用覆蓋基質(zhì)溶液。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自蛋白質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該試劑盒可用于質(zhì)譜檢測(cè)蛋白。在另一實(shí)施方案中，當(dāng)基質(zhì)溶液選自核酸質(zhì)譜的基質(zhì)溶液時(shí)，該試劑盒可用于質(zhì)譜檢測(cè)核酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述芯片上的親水性點(diǎn)樣孔數(shù)量為24,、40、70、384等孔，或根據(jù)實(shí)際臨床試驗(yàn)或科研過程中生物樣本的檢測(cè)量設(shè)置，親水性點(diǎn)樣孔可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述親水性點(diǎn)樣孔的孔徑范圍為0.5-2.8mm，所述芯片尺寸為20×30-83×125mm。在另一具體實(shí)施方案中，親水點(diǎn)樣區(qū)為圓形，直徑為0.7mm，依據(jù)圓孔直徑選擇適當(dāng)?shù)幕|(zhì)用量，如0.5μl，滴定生物標(biāo)志物樣本，結(jié)晶形態(tài)規(guī)則，晶向均一為最佳。

在其他實(shí)施方案中，所述微陣列芯片卡槽可以根據(jù)需要選擇正方形，長(zhǎng)方形等，每個(gè)卡槽范圍為20×20mm-25×60mm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，芯片適配器的卡槽為2、4、6、8、12、16或20個(gè)，或者更多。

本發(fā)明第六個(gè)目的是提供上述芯片或試劑盒在用于質(zhì)譜檢測(cè)生物分子的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物分子是核酸和/或蛋白分子。

本發(fā)明的效果包括：

1、本發(fā)明的應(yīng)用領(lǐng)域覆蓋基因組學(xué)檢測(cè)與蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定，同一張芯片既可以做基因檢測(cè)，也可以做蛋白或多肽鑒定，覆蓋兩種檢測(cè)領(lǐng)域。

2、芯片表面具有親水疏水差異設(shè)計(jì)，能夠有效富集樣本，晶向均一生長(zhǎng)，質(zhì)譜檢測(cè)的樣本峰準(zhǔn)確度高，信噪比高，基線低。

3、在芯片點(diǎn)樣區(qū)表面通過自動(dòng)點(diǎn)樣覆蓋基質(zhì)，特種的基質(zhì)配方，使基質(zhì)與樣品在芯片表面共結(jié)晶更均勻，檢測(cè)結(jié)果更佳。

4、本發(fā)明還提供了包含所述芯片的質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒，便于客戶根據(jù)需要隨時(shí)檢測(cè)核酸或蛋白樣品。

5、本發(fā)明還可根據(jù)用戶需要，提供包含表面覆蓋基質(zhì)的芯片的試劑盒，以滿足個(gè)性化需要。

6、本發(fā)明的試劑盒，芯片主體為一次性材料，使用后即可替換新的芯片與適配器進(jìn)行配合，避免現(xiàn)有的金屬靶板的清洗和樣品污染。

7、本發(fā)明的芯片適配器，不同的卡槽設(shè)計(jì)，可放置多張芯片，能實(shí)現(xiàn)核酸與蛋白不同樣品同時(shí)進(jìn)樣檢測(cè)，節(jié)省質(zhì)譜開門關(guān)門時(shí)間。

附圖說明

圖1為微陣列芯片實(shí)物圖，其中1為親水性點(diǎn)樣孔、2為疏水孔外區(qū)。

圖2a、2b為微陣列芯片適配器示意圖，其中底板為金屬板，方形凹槽為微陣列芯片卡槽，內(nèi)嵌有不同規(guī)格的微陣列芯片。

圖3為熱氧化裝置示意圖。

圖4為濃酸溶液中清洗基片示意圖。

圖5為微陣列兩用芯片與傳統(tǒng)芯片結(jié)晶對(duì)比圖。

圖6為微陣列芯片點(diǎn)樣孔進(jìn)行表面覆蓋基質(zhì)的點(diǎn)樣效果圖。

圖7為微陣列芯片質(zhì)譜檢測(cè)基因樣品的譜圖結(jié)果。

圖8為微陣列芯片質(zhì)譜檢測(cè)蛋白樣品的譜圖結(jié)果。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。

