本發(fā)明涉及染色液，特別是涉及檸檬酸鉛染色液及其配制方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對(duì)于生物樣品的超薄切片來(lái)說(shuō)，圖像反差來(lái)源樣品對(duì)于電子束的散射能力，而其散射能力取決于原子組成：原子序數(shù)越高，電子密度越高，散射電子能力越強(qiáng)，電鏡下顯黑色；原子序數(shù)越低，電子密度越低，散射電子能力越弱，電鏡下顯示白色。而生物樣品主要由c、h、o、n、p、s等低原子序數(shù)的元素組成，未經(jīng)染色的超薄切片，反差很弱，特別是用于醫(yī)學(xué)診斷的切片，反差效果差會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不清晰，嚴(yán)重影響病理醫(yī)生的診斷結(jié)果。

目前常用的超薄切片染色液包括醋酸雙氧鈾染色液和檸檬酸鉛染色液。其中，醋酸雙氧鈾：也稱醋酸雙氧鈾，它以提高核酸、蛋白質(zhì)和結(jié)締組織纖維的反差為主，對(duì)膜染色效果較差。檸檬酸鉛：密度大，對(duì)各種組織結(jié)構(gòu)都有廣泛的親和作用，尤以提高細(xì)胞膜系統(tǒng)及脂類物質(zhì)的反差為好，對(duì)不能被鋨酸染色的糖原更具有染色作用。由于鈾和鉛具有不同的染色特征，所以目前切片普遍都采用雙重染色。即先用醋酸雙氧鈾染色后，再用檸檬酸鉛染色，相互補(bǔ)充，從而獲得較佳的染色效果。

但是，目前的檸檬酸鉛染色液的配制比較困難，且容易在儲(chǔ)存和染色過(guò)程中與空氣中的二氧化碳結(jié)合形成碳酸鉛顆粒污染切片，從而影響電鏡觀察，而且隨著染色時(shí)間以及切片數(shù)量的增加會(huì)增加污染的可能性。實(shí)驗(yàn)室自配的檸檬酸鉛染色液步驟較復(fù)雜，且在配制過(guò)程中難以使溶液透明，而且染色液不穩(wěn)定，配制后儲(chǔ)存一段時(shí)間(如兩周后)，容易出現(xiàn)沉淀而導(dǎo)致染色液不能使用。而商品化的檸檬酸鉛染色液雖然保存周期長(zhǎng)，但配制方法非常復(fù)雜，如需要進(jìn)行避光、密閉攪拌，濾球過(guò)濾，充氮，溶封等操作，一般實(shí)驗(yàn)室難以進(jìn)行配制。此外，實(shí)驗(yàn)室自配和商品化的檸檬酸鉛染色液均存在染色效果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)沉淀，染色效果不理想等問(wèn)題。

另外，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的通識(shí)中，水是被公認(rèn)為是配制染色液的優(yōu)先選擇溶劑，因?yàn)樗梢院芎玫娜芙馊苜|(zhì)(檸檬酸鉛)，也不會(huì)與檸檬酸鉛發(fā)生異常反應(yīng)，用水作為溶劑的溶液，一般情況下認(rèn)為具有較有機(jī)溶劑更好的穩(wěn)定性，同時(shí)由于檸檬酸鉛染液對(duì)ph值是有要求的，用水作為溶劑還易于調(diào)整ph值。因此目前不論實(shí)驗(yàn)室自配還是商品化的檸檬酸鉛染色液，均是采用水溶液作為溶劑。而由此制成的染色液表面張力大，容易與切片形成小氣泡而導(dǎo)致彌漫性的污染，且在染色時(shí)容易在超薄切片表面形成小氣泡，不容易與超薄切片進(jìn)行很好的結(jié)合，影響超薄切片的清晰度。而且染色液滲透性較弱，染色完成后，超薄切片不容易沖洗干凈，會(huì)或多或少殘留檸檬酸鉛染色液而造成污染導(dǎo)致超薄切片染色質(zhì)量差，同時(shí)沖洗需要用到的超純水多。上述檸檬酸鉛染色液的污染和成本問(wèn)題，以及對(duì)超薄切片質(zhì)量的影響問(wèn)題一直被本領(lǐng)域技術(shù)人員所忽視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種配制方法簡(jiǎn)單，染色效果好，有利于超微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)，儲(chǔ)存穩(wěn)定，保存周期長(zhǎng)，且污染小、成本低的檸檬酸鉛染色液。

一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑，以及在所述溶劑中的濃度為30～40g/l的檸檬酸鉛和濃度為0.5～0.8g/l的氫氧化鈉；

