本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為白色念珠菌場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡樣品的快速制備方法。

背景技術(shù)：

白色念珠菌(candidaalbicans)的生物被膜也稱生物膜。在自然界中，絕大多數(shù)的細(xì)菌存在于生物被膜中。已有研究表明，部分白色念珠菌的生物被膜的存在與其致病的嚴(yán)重程度相關(guān)，因此探究白色念珠菌的生物膜結(jié)構(gòu)也逐漸成為科研工作者們所關(guān)注的一個(gè)重點(diǎn)。

掃描電鏡已成為一種研究微觀世界的有力工具，很多重大發(fā)現(xiàn)和研究成果都是通過觀察獲得的。然而，在實(shí)際進(jìn)行儀器觀察操作時(shí)，由于掃描電鏡是高精密儀器，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且影響其成像的因素較多。想要獲得高分辨率、立體感強(qiáng)、層次、細(xì)節(jié)分明，保持樣品原始形貌的高質(zhì)量掃描電鏡圖像，樣品的快速制備起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)掃描電鏡的使用和參數(shù)的設(shè)置也直接影響到圖像質(zhì)量。表面結(jié)構(gòu)由于受多種因素的影響，反差降低，此外，脫水過程、鍍膜操作等樣品處理的影響，圖像質(zhì)量下降，必須選擇合適而且快速的樣品制備方法與電鏡觀察參數(shù)才能觀察到清晰的菌體外周微細(xì)結(jié)構(gòu)。

白色念珠菌掃描電鏡樣品的傳統(tǒng)制備方法，將念珠菌菌懸液以8000rpm離心3～5min后，棄掉上清液，獲得菌體后分別進(jìn)行以下操作:①將上述獲得的白色念珠菌菌體加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱固定2h；②ph為7.2的磷酸緩沖液pbs清冼2～3次；③1％鋨酸處理1h；④ph為7.2的磷酸緩沖液pbs清冼2～3次；⑤乙醇梯度脫水，依次為30％，50％，70％，85％，95％各1次(10min/次)，100％乙醇2次(20min/次)；⑥采用乙酸異戊酯置換2次，20min/次；⑦鼓風(fēng)烘干干燥：將離心濃縮后的菌液小心滴入到小濾紙袋內(nèi)并及時(shí)封口，放入至55℃的鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥4h；⑧離子濺射噴金后，調(diào)整并設(shè)置部分參數(shù)即可進(jìn)行掃描電鏡來觀察菌體生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

采用傳統(tǒng)的制備方法對(duì)白色念珠菌進(jìn)行了掃描電鏡樣品的制備如圖1所示。

對(duì)病原微生物白色念珠菌采用傳統(tǒng)的制備方法，掃描電鏡觀察并拍照，可以清楚的看出在固定過程中，常規(guī)方法采用2.5％戊二醛固定2h，1％鋨酸固定1h由于樣品固定時(shí)間相對(duì)較短而導(dǎo)致樣品周圍存在病原微生物白色念珠菌的分泌物(如圖1)。

在清洗過程中，傳統(tǒng)的方法使用ph7.2的磷酸緩沖液pbs清洗樣品時(shí)，會(huì)留下的磷酸鹽顆粒將部分樣品覆蓋遮蔽(如圖2)。

傳統(tǒng)的干燥方法處理樣品后的圖像，其中(如圖3)是55℃烘干6h的樣品；可見，常規(guī)干燥方法使樣品出現(xiàn)微小的形變和生物膜小部分脫落。

傳統(tǒng)的方法使用不同濃度梯度乙醇脫水，而脫水的時(shí)間不同對(duì)樣品表面結(jié)構(gòu)影響較大，觀察結(jié)果顯示，樣品梯度脫水每步10min時(shí)，菌體生物膜表面龜裂、或不同程度皺縮凹陷甚至是斷裂(如圖4)，且損傷較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)傳統(tǒng)制備病原微生物白色念珠菌掃描電鏡樣品方法中存在的問題，本發(fā)明提供一種白色念珠菌場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡樣品的快速制備方法，該方法更為實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、高效。