應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對(duì)于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開了該范圍的上限和下限值以及它們之間的每個(gè)中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個(gè)較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。

除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。

疏水性(hydrophobicity)：在化學(xué)學(xué)科里，疏水性指的是一個(gè)分子(疏水物)與水互相排斥的物理性質(zhì)。疏水性分子偏向于非極性，并因此較會(huì)溶解在中性和非極性溶液(如有機(jī)溶劑)。疏水性分子在水里通常會(huì)聚成一團(tuán)，而水在疏水性溶液的表面時(shí)則會(huì)形成一個(gè)很大的接觸角而成水滴狀。舉例來說，疏水性分子包含有烷烴、油、脂肪和多數(shù)含有油脂的物質(zhì)。

親水性(hydrophilicproperty)：指分子帶有極性基團(tuán)的分子，對(duì)水有大的親和能力，可以吸引水分子，或溶解于水。這類分子形成的固體材料的表面，易被水所潤(rùn)濕。具有這種特性都是物質(zhì)的親水性。

接觸角(contactangle)：是指在氣、液、固三相交點(diǎn)處所作的氣-液界面的切線穿過液體與固-液交界線之間的夾角θ，是潤(rùn)濕程度的量度。若θ<90°，則固體表面是親水性的，即液體較易潤(rùn)濕固體，其角越小，表示潤(rùn)濕性越好；若θ>90°，則固體表面是疏水性的，即液體不容易潤(rùn)濕固體，容易在表面上移動(dòng)。接觸角的測(cè)定方法很多，有角度測(cè)量法(液滴角度測(cè)量法)、長(zhǎng)度/高度測(cè)量法、力測(cè)量法等。其中液滴角度測(cè)量法是最常用的，即在平整表面滴一小液滴，使用低倍顯微鏡的量角器即可測(cè)量角度大小。

基質(zhì)，指對(duì)特定波長(zhǎng)具有較強(qiáng)吸收并易于被激發(fā)，并且傳遞能量和電荷給待測(cè)分子發(fā)生氣化和離子化，從而使得所包含的待測(cè)分子一起進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)通道的特殊溶液。

好的基質(zhì)要具備下列幾種特點(diǎn)：a.基質(zhì)最重要的功能就是吸收脈沖激光的能量，既可以通過電離吸收紫外區(qū)激光的能量，也可以通過分子的化學(xué)鍵振動(dòng)吸收紅外區(qū)激光的能量，這由所采用的激光波長(zhǎng)來決定。b.基質(zhì)要能夠很好地分散樣品分子，防止其聚集，提高電離效率。c.固、液相的基質(zhì)、樣品混合物在解吸時(shí)，基質(zhì)分子不再產(chǎn)生額外的熱效應(yīng)，不會(huì)破壞待測(cè)分子。d.基質(zhì)必須能夠幫助樣品分子很好地電離。如果是液態(tài)基質(zhì)，還必須具有很好的真空穩(wěn)定性。

在蛋白質(zhì)組分析中，經(jīng)常會(huì)使用maldi-tof基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀來進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定及翻譯后的修飾。maldi的優(yōu)勢(shì)在于可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)于多種樣品進(jìn)行處理，maldi法是將樣本添加在一種被稱為基質(zhì)(matrix)的化合物上，制成混合結(jié)晶，然后再用激光照射其表面以實(shí)現(xiàn)離子化。用作基質(zhì)的化合物可以是α-氰基-4-羥基肉桂酸、3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸。根據(jù)樣本的不同，可選用不同基質(zhì)。一般來說，α-氰-4-羥基肉桂酸(chca)適用于肽類樣品，3，5-二甲氧基-4-羥基肉桂酸(sa)適用于蛋白質(zhì)樣品，而2，5-二羥基苯甲酸(dhb)則適用于肽、糖類及糖脂類樣品。

在基因組學(xué)檢測(cè)中，maldi方法適用的是3-羥基-2-吡啶甲酸基質(zhì)，配制好的基質(zhì)，由biodot自動(dòng)點(diǎn)樣，覆蓋到微陣列芯片表面的樣品孔內(nèi)，由于表面的親疏水微陣列結(jié)構(gòu)，使基質(zhì)結(jié)晶生長(zhǎng)細(xì)致，形態(tài)均勻。質(zhì)譜檢測(cè)的樣本峰準(zhǔn)確度高，信噪比高，基線低。