所述溶劑為醇和水的混合液，其中，所述醇的體積濃度為25～33％。

在現(xiàn)有技術(shù)中，不論實(shí)驗(yàn)室自配還是商品化的檸檬酸鉛染色液，均是采用水溶液作為溶劑。本發(fā)明的檸檬酸鉛染色液，突破性的嘗試在檸檬酸鉛染色液中添加醇作為溶劑以降低染色液的表面張力。同時(shí)通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：如醇的濃度過(guò)大，難以制成澄清的溶液，且會(huì)影響檸檬酸鉛染色液的穩(wěn)定性；如醇的濃度過(guò)小，又難以達(dá)到降低染色液表面張力的作用。

最終，本發(fā)明以特定體積濃度的含醇溶劑與檸檬酸鉛和氫氧化鈉相配合，不僅提高了檸檬酸鉛染色液中有效成份檸檬酸鉛的濃度，增強(qiáng)染色液的染色效果，縮短染色時(shí)間，而且在該情況下還能夠保證制得的檸檬酸鉛染色液的穩(wěn)定性，保存周期長(zhǎng)。同時(shí)降低染色液的表面張力，使制得的超薄切片貼合緊密，提高染色液的滲透性，染色效果好，且易于沖洗，節(jié)約沖洗超純水的用量，避免染色液殘留造成鉛污染。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述溶劑中，所述醇的體積濃度為28～32％。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述醇為甲醇和/或乙醇。在本發(fā)明的檸檬酸鉛染色液中，以甲醇和/或乙醇作為所述醇，能夠獲得更佳的穩(wěn)定性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述醇為乙醇。優(yōu)選采用乙醇，能夠在保證穩(wěn)定性的同時(shí)，降低檸檬酸鉛染色液的毒性。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，在所述溶劑中，所述檸檬酸鉛的濃度為34～36g/l，所述氫氧化鈉的濃度為0.6～0.7g/l。

本發(fā)明還提供所述的檸檬酸鉛染色液的配制方法，包括如下步驟：

(1)將所述檸檬酸鉛、醇，以及與所述醇等體積的水混合，采用超聲波震蕩，得預(yù)混物；

(2)于所述預(yù)混物中加入所述氫氧化鈉以及剩余的水，再進(jìn)行超聲波震蕩，即得所述檸檬酸鉛染色液。

本發(fā)明所述的檸檬酸鉛染色液的配制方法，操作簡(jiǎn)單，易于控制，在短時(shí)間內(nèi)即可快速配制完成。其中，在步驟(1)中先采用與醇等體積的水，可以適當(dāng)稀釋醇的濃度，使檸檬酸鉛可以較好的溶解。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述超聲波震蕩頻率為35～45khz。利用特定頻率的超聲波震蕩，能夠縮短染色液的配制時(shí)間，減少co2對(duì)染色液造成的不良的影響。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(1)中，所述超聲波震蕩的時(shí)間為2～8min。

在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟(2)中，所述超聲波震蕩的時(shí)間為5～10min。

本發(fā)明還提供所述的檸檬酸鉛染色液在超薄切片中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所述的檸檬酸鉛染色液，打破了目前的檸檬酸鉛染色液配方都為水溶液的傳統(tǒng)限制，研發(fā)出可使用醇作為溶劑也能穩(wěn)定、且染色效果更佳的檸檬酸鉛染色液。其具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、染色效果好：在染色液中加入醇作為溶劑，且提高了染色液中有效成分檸檬酸鉛的含量，由此能更好的滲透進(jìn)切片，更有利于與組織結(jié)構(gòu)結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生明顯反差，使切片在電鏡下能呈現(xiàn)更清晰的超微結(jié)構(gòu)；

2、儲(chǔ)存穩(wěn)定，保存周期長(zhǎng)；

3、表面張力小，不會(huì)與切片形成小氣泡，污染少；

4、染色完成后，切片容易沖洗干凈，用此染色液一次染100張切片，也只需300ml超純水、沖洗時(shí)間約1分鐘即可沖洗干凈，不會(huì)因?yàn)闆_洗不干凈，染色液殘留而導(dǎo)致切片出現(xiàn)鉛污染，且還可以降低切片的制作成本；