具體的技術(shù)方案為：

將冷藏存于4℃冰箱中固體斜面上的白色念珠菌菌株挑出后，在超凈工作臺(tái)里接種于固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，劃線并培養(yǎng)于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，挑取培養(yǎng)皿上單菌落至液體普通肉湯培養(yǎng)基里于30℃的空氣浴振蕩器中以200rpm培養(yǎng)12～24h，得到白色念珠菌菌懸液；

將白色念珠菌菌懸液以8000rpm離心3～5min后，棄掉上清液，獲得白色念珠菌菌體進(jìn)行以下操作：

(1)將白色念珠菌菌體加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱單固定4h；

(2)采用無菌去離子水清冼2～3次；

(3)不同濃度梯度的叔丁醇脫水，叔丁醇質(zhì)量濃度依次為30％、50％、70％、85％、95％，各1次，5min/次，然后用100％叔丁醇脫水2次，15min/次，其中：每次脫水后均需以8000rpm、3～5min離心棄掉上清液；再轉(zhuǎn)入至下一種試劑，每次用移液槍吹打3～5次，打散菌塊；

(4)真空干燥：將離心濃縮后的菌液滴入到純叔丁醇中在4℃冰箱冷凍10min后，放入至真空干燥箱內(nèi)干燥；

(5)離子濺射噴金：待干燥后的樣品溫度升到室溫后取出倒入至培養(yǎng)皿，輕搖分散菌體；采用碳導(dǎo)電膠帶一面粘在蓋玻片上，另一面倒扣輕壓在菌體粉末上，翻正后用鑷子將菌體刮薄鋪平；離子濺射噴金后，調(diào)整并設(shè)置參數(shù)即可進(jìn)行掃描電鏡來觀察菌體生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

所述的離子濺射噴金條件：真空度10pa，電流15ma，鍍膜時(shí)間130s，鍍膜的厚度為10nm；樣品臺(tái)與金靶之間的距離5cm。

本發(fā)明提供的白色念珠菌場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡樣品的快速制備方法，減少白色念珠菌的分泌物干擾樣品的成像質(zhì)量；盡量消除磷酸鹽顆粒將部分樣品覆蓋并遮蔽的現(xiàn)象；降低樣品出現(xiàn)微小的形變和避免生物膜小部分脫落；避免菌體生物膜表面龜裂或不同程度皺縮凹陷甚至是斷裂，同時(shí)消除對(duì)菌體表面損傷。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)樣品周圍存在病原微生物白色念珠菌的分泌物照片；

圖2為現(xiàn)有技術(shù)留下的磷酸鹽顆粒將部分樣品覆蓋遮蔽照片；

圖3為現(xiàn)有技術(shù)樣品出現(xiàn)微小的形變和生物膜小部分脫落照片；

圖4為現(xiàn)有技術(shù)菌體生物膜損傷或龜裂照片；

圖5為本實(shí)施例樣品沒有發(fā)現(xiàn)病原微生物的分泌物照片；

圖6為本實(shí)施例樣品無雜質(zhì)殘留且不覆蓋照片；

圖7為本實(shí)施例樣品表面無脫落、皺縮、凹陷照片；

圖8為本實(shí)施例樣品表面無損傷或形變照片。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

1.白色念珠菌菌懸液的制備方法

將冷藏存于4℃冰箱中固體斜面上的白色念珠菌菌株挑出后，在超凈工作臺(tái)里接種于固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基上，劃線并培養(yǎng)于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，挑取培養(yǎng)皿上單菌落至液體普通肉湯培養(yǎng)基里于30℃的空氣浴振蕩器中以200rpm培養(yǎng)12～24h，得到白色念珠菌菌懸液；