“表面覆蓋基質(zhì)”，指根據(jù)待檢分子的種類，預(yù)先覆蓋在點(diǎn)樣區(qū)的蛋白或核酸基質(zhì)，并干燥形成結(jié)晶。通過將芯片的表面預(yù)先覆蓋基質(zhì)，可制備成一次性或直接對(duì)樣品進(jìn)行點(diǎn)樣和檢測(cè)的產(chǎn)品或試劑盒。

實(shí)施例一、微陣列芯片表面親水處理

芯片主體特征是質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳；金剛石，單晶硅，石英晶體等；劃隔成適合芯片適配器表面單元大小的片狀結(jié)構(gòu)，芯片厚度0.5-1.8mm，為保證質(zhì)量檢測(cè)精度，芯片表面平面度小于10μm。例如，微陣列芯片基底選擇單晶硅片，在硅片片結(jié)構(gòu)表面可以燒制生長(zhǎng)二氧化硅氧化物薄膜、氧化鋅薄膜、氧化鋁薄膜，厚度150-800nm，優(yōu)選500nm，薄膜特征是具有親水性，采用熱氧化工藝。

如圖3所示，使用熱氧化裝置燒制生長(zhǎng)二氧化硅氧化物薄膜的步驟如下：

①將硅片置于用石英玻璃制成的反應(yīng)管中；

②反應(yīng)管用電阻絲加熱爐加熱一定溫度，常用的溫度為900～1200℃；

③氧氣或水汽以1厘米/秒氣流速度通過反應(yīng)管，在硅片表面發(fā)生化學(xué)反應(yīng)：

si(固態(tài))+o2(氣態(tài))→sio2(固態(tài))或si(固態(tài))+2h2o(汽態(tài))→sio2(固態(tài))+2h2(氣態(tài))生成sio2層。

硅熱氧化工藝，按所用的氧化氣氛可分為：干氧氧化、水汽氧化和濕氧氧化。干氧氧化是以干燥純凈的氧氣作為氧化氣氛，在高溫下氧直接與硅反應(yīng)生成二氧化硅。

水汽氧化是以高純水蒸汽為氧化氣氛，由硅片表面的硅原子和水分子反應(yīng)生成二氧化硅。水汽氧化的氧化速率比干氧氧化的為大。

濕氧氧化實(shí)質(zhì)上是干氧氧化和水汽氧化的混合，氧化速率介于二者之間。

用高純氫氣和氧氣在石英反應(yīng)管進(jìn)口處直接合成水蒸汽的方法進(jìn)行水汽氧化時(shí)，通過改變氫氣和氧氣的比例，可以調(diào)節(jié)水蒸汽壓，減少沾污，有助于提高熱生長(zhǎng)二氧化硅的質(zhì)量。

實(shí)施例二、微陣列芯片表面疏水處理

1、親水性點(diǎn)樣孔區(qū)的封閉處理

清洗芯片表面殘留有機(jī)物：先通過氧氣流速60～140ml/min，功率100～300w，處理時(shí)間1～10min；再用高純水對(duì)基底表面超聲清洗2～3次，每次時(shí)間為2～5min，使表面徹底清潔并羥基化。

光刻膠技術(shù)封閉點(diǎn)樣孔區(qū)：采用旋涂的方法將光刻膠旋涂于處理過的基底上，旋涂速度為1000～8000rpm，然后置于光刻掩膜板下，在390nm的紫外光下曝光20s～5min后用相應(yīng)的顯影液洗脫后，從而構(gòu)筑出有序結(jié)構(gòu)的點(diǎn)樣孔區(qū)。其中光刻膠使用耐酸性的聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)和/或聚苯乙烯。

2、微陣列芯片孔外區(qū)的表面疏水處理

以硅烷偶聯(lián)劑為主要原料對(duì)金屬或非金屬材料進(jìn)行表面處理的過程。特征是由化學(xué)表面改性的方式制作疏水區(qū)域，疏水膜層厚度范圍150nm-2μm，疏水區(qū)域表面水滴接觸角＞120°。

