本發(fā)明涉及環(huán)境自由基過(guò)氧化能力評(píng)價(jià)的電化學(xué)傳感器陣列制作方法。

背景技術(shù)：

環(huán)境持久性自由基是一類(lèi)新型的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)，并具有較高的反應(yīng)活性。生物機(jī)體危害性強(qiáng)。epfrs是相對(duì)傳統(tǒng)關(guān)注的短壽命自由基而提出的，指在環(huán)境中存在數(shù)十分鐘到幾個(gè)小時(shí)，具有順磁穩(wěn)定性，可以誘發(fā)生物系統(tǒng)更多的氧化應(yīng)激的有機(jī)物。在熱帶亞熱帶土壤中過(guò)渡金屬元素鐵含量豐富，而且該區(qū)域日照時(shí)間長(zhǎng)，紫外線(xiàn)強(qiáng)烈，易激發(fā)產(chǎn)生epfr。有學(xué)者觀(guān)察到在紅壤中吸附的苯酚類(lèi)物質(zhì)在日光照射下，可產(chǎn)生壽命長(zhǎng)達(dá)5d的epfrs，可能從固體顆粒上解離下來(lái)成為游離的自由基，通過(guò)徑流和淋溶下滲等污染地表水和地下水等。生物細(xì)胞的各種膜相結(jié)構(gòu)都含有豐富的不飽和脂肪酸，極易受自由基的攻擊，引起脂質(zhì)過(guò)氧化(lipidperoxidation，lp)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。epfrs極強(qiáng)的氧化能力可誘導(dǎo)生物體內(nèi)多種脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，例如生物膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)體生物體的損傷，甚至可能是癌癥誘因之一。

目前國(guó)內(nèi)外研究epfrs的主要方法是電子順磁性共振(epr)和低溫基質(zhì)隔離，電子順磁共振(ltmi-epr)等，epr譜可以證明自由基的存在、分子結(jié)構(gòu)等方面的信息，并通過(guò)檢測(cè)epr信號(hào)的存在時(shí)間，而得的epfrs半衰期。利用脂質(zhì)過(guò)氧化物(lpo)的光譜分析法是廣泛報(bào)道的藥物、食品自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的測(cè)定方法，但用于環(huán)境自由基過(guò)氧化的測(cè)定未見(jiàn)發(fā)現(xiàn)。電子順磁性共振具有設(shè)備昂貴、使用成本高、檢測(cè)條件苛刻等不足，難于普及，且不能對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行適時(shí)測(cè)定，更缺乏自由基過(guò)氧化能力的評(píng)價(jià)方法，制約了環(huán)境持久性自由基的研究、監(jiān)測(cè)和治理。國(guó)內(nèi)較少開(kāi)展環(huán)境持久性自由基的監(jiān)測(cè)和研究工作。因此，研究新型環(huán)境自由基的現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定方法技術(shù)、尤其是發(fā)展自由基過(guò)氧化能力的評(píng)價(jià)方法具有重要價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)境自由基過(guò)氧化能力的測(cè)定方法，針對(duì)現(xiàn)有環(huán)境自由基檢測(cè)技術(shù)方法的不足，提供一種可利用常規(guī)分析儀器和常規(guī)材料、制備簡(jiǎn)單、成本較低、易于普及、可現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的環(huán)境持久性自由基過(guò)氧化能力和持久性評(píng)價(jià)方法；也提供了提供一種用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定環(huán)境持久性自由基過(guò)氧化能力的新型仿生膜電化學(xué)絲網(wǎng)印刷電極傳感陣列的制作方法。

針對(duì)上述目的，本發(fā)明提供一種環(huán)境自由基過(guò)氧化能力評(píng)價(jià)的電化學(xué)傳感器陣列制作方法，所述測(cè)定方法包括：

(1)取市售包含有直徑3mm碳基工作電極、碳基對(duì)電極和氯化銀參比電極的絲網(wǎng)印刷電極，將一定量的碳納米材料超聲分散液滴涂于絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，烘干，制得碳納米基電極；