5、染色液用量少：因染色液表面張力小，更容易在切片中擴(kuò)散均勻，在同等量的切片染色中，至少能節(jié)約30％的染色液；

6、配制方法簡(jiǎn)單，短時(shí)間內(nèi)即可配制完成；

7、可直接應(yīng)用于染色，無(wú)需離心等操作。

附圖說(shuō)明

圖1為采用實(shí)施例1配制的檸檬酸鉛染色液制成的超薄切片電鏡圖；

圖2為采用實(shí)施例2配制的檸檬酸鉛染色液制成的超薄切片電鏡圖；

圖3為采用實(shí)施例3配制的檸檬酸鉛染色液制成的超薄切片電鏡圖；

圖4為采用對(duì)比例3配制的檸檬酸鉛染色液制成的超薄切片電鏡圖；

圖5為采用對(duì)比例4配制的檸檬酸鉛染色液制成的超薄切片電鏡圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的檸檬酸鉛染色液及其配制方法和應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中，所述水為超純水，具體為將milli-qgradient純水機(jī)出的一級(jí)水經(jīng)家庭用的蒸餾水機(jī)再蒸餾一次后制得。

原、附材料及設(shè)備如表1所示：

表1

實(shí)施例1

本實(shí)施例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3.5g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為30％，即30ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法，包括如下步驟：

取3.5g檸檬酸鉛，加入30ml乙醇和30ml超純水，混合后進(jìn)行超聲波震蕩5min，頻率為40khz，得預(yù)混物；

取適量超純水溶解0.064g的氫氧化鈉制成16ml的1n氫氧化鈉溶液，并將該氫氧化鈉溶液加入至上述預(yù)混物中，再以超純水定容至100ml，然后再進(jìn)行超聲波震蕩5～10min使固體完全溶解，溶液清亮，即得所述檸檬酸鉛染色液，用5或10毫升注射器分裝，密封冷藏保存，即可。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，無(wú)任何鉛污染，超微結(jié)構(gòu)清晰，反差好(圖1)。清洗時(shí)，100張切片采用300ml超純水沖洗1min即可。

實(shí)施例2

本實(shí)施例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為30％，即30ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，超微結(jié)構(gòu)清晰，反差也好(圖2)，想要得到實(shí)施例1的染色效果，需要適當(dāng)延長(zhǎng)染色的時(shí)間，但由此會(huì)增多污染的機(jī)率。清洗時(shí)，100張切片采用300ml超純水沖洗1min即可。

實(shí)施例3

本實(shí)施例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的4g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為30％，即30ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，超微結(jié)構(gòu)清晰，反差好(圖3)。但由于檸檬酸鉛濃度升高，增多了co2與其結(jié)合產(chǎn)生沉淀的機(jī)率。清洗時(shí)，100張切片采用400ml超純水沖洗1min30s即可。

實(shí)施例4

本實(shí)施例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3.5g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為25％，即25ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，超微結(jié)構(gòu)清晰度可接受。清洗時(shí)，100張切片采用400ml超純水沖洗1min30s即可。

對(duì)比例1

本對(duì)比例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3.5g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為35％，即35ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，有機(jī)溶劑濃度較高，不利于染液配置，容易配置失敗，表現(xiàn)為很難得到澄清、無(wú)污染的染液。

對(duì)比例2

本對(duì)比例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3.5g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為40％，即40ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，有機(jī)溶劑濃度過(guò)高，不利于染液配置，導(dǎo)致配置失敗，表現(xiàn)為無(wú)法得到澄清、無(wú)污染的染液。

對(duì)比例3

本對(duì)比例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的3.5g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為20％，即20ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，超微結(jié)構(gòu)可辨認(rèn)，但清晰度不夠(圖4)，且與現(xiàn)有以水為溶劑配制的檸檬酸鉛染色液對(duì)比，效果相關(guān)不夠明顯。清洗時(shí)，100張切片采用500ml超純水沖洗2min即可。

對(duì)比例4

本對(duì)比例一種檸檬酸鉛染色液，包括溶劑100ml，以及溶于所述溶劑的2g檸檬酸鉛和0.064g的氫氧化鈉。

所述溶劑為乙醇和超純水的混合液，其中，乙醇的體積濃度為30％，即30ml。

上述檸檬酸鉛染色液的制備方法類似實(shí)施例1。

采用該檸檬酸鉛染色液進(jìn)行染色，超微結(jié)構(gòu)可辨認(rèn)，但清晰度不夠(圖5)。由于檸檬酸鉛濃度偏低，想要得到清晰的超微結(jié)構(gòu)，必須要延長(zhǎng)染色時(shí)間和升高溫度，大大增加污染的機(jī)率。清洗時(shí)，100張切片采用300ml超純水沖洗1min即可。

實(shí)施例1-4的檸檬酸鉛染色液配制成功檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2

以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。