硅烷偶聯(lián)劑是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，含有有機(jī)官能團(tuán)，無機(jī)官能團(tuán)，同時(shí)與陰極、非極性物質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合力。硅烷偶聯(lián)劑的化學(xué)通式為y-r-six3，式中y是通過碳原子與硅相連的非水解性有機(jī)官能團(tuán)，可與粘結(jié)劑機(jī)體中的樹脂發(fā)生反應(yīng)從而提高相容性，如氨基、乙烯基、環(huán)氧基、巰基、丙烯酰氧丙基等；r為具有飽和和不飽和鍵的碳鏈，將y和si原子連接起來；x為水解性基團(tuán)，如鹵族、烷氧基、異丙烯氧基等。這些基團(tuán)水解形成的硅醇能與金屬表面的氧化物或烴基反應(yīng)，從而在金屬表面形成si-o-si三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的硅烷膜，防止金屬的腐蝕，表面呈現(xiàn)疏水性。

具體步驟如下：

(1)用濃酸溶液清洗芯片:

①將芯片放置在干凈的燒杯中，燒杯固定在支架上。

②準(zhǔn)備水槽，裝滿水，放置在燒杯下方，加熱；(見圖4)

③將濃酸與雙氧水按照一定比例(1:5～1:20)緩緩加入裝有芯片的燒杯中，待不斷出現(xiàn)小氣泡，氧化反應(yīng)開始，反應(yīng)時(shí)間40min。

注意：濃酸很危險(xiǎn)，需要在通風(fēng)櫥通風(fēng)的條件下小心處理。注意個(gè)人防護(hù)。

④將芯片取出，放在盛有氯仿的燒杯中，超聲2min；

⑤將芯片取出，放在盛有超純水的燒杯中，超聲2min。

⑥重復(fù)步驟④⑤；

⑦廢液處理：濃酸溶液中加入大量水，緩慢稀釋，并用naoh中和。

(2)硅烷化處理

將芯片放置在潔凈的燒杯中。

將硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行水解，按照配比硅烷偶聯(lián)劑：水：乙醇＝1:1:8混合，其中硅烷偶聯(lián)劑為濃度5％～10％的二甲基二氯硅烷溶液，水采用去離子水，乙醇濃度為99％。

將水解后的硅烷化溶液取適量加入含有芯片的燒杯中；

加入一定量的氨水(13％～30％)催化，配比氨水:硅烷化＝1:5，加速反應(yīng)進(jìn)行；

放置，溶液表面產(chǎn)生白煙，反應(yīng)正在進(jìn)行，時(shí)間30分鐘(在通風(fēng)廚中進(jìn)行)。

(3)硅烷化后清洗

取出芯片，放置到盛有乙醇的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

取出芯片，放置在成盛有超純水水的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

取出芯片，放置在成盛有氯仿的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

干燥芯片后，在芯片表面滴1μl水滴，使用低倍顯微鏡的量角器測(cè)量水滴接觸角大小，分別得到接觸角約135°、155°的兩種芯片初品。

(4)對(duì)封閉的點(diǎn)樣孔去膠處理

將硅烷化處理后的芯片，放入去膠液中浸泡3小時(shí)，之后取出放入丙酮溶液中超聲2分鐘，即可去掉光刻膠，恢復(fù)點(diǎn)樣區(qū)親水表面。形成有親疏水差異的微陣列芯片表面。去膠液主要成分是聚乙二醇單丁醚或聚二甲基硅氧烷等。

實(shí)施例三、微陣列兩用芯片與傳統(tǒng)芯片結(jié)晶對(duì)比

選擇相同的蛋白或核酸樣品，與取適量相應(yīng)基質(zhì)溶液分別滴在兩用芯片以及傳統(tǒng)芯片上，待基質(zhì)自然晾干后，顯微鏡下觀察結(jié)晶形態(tài)。

如圖5所示，傳統(tǒng)生物檢測(cè)芯片結(jié)晶形態(tài)(左圖)不規(guī)則，厚度不均勻，呈咖啡環(huán)狀態(tài)，中間空，周圍厚。而本發(fā)明提供的微陣列芯片結(jié)晶形態(tài)(右圖)規(guī)則，厚度均勻，晶向生長(zhǎng)細(xì)致。