(2)在上述碳納米基電極表面滴涂4.5-5.5μl濃度為10mg/ml卵磷脂和4.5-5.5μl濃度為5mg/ml膽固醇環(huán)己烷，避光真空干器1-1.5h，干燥后置于0.1mol/lkcl溶液中，-0.2-1.0v電位范圍以循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定，自然干燥，制得仿生膜電極單元，置于真空袋中，抽真空，4℃保存；

(3)在供試污染土壤中加入淋洗液，并置于陽(yáng)光下照射反應(yīng)，停止光照，取上清液置比色管中，其中，收集當(dāng)?shù)亟邓疄榱芟匆海?00.0g供試污染土壤中加入200.0ml淋洗液，使用翻轉(zhuǎn)振蕩器振蕩4h，取出轉(zhuǎn)移到1000ml燒杯，置于正午陽(yáng)光下照射反應(yīng)6h誘導(dǎo)自由基發(fā)生，停止光照，分取10ml上清液于8只25ml比色管中，所述比色管中供試液于具塞、分別放置一定時(shí)間，并設(shè)置1只未浸取土壤的淋洗液空白管，加入2mlph＝7.4的0.75mol/l的0.75mol/lnah2po4和0.75mol/lna2hpo4pbs緩沖液，所述雙層磷脂膜絲網(wǎng)印刷電極單元，并加入2-3ml濃度為0.75mol/l的nah2po4和2-3ml濃度為0.75mol/l的na2hpo4緩沖液；放入步驟(1)所述碳納米基電極，具塞于37.5℃恒溫孵育使電極單元雙層磷脂膜脂質(zhì)過(guò)氧化20-30min，將電極單元取出少量離子交換水沖洗，待測(cè)定；

(4)將碳納米基電極接通電化學(xué)工作站，置于電解杯中加入1-2ml電化學(xué)探針溶液和9-10ml濃度為0.1mol/l的kcl溶液，以電化學(xué)方法測(cè)定電化學(xué)探針在自由基暴露電極單元的電化學(xué)響應(yīng)；

(5)環(huán)境自由基持久性評(píng)價(jià)，計(jì)算不同放置時(shí)間的脂質(zhì)過(guò)氧化殘留率，脂質(zhì)過(guò)氧化殘留率:，式中，p為脂質(zhì)過(guò)氧化殘留率(％)，i0、it和ib分別為放置時(shí)間為0、放置t時(shí)刻和空白樣中電化學(xué)探針的電流值，以p隨時(shí)間的變化評(píng)價(jià)環(huán)境自由基持久性。

優(yōu)選地，所述碳納米材料為具有羥基或羧基官能團(tuán)的單壁、多壁碳納米管、還原石墨烯、或者所述碳納米管和石墨烯的混合物。

優(yōu)選地，所述碳納米材料在使用前需進(jìn)行超聲分散，超聲時(shí)間240-300min。

優(yōu)選地，步驟(2)中循環(huán)伏安法掃描的條件為：掃描速度為50-60mv/s，采樣間隔為10-12mv。

優(yōu)選地，步驟(1)中烘干溫度為100-105℃。

優(yōu)選地，步驟(3)中陽(yáng)光下照射反應(yīng)的時(shí)間為5-7h。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中碳納米管-磷脂雙層膜平臺(tái)上磷脂雙層膜對(duì)環(huán)境自由基響應(yīng)過(guò)程；