再以8000rpm離心3～5min，棄掉上清液后，菌體沉淀用已滅菌的液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基稀釋至10⁵～10⁶cfu/ml作為標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌懸液，同時(shí)儲(chǔ)存于4℃的冰箱中備用。

2.白色念珠菌掃描電鏡樣品的制備方法

將白色念珠菌菌懸液以8000rpm離心3～5min后，棄掉上清液，獲得白色念珠菌菌體進(jìn)行以下操作:①將白色念珠菌菌體加入到2.5％戊二醛固定液中于4℃冰箱單固定4h；②采用無菌去離子水清冼2～3次；③不同濃度梯度的叔丁醇脫水，叔丁醇質(zhì)量濃度依次為30％、50％、70％、85％、95％，各1次，5min/次，然后用100％叔丁醇脫水2次，15min/次，其中：每次脫水后均需以8000rpm、3～5min離心棄掉上清液；再轉(zhuǎn)入至下一種試劑，每次用移液槍吹打3～5次，打散菌塊；④真空干燥：將離心濃縮后的菌液滴入到純叔丁醇中在4℃冰箱冷凍10min后，放入至真空干燥箱內(nèi)干燥；⑤離子濺射噴金：待干燥后的樣品溫度升到室溫后取出倒入至培養(yǎng)皿，輕搖分散菌體；采用碳導(dǎo)電膠帶一面粘在蓋玻片上，另一面倒扣輕壓在菌體粉末上，翻正后用鑷子將菌體刮薄鋪平；離子濺射噴金后，調(diào)整并設(shè)置參數(shù)即可進(jìn)行掃描電鏡來觀察菌體生物膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3.白色念珠菌掃描電鏡樣品的觀察

將已經(jīng)制備完好的樣品放入掃描電鏡樣品小室，待樣品小室的真空度達(dá)到要求后，選擇加速電壓；調(diào)整工作距離；根據(jù)樣品挑選合適活動(dòng)光闌孔；調(diào)整合適的放大倍數(shù)；調(diào)整焦距、圖像的亮度和對(duì)比度；拍照并保存圖片。在觀察過程中，要隨時(shí)注意調(diào)整加速電壓、物鏡活動(dòng)光闌孔、工作距離來獲得較為清晰的圖像。

4掃描電鏡參數(shù)的設(shè)置

離子濺射鍍膜的相對(duì)最佳條件:在工作電流、工作距離不變的情況下，真空度10pa，電流15ma，鍍膜時(shí)間130s，鍍膜的厚度約為10nm。樣品臺(tái)與金靶之間的距離5cm較為適宜。其中樣品在鍍膜時(shí)，如果延長(zhǎng)鍍膜時(shí)間，則表面厚度增加，可能會(huì)使菌體生物膜表面結(jié)構(gòu)會(huì)模糊，邊緣不清，從而影響分辨率。因此，確保樣品鍍膜時(shí)間合適，便可得到高質(zhì)量的圖像。

在掃描電鏡的觀察中，邊觀察圖像邊選擇和設(shè)置相對(duì)較為合適的參數(shù)。其中，加速電壓相對(duì)最佳值選擇5～15kv，菌體生物膜表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)、反差最好，圖像質(zhì)量最高。而5kv加速電壓的菌體生物膜表面結(jié)構(gòu)更多、更真實(shí)，但反差稍差。物鏡光闌50μm、工作距離11.5mm為相對(duì)最佳設(shè)置，圖像清晰，分辨率高，立體感強(qiáng)。