實(shí)施例四、對(duì)微陣列芯片點(diǎn)樣孔的表面進(jìn)行覆蓋基質(zhì)預(yù)處理

選用3-羥基-2-吡啶甲酸基質(zhì)溶液，通過biodot儀，對(duì)親水性點(diǎn)樣孔進(jìn)行自動(dòng)點(diǎn)樣，以進(jìn)行表面覆蓋基質(zhì)預(yù)處理，待基質(zhì)自然晾干后，進(jìn)行觀察。

如圖6所示，親水孔覆蓋基質(zhì)后，該靶點(diǎn)結(jié)晶均勻，輪廓均勻圓滑，無溶液溢出，具有良好一致性。

實(shí)施例五、制備微陣列芯片的兩用質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒

如圖2所示，在無菌環(huán)境下，將制備的不同數(shù)量或規(guī)格的微陣列兩用芯片，根據(jù)需要，對(duì)芯片進(jìn)行真空密封包裝。

同時(shí)，在試劑盒中分別附有基質(zhì)溶液，以及使用說明書。

另外，可根據(jù)實(shí)施例四，將芯片表面用自動(dòng)點(diǎn)樣方法進(jìn)行表面覆蓋基質(zhì)預(yù)處理，再抽真空密封包裝，并標(biāo)注待檢樣品的分子類型。

試劑盒包裝后，于室溫避光下保藏。

用戶購(gòu)買時(shí)，可以根據(jù)需要選擇表面覆蓋基質(zhì)預(yù)處理的試劑盒或普通試劑盒。

實(shí)施例六、微陣列兩用芯片試劑盒用于基因檢測(cè)

使用微量移液器，吸取1ul純化的耳聾基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品，直接點(diǎn)樣到表面覆蓋基質(zhì)預(yù)處理的芯片上，并使用北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司生產(chǎn)的clin-tof型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)點(diǎn)樣后的芯片進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判斷。

該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒共20個(gè)質(zhì)譜峰，質(zhì)量范圍3000-9000da，同一質(zhì)粒樣本做5個(gè)重復(fù)，分析檢測(cè)結(jié)果分型正確率。

參數(shù)設(shè)置：

turingmode:linear

massrange:3000-9000

maxlaserreprate:10.0

power:105

profiles:40

shots:10

分型結(jié)果：

結(jié)果如圖7所示，檢測(cè)出核酸樣本具有20重質(zhì)譜峰，基線低，信噪比高，檢測(cè)范圍3000-9000da,5次重復(fù)的質(zhì)譜曲線峰位置與峰強(qiáng)度一致性好，重復(fù)性佳，經(jīng)北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司be-snp軟件分析，鑒定結(jié)果正確率100％。說明該試劑盒對(duì)于核酸樣品的質(zhì)譜檢測(cè)具有優(yōu)異的分辨率。

實(shí)施例七、微陣列兩用芯片試劑盒用于蛋白檢測(cè)

使用微量移液器將基質(zhì)chca加入芯片的點(diǎn)樣孔，然后點(diǎn)樣加入1ul純化的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品bpb(分子量3000-40000da)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品，并使用毅新興業(yè)(北京)科技有限公司生產(chǎn)的clin-tof型飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)點(diǎn)樣后的芯片進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果判斷。

該標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品共6個(gè)質(zhì)譜峰，共做20個(gè)重復(fù)，分析檢測(cè)結(jié)果譜圖cv值。

參數(shù)設(shè)置：

turingmode:linear

massrange:3000-40000

maxlaserreprate:30.0

power:65

profiles:100

shots:5

結(jié)果如圖8所示，20個(gè)重復(fù)均只出現(xiàn)20個(gè)質(zhì)譜峰，峰線區(qū)分度好，無明顯干擾，分布范圍3014-38384,所有重復(fù)試驗(yàn)的峰線均具有一致對(duì)應(yīng)性，譜圖重復(fù)性cv＜2.6％，與預(yù)設(shè)的檢測(cè)結(jié)果分型正確率完全一致，說明該試劑盒對(duì)于蛋白樣品的質(zhì)譜檢測(cè)具有優(yōu)異的分辨率。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。