圖2為本發(fā)明中環(huán)境自由基傳感陣列原理圖。

具體施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍

請(qǐng)參閱圖1-2，本實(shí)用新型提供一種技術(shù)方案：包括環(huán)境自由基脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定的電極單元及電化學(xué)體系、用于評(píng)價(jià)環(huán)境自由基持久性系的傳感器陣列。本發(fā)明環(huán)境自由基脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定的絲網(wǎng)印刷電極單元及電化學(xué)體系構(gòu)成和工作原理參見(jiàn)發(fā)明原理圖1。所述環(huán)境自由基脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定的電極單元及電化學(xué)體系包括環(huán)境自由基發(fā)生體系、在碳納米材料上構(gòu)建的自組裝仿生雙層磷脂膜電極單元及電化學(xué)測(cè)定體系。環(huán)境自由基通常是環(huán)境溶液中的金屬離子與某些有機(jī)污染物在陽(yáng)光激發(fā)下產(chǎn)生的結(jié)果，因此，環(huán)境自由基發(fā)生體系包括污染環(huán)境溶液體系及光照條件。電化學(xué)測(cè)定體系包括親水的電化學(xué)探針及多種電化學(xué)分析方法。本發(fā)明電極單元的工作原理是完好的仿生雙層磷脂膜阻礙了親水的電化學(xué)探針到達(dá)電極單元表面發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)，當(dāng)電極單元暴露于陽(yáng)光照射的污染溶液誘導(dǎo)環(huán)境自由基反應(yīng)，產(chǎn)生的自由基可對(duì)電極單元的仿生膜造成過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，導(dǎo)致膜破損產(chǎn)生空隙，為電化學(xué)親水性探針提供了到達(dá)電極表面產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)的通道，由此產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，可據(jù)電化學(xué)響應(yīng)強(qiáng)弱評(píng)價(jià)土壤自由基脂質(zhì)過(guò)氧化能力。所述環(huán)境自由基持久性評(píng)價(jià)傳感器陣列構(gòu)成和工作原理參見(jiàn)發(fā)明原理圖2，包括由若干前述測(cè)定自由基脂質(zhì)過(guò)氧化的電極單元組成。污染溶液體系在光照條件下產(chǎn)生自由基，停止光照并分離以中止自由基發(fā)生反應(yīng)，環(huán)境自由基隨著放置時(shí)間衰減，以傳感器陣列中的各電極單元分別測(cè)定上清液的脂質(zhì)過(guò)氧化隨時(shí)間的殘留水平，以此評(píng)價(jià)環(huán)境自由基持久性。

本發(fā)明提供了一種環(huán)境自由基過(guò)氧化能力的測(cè)定方法，本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種環(huán)境自由基脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定的電化學(xué)傳感器陣列，以及快速簡(jiǎn)單、成本較低、易于普及、可現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的環(huán)境持久性自由基過(guò)氧化能力和持久性評(píng)價(jià)方法。本發(fā)明的新穎性在于，盡管雙層磷脂膜仿生膜傳感器一直是當(dāng)前在醫(yī)學(xué)生物最活躍的前沿領(lǐng)域，但本發(fā)明所述用于現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境自由基過(guò)氧化能力的測(cè)定的仿生膜電化學(xué)傳感陣列和電化學(xué)方法卻沒(méi)有什么發(fā)現(xiàn)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)所述傳感器陣列使用常規(guī)的方法和材料制備，使用低成本小型電化學(xué)分析儀器，普通實(shí)驗(yàn)室均可應(yīng)用本發(fā)明開(kāi)展環(huán)境持久自由基的研究工作。(2)所述傳感器陣列基于環(huán)境自由基發(fā)生體系設(shè)計(jì)，仿生雙層磷脂膜界面反應(yīng)更接近真實(shí)生物膜的自由基脂質(zhì)過(guò)氧化，碳納米材料基體對(duì)測(cè)定具有明顯催化增敏效應(yīng)。(3)采用傳感器陣列設(shè)計(jì)可測(cè)定環(huán)境自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化隨時(shí)間的殘留水平，實(shí)現(xiàn)環(huán)境自由基持久性評(píng)價(jià)。(4)所述傳感器陣列使用市售絲網(wǎng)印刷電極的簡(jiǎn)單加工，可批量生產(chǎn)，可實(shí)現(xiàn)環(huán)境自由基的高通量高篩選。

圖1中：a1～a3是非環(huán)境自由基暴露電極示意、電極表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡(sem)及循環(huán)伏安圖，b1～b3是環(huán)境自由暴露電極示意、電極表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡(sem)及循環(huán)伏安圖；從圖可以看出，非環(huán)境自由基暴露電極電極表面結(jié)構(gòu)完整(a2)，阻礙探針試劑接觸電極納米層(a1)，幾乎不產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)(a3)，環(huán)境自由基暴露后電極表面出現(xiàn)過(guò)氧化損傷(b2)，為探針試劑抵觸電極納米層提供通道(b1)，從而產(chǎn)生靈敏的電化學(xué)響應(yīng)(b3)。