本方法與傳統(tǒng)方法對(duì)比優(yōu)勢(shì)將表1。該制備方法對(duì)白色念珠菌進(jìn)行了掃描電鏡樣品的制備如圖5所示：

表1：傳統(tǒng)制備方法與本實(shí)施例制備方法的比較

對(duì)病原微生物白色念珠菌采用本發(fā)明提供的的制備方法，掃描電鏡觀察并拍照，可以清楚的看出在固定過程中，保證適宜濃度的戊二醛，濃度過高會(huì)造成組織收縮，過低則不能及時(shí)的固定組織。在菌體內(nèi)，游離細(xì)胞由于易受滲透壓的影響，以選用低濃度的固定液和等滲的洗液為宜，以免造成細(xì)胞膨脹或皺縮，引起細(xì)胞變形。通常固定液濃度控制在2.5％左右為佳；而對(duì)于外表有細(xì)胞壁的微生物，如白色念珠菌，由于外層的細(xì)胞壁具有一定硬度和剛性，不易變形，能使細(xì)胞保持一定形狀和在不同滲透壓下生長(zhǎng)，在不利環(huán)境下還能防止溶胞。

即使不固定也能保持菌體形態(tài)，因而在本發(fā)明提供的制備方法中采用戊二醛單固定4h的樣品不但沒有發(fā)現(xiàn)病原微生物的分泌物而且簡(jiǎn)化了常規(guī)雙固定的步驟，如圖5。然而，常規(guī)生物固定是采用戊二醛和鋨酸雙固定處理，但此方法操作復(fù)雜，且鋨酸價(jià)格昂貴又具有一定的毒性。通過對(duì)比只用戊二醛單固定，不用鋨酸作后固定，可省去用戊二醛和鋨酸起反應(yīng)的多次緩沖液清洗的步驟。另外，可明顯的縮短樣品制備的時(shí)間；不但大大地提高了樣品的制備效率，還降低了制樣成本。因此本發(fā)明提供的的制備方法采用戊二醛單固定也可保持細(xì)菌較完好的外觀形態(tài)。

在干燥過程中伴隨著復(fù)雜的物理及化學(xué)變化，該過程有可能刺激并誘使細(xì)菌分泌內(nèi)部物質(zhì)到外周，導(dǎo)致圖像背景不潔凈。想要得到較為清晰顯露樣品被觀察的部位，清洗是必要的。本發(fā)明提供的方法中使用無菌去離子水清洗樣品時(shí)，干燥后無雜質(zhì)殘留且不覆蓋樣品，如圖6。由于戊二醛在水溶液中多為環(huán)狀水合物，如果清洗不凈在干燥后會(huì)形成形狀不規(guī)則的晶體；此外pbs緩沖液通常由nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4加水配成，干燥后也會(huì)留下細(xì)微的顆粒覆蓋在樣品表面遮蔽樣品。這就凸顯出在樣本制備過程中，清洗步驟非常重要。清洗效果與時(shí)間、次數(shù)有關(guān)。清洗時(shí)間過長(zhǎng)，次數(shù)過多，樣品表面易受損傷、并造成樣品脫落。

此外，絕大多數(shù)的微生物具有細(xì)胞壁，這也許是用去離子水漂洗對(duì)樣品形貌觀察影響不大的原因所在?？梢赃_(dá)到圖像清晰、真實(shí)、無雜質(zhì)的效果。因此，樣品在固定后，要用無殘留的無菌去離子清洗，該清洗方式既經(jīng)濟(jì)又方便；此外清洗樣品還可減少對(duì)電鏡內(nèi)腔的污染，延緩燈絲熔斷。

在掃描電鏡樣品的制備中，用乙醇脫水是由于乙醇不僅是低表面張力的有機(jī)溶劑，利用樣品內(nèi)外水和乙醇的濃度差形成的滲透壓差將樣品中的游離水置換出來，乙醇則滲到樣品內(nèi)；而且乙醇極性小，易從樣品中揮發(fā)而使樣品脫水。但若急劇脫水會(huì)引起收縮。因此采用從低濃度到高濃度的乙醇梯度脫水方法去除水分，以達(dá)到儀器觀察樣品的要求，如圖7。脫水過程中脫水時(shí)間的掌握非常重要，脫水時(shí)間過長(zhǎng)，使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)丟失，引起菌體細(xì)胞體積變化，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)的失真。樣品有可能在干燥前就產(chǎn)生較大的收縮變形，對(duì)保存樣品的結(jié)構(gòu)不利；脫水時(shí)間過短，則容易造成脫水不充分，圖像不清晰。樣品的收縮率與脫水時(shí)間有很大關(guān)系，脫水時(shí)間越長(zhǎng)，收縮越大，反之則越小。對(duì)于病原微生物樣脫水時(shí)間一般為5min左右。

此外，乙醇作為脫水劑在樣品在干燥時(shí)可減小表面張力，最大限度地減少樣品表面的損傷。通過比較不難發(fā)現(xiàn)，用叔丁醇代替乙醇作為脫水劑，能減少組織收縮，并使脫水更加徹底，如圖8。因而在本發(fā)明提供的制備樣品的方法中采用不同濃度梯度的叔丁醇脫水。選取叔丁醇為脫水劑可省去乙酸異戊酯的置換步驟，因?yàn)橹脫Q的主要目的是采用乙酸異戊酯滲入樣品替換乙醇，從而達(dá)到徹底脫水的目的。

烘箱干燥法利用高溫加快水分蒸發(fā)而使樣品脫水。因?yàn)樗哂休^大的內(nèi)聚力和電極性，可與樣品中的極性成分瞬間結(jié)合，但在揮發(fā)干燥時(shí)會(huì)牽動(dòng)樣品組分而造成樣品變形或微小斷裂。而采用真空干燥法時(shí)需嚴(yán)格控制其溫度、壓力及時(shí)間。由于當(dāng)從高壓轉(zhuǎn)為大氣壓時(shí)，樣品有可能因減壓而發(fā)生膨脹。叔丁醇是非極性分子，很容易揮發(fā)，樣品變形小。使用的叔丁醇為無色油性液體，凝固點(diǎn)為23.5℃，它在室溫下即可凝固，當(dāng)溫度降至到熔點(diǎn)以下時(shí)凝固，抽真空時(shí)可不斷排出從樣品內(nèi)揮發(fā)到周邊空氣中的叔丁醇分子，樣品中的叔丁醇可最大限度揮發(fā)完全。因此在低真空環(huán)境下樣品可經(jīng)介質(zhì)的升華而達(dá)到干燥的目的，避免因氣液界面的存在造成對(duì)細(xì)的損傷，能使細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存在活體狀態(tài)。同時(shí)簡(jiǎn)化了組織脫水置換的繁瑣過程，叔丁醇脫水干燥過程只需55min左右，也無需特殊儀器設(shè)備的要求真空干燥對(duì)樣品脫水充分，且破壞和變形小。

微生物樣品不導(dǎo)電是因?yàn)槠浔砻骐娮瓒己芨?大于10歐姆)，含水份較多。當(dāng)入射電子束照射到非導(dǎo)電樣品上時(shí)，樣品內(nèi)部部分殘存的電子不能像導(dǎo)電樣品那樣通過樣品本身導(dǎo)向大地，而是在電子束照射點(diǎn)附近產(chǎn)生電荷堆積，過多的電荷積累會(huì)導(dǎo)致圖像異常明亮，嚴(yán)重時(shí)在照射點(diǎn)附近形成的負(fù)電場(chǎng)，即在樣品表面形成負(fù)電荷區(qū)產(chǎn)生充放電現(xiàn)象，影響電子束的正常掃描從而引起圖像畸變，嚴(yán)重影響二次電子圖像質(zhì)量。而通過對(duì)樣品噴涂金屬薄膜，可避免放電，并增加二次電子產(chǎn)率，獲得良好圖像。離子濺射鍍膜時(shí)，樣品室對(duì)真空和電流有一定要求。真空度應(yīng)達(dá)到10.0pa，電流不大于15.0ma。電流過高，離子的能量和溫度增加，會(huì)損傷樣品形貌。鍍膜時(shí)間小于100s，膜太薄，導(dǎo)電效果差，會(huì)引起放電現(xiàn)象。噴涂時(shí)間大于300s，膜過厚，樣品表面細(xì)微結(jié)構(gòu)會(huì)被掩蓋。樣品臺(tái)與金靶之間的距離對(duì)鍍膜也有影響，距離較短，金粒子密度較大；反之亦然。本試驗(yàn)鍍膜各項(xiàng)參數(shù)最佳值為真空度10.0pa，電流15.0ma，時(shí)間130s，厚度約為10.0nm。