圖2中：境自由基持久性評(píng)價(jià)傳感器陣列包括由若干前述測(cè)定環(huán)境自由基的電極單元組成。污染溶液體系在光照條件下產(chǎn)生自由基，停止光照并分離以中止自由基發(fā)生反應(yīng)，環(huán)境自由基隨著放置時(shí)間衰減，以傳感器陣列中的各電極單元分別測(cè)定上清液的過(guò)氧化能力隨時(shí)間的殘留水平，以此評(píng)價(jià)環(huán)持久性境自由基。

下面結(jié)合附圖詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

實(shí)施例1

將碳納米材料涂覆于絲網(wǎng)印刷電極，烘干制得碳納米基電極；在上述碳納米基電極表面滴涂4.5μl濃度為10mg/ml卵磷脂和4.5μl濃度為5mg/ml膽固醇環(huán)己烷，避光真空干器1h，干燥后置于0.1mol/lkcl溶液中，-0.2v電位范圍以循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供試污染土壤中加入淋洗液，并置于陽(yáng)光下照射反應(yīng)，停止光照，取上清液置比色管中，并加入2ml濃度為0.75mol/l的nah2po4和2ml濃度為0.75mol/l的na2hpo4緩沖液；放入所述碳納米基電極，具塞于37.5℃恒溫孵育使電極單元雙層磷脂膜脂質(zhì)過(guò)氧化20min，將電極單元取出少量離子交換水沖洗，待測(cè)定；將碳納米基電極接通電化學(xué)工作站，置于電解杯中加入1ml電化學(xué)探針溶液和9ml濃度為0.1mol/l的kcl溶液，以電化學(xué)方法測(cè)定電化學(xué)探針在自由基暴露電極單元的電化學(xué)響應(yīng)。

實(shí)施例2

將碳納米材料涂覆于絲網(wǎng)印刷電極，烘干制得碳納米基電極；在上述碳納米基電極表面滴涂5.5μl濃度為10mg/ml卵磷脂和5.5μl濃度為5mg/ml膽固醇環(huán)己烷，避光真空干器1.5h，干燥后置于0.1mol/lkcl溶液中，1.0v電位范圍以循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供試污染土壤中加入淋洗液，并置于陽(yáng)光下照射反應(yīng)，停止光照，取上清液置比色管中，并加入3ml濃度為0.75mol/l的nah2po4和3ml濃度為0.75mol/l的na2hpo4緩沖液；放入所述碳納米基電極，具塞于37.5℃恒溫孵育使電極單元雙層磷脂膜脂質(zhì)過(guò)氧化30min，將電極單元取出少量離子交換水沖洗，待測(cè)定；將碳納米基電極接通電化學(xué)工作站，置于電解杯中加入2ml電化學(xué)探針溶液和10ml濃度為0.1mol/l的kcl溶液，以電化學(xué)方法測(cè)定電化學(xué)探針在自由基暴露電極單元的電化學(xué)響應(yīng)。

實(shí)施例3

將碳納米材料涂覆于絲網(wǎng)印刷電極，烘干制得碳納米基電極；在上述碳納米基電極表面滴涂5μl濃度為10mg/ml卵磷脂和5μl濃度為5mg/ml膽固醇環(huán)己烷，避光真空干器1.2h，干燥后置于0.1mol/lkcl溶液中，0.5v電位范圍以循環(huán)伏安法掃描至穩(wěn)定，待干燥后置于真空袋中，抽真空，4℃保存；在供試污染土壤中加入淋洗液，并置于陽(yáng)光下照射反應(yīng)，停止光照，取上清液置比色管中，并加入2.5ml濃度為0.75mol/l的nah2po4和2.5ml濃度為0.75mol/l的na2hpo4緩沖液；放入所述碳納米基電極，具塞于37.5℃恒溫孵育使電極單元雙層磷脂膜脂質(zhì)過(guò)氧化25min，將電極單元取出少量離子交換水沖洗，待測(cè)定；將碳納米基電極接通電化學(xué)工作站，置于電解杯中加入1.5ml電化學(xué)探針溶液和9.5ml濃度為0.1mol/l的kcl溶液，以電化學(xué)方法測(cè)定電化學(xué)探針在自由基暴露電極單元的電化學(xué)響應(yīng)。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。