病原微生物樣品制備與圖像質(zhì)量有關(guān)，電鏡參數(shù)的正確設(shè)置更是關(guān)系到能否獲得理想圖片的關(guān)鍵。在掃描電鏡中，進(jìn)行高倍率圖像采集時(shí)，探針電流(probecurrent)的選擇非常重要因?yàn)樘结橂娏鞯倪x擇直接影響束斑的尺寸，而束斑的尺寸決定了圖像的分辨率，束斑尺寸越小，圖像的分辨率越高通常，理想的束斑尺寸是指相鄰的掃描線接觸得非常好，圖像能聚焦得很清楚如果束斑尺寸太大，則會(huì)出現(xiàn)掃描線重合，而圖像無法聚焦但如果束斑尺寸太小，則圖像中電噪聲太大，圖像聚焦和消像散非常困難。電子束射入樣品的能量取決于加速電壓。一般情況下，加速電壓越低，圖像的信息越限于表面，圖像就顯得自然細(xì)節(jié)豐富，但樣品表面對(duì)污染變得更為敏感，而且得不到高倍放大圖像。反之，加速電壓越高，電子束越容易聚焦變細(xì)，也就越容易得到高分辨率，適用于高倍放大圖像，但圖像會(huì)損失細(xì)節(jié)。高電壓對(duì)樣品有較大損傷，不適于同一位置長(zhǎng)時(shí)間觀察。在滿足分辨率需求的情況下，盡量選用較低的電壓，因?yàn)榧铀匐妷涸黾?，噪音就?huì)隨之增加，會(huì)影響圖像質(zhì)量。想要得到細(xì)節(jié)豐富、清晰的圖像，須設(shè)不同的加速電壓進(jìn)行反復(fù)比較，最終選擇一相對(duì)最佳數(shù)值觀察。物鏡光闌是電子光學(xué)系統(tǒng)中的重要組成部分，通過選用不同孔徑的光闌可調(diào)整孔徑角，吸收雜散電子，減少球差等，以達(dá)到調(diào)整焦深、分辨率和圖像亮度的目的。物鏡光闌孔徑越小，圖像的分辨率越高、焦深越深、電子束流越小、噪音越多。反之，光闌孔徑越大，圖像的分辨率越低、焦深越淺、電子束流越大、噪音越少。一般觀察2000倍以下可用80μm或50μm光闌孔徑，高倍觀察用50μm或30μm光闌孔徑。工作距離是指樣品與物鏡下端的距離，是影響圖像質(zhì)量的另一個(gè)重要因素，通常其變動(dòng)范圍為0.1～3.0mm。工作距離越小，分辨率越高、景深越淺。相反，工作距離越大，分辨率越低、景深越深。如果觀察試樣是凹凸不平的表面，要獲得較大的焦深，必須采用大的工作距離，但樣品與物鏡光闌的張角變小，使圖像的分辨率降低。要獲得高的圖像分辨率，必須選擇小的工作距離，通常選擇10～15mm，以期獲得小的束斑直徑和減小球差。本方法中選擇光闌孔50μm、工作距離12.5mm，圖像清晰、焦深好更具立體感。

綜上所述要獲得理想的、高質(zhì)量的掃描電鏡圖片，首先生物樣品制備非常重要，它關(guān)系到能否觀察樣品的原始形貌。其次掃描電鏡的工作參數(shù)設(shè)置也至關(guān)重要，它的調(diào)試與圖像的清晰、細(xì)節(jié)的豐富、樣品的立體感有著密不可分的作用。