本發(fā)明屬于細胞檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的方法。

背景技術(shù)：

流式細胞術(shù)(flowcytometry，fcm)是一種對單個細胞表面或細胞內(nèi)化學成分進行定量分析和分選的新技術(shù)。fcm主要通過采集前向散射光(fsc)和側(cè)向散射光(ssc)將細胞大小和細胞內(nèi)粒度不同的細胞分開。并通過識別細胞表面和細胞內(nèi)特異的熒光標記，實現(xiàn)對dna、rna、細胞因子、細胞表面抗原等的檢測。該技術(shù)作為一種快速細胞分析技術(shù)，不僅應用于免疫學、微生物學等基礎醫(yī)學研究，更廣泛應用于腫瘤學、血液學等臨床檢測。

流式細胞術(shù)可以通過識別細胞表面特異的免疫熒光信號，來實現(xiàn)t淋巴細胞亞群的檢測，有助于評價機體的細胞免疫功能。此外，還可以應用流式細胞術(shù)來評價單克隆抗體的特異性，在單克隆抗體制備中選出最優(yōu)的標記信號(例如在檢測雞外周血t淋巴細胞時，pe標記比fitc標記的cd3有更廣的檢測范圍)。在臨床和科學研究中發(fā)現(xiàn)，樣本前處理、檢測時電壓和熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)、結(jié)果分析時的處理方式在一定程度上都會影響檢測結(jié)果，造成檢測值波動范圍大、檢測結(jié)果不穩(wěn)定。目前尚無使用流式細胞儀檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的可靠參考方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對樣本前處理、檢測時電壓和熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)、結(jié)果分析時的處理方式的不同造成檢測結(jié)果波動大、不穩(wěn)定的問題，提供了一種流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的方法，建立了一種穩(wěn)定規(guī)范的雞外周血t淋巴細胞亞群的檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的方法，包括以下步驟：

步驟1，取雞外周靜脈血，制備抗凝血，用淋巴細胞分離液處理獲得外周血白細胞；

步驟2，用pbs液對所述外周血白細胞離心洗滌后，制備單細胞懸液；

步驟3，吸取所述單細胞懸液兩份至兩支流式管中，一份加入抗雞的cd3、cd4、cd8單克隆抗體各一頭份，旋渦混勻，于4℃避光染色，用作檢測管；另一份用做陰性設置管。

步驟4，染色后，用pbs液洗滌并重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測；

步驟5，分析檢測結(jié)果，獲得雞外周血t淋巴細胞亞群比例。

進一步地，所述用淋巴細胞分離液處理獲得外周血白細胞，具體為：于流式管中按照體積比1:1先后添加淋巴細胞分離液和抗凝血，保證抗凝血與淋巴細胞分離液分界清晰，離心分離后獲得外周血白細胞。

進一步地，所述離心分離的轉(zhuǎn)速為2500r/min，時間為15min。

進一步地，所述制備單細胞懸液具體為：將外周血白細胞用預冷的pbs液洗滌后重懸，調(diào)整為細胞濃度1×10⁶-1×10⁷個/ml的單細胞懸液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進一步地，陰性設置管的處理方式有兩種，一是用同型對照試劑染色；二是不染色。

進一步地，同型對照試劑的選擇方法具體為：選擇與抗體對應表面標志的一抗完全相同種屬來源、相同亞型及熒光標記的抗體。例如，檢測管使用的是小鼠抗雞的cd4fitc標記的抗體，說明書上顯示其成份是mouseigg1，那么同型對照就是fitc標記的mouseigg1。熟悉各單抗陽性細胞的分群情況后，通常使用空白對照來設置陰性對照即可。

進一步地，所述染色的時間為30min。

進一步地，所述使用流式細胞儀進行檢測，包括：在前向散射光/側(cè)向散射光雙參數(shù)圖中調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益參數(shù)，使淋巴細胞與周圍細胞分開；選取淋巴細胞并設門；用陰性設置管設定陰性區(qū)，用檢測管調(diào)節(jié)熒光補償。

進一步地，所述調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益參數(shù)，具體為：調(diào)節(jié)側(cè)向散射光通道的電壓，將淋巴細胞群與周圍細胞分開；調(diào)節(jié)前向散射光通道的電流增益，使細胞團與細胞碎片分開。

進一步地，所述設定陰性區(qū)具體為：取陰性設置管上流式細胞儀，設定散點圖中十字門左下方的區(qū)域為陰性區(qū)，調(diào)節(jié)電壓使陰性區(qū)內(nèi)細胞百分比大于98％。

進一步地，所述分析檢測結(jié)果，包括：圈取目標細胞并設門、分別在cd3/cd4、cd3/cd8、cd4/cd8象限圖中準確界定雙陰性區(qū)、單陰性區(qū)和雙陽性區(qū)，讀取cd3⁺、cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞百分比，從而獲得雞外周血t淋巴細胞亞群比例。

進一步地，所述圈取目標細胞并設門要求圈取靠近前向散射光軸的細胞團。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

(1)本發(fā)明成功建立了穩(wěn)定規(guī)范的流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的方法，通過對樣品前處理、檢測和分析過程中的目標細胞選取、補償調(diào)節(jié)及參數(shù)選擇的問題進行改進，避免了試驗過程中人為因素造成的誤差，提高了結(jié)果判斷的真實性和客觀性。

(2)本方法簡單易行，可廣泛應用于家禽生產(chǎn)實踐中評價感染傳染性疾病、代謝性疾病和中毒病時雞的細胞免疫功能狀態(tài)，也能廣泛應用于對雞的科學研究中。

(3)本發(fā)明先分離獲得外周血白細胞，再用熒光單抗染色，這是因為雞紅細胞有核，必須用淋巴細胞分離液獲得白細胞；這樣能夠獲得豐富的外周血白細胞。

(4)本發(fā)明上機檢測時，在fsc/ssc二維象限圖中，淋巴細胞團位于靠近fsc軸位置；通過參數(shù)調(diào)節(jié)，使淋巴細胞與沿ssc軸，遠離fsc軸的單核細胞和粒細胞分開；這樣做能夠明顯的將淋巴細胞與其他細胞分開。

(5)雞的cd8陽性細胞無明顯的強、弱陽性分群，本發(fā)明能夠合理區(qū)分出cd3、cd4和cd8陽性細胞，合理分析各亞群t淋巴細胞的百分占比。

當然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明實施例中淋巴細胞分離效果圖，其中：(a)為離心分離前淋巴細胞分離液與抗凝血分界清晰的分離效果圖；(b)為離心分離前淋巴細胞分離液與抗凝血有混合的分離效果圖；a為離心前，b為離心后；

圖2為本發(fā)明實施例在fsc/ssc二維散點圖中圈取雞外周血淋巴細胞示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例中經(jīng)口染毒afb1的雞外周血t淋巴細胞亞群結(jié)果分析圖。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

本發(fā)明流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群的方法，具體包括以下步驟：

步驟1，取受試雞的外周靜脈血2ml，制備抗凝血，用淋巴細胞分離液處理獲得外周血白細胞；

進一步地，所述用淋巴細胞分離液處理獲得外周血白細胞，具體為：于流式管中按照體積比1:1先后添加淋巴細胞分離液和抗凝血，保證抗凝血與淋巴細胞分離液分界清晰，盡量避免二者混合，離心分離后獲得外周血白細胞。

如圖1a所示，在淋巴細胞分離液上方小心加入抗凝血，使離心前分離液與抗凝血間分界清晰，則離心后可獲得較多量乳白色絮狀的中間層細胞(即外周血白細胞層)，且與上層分界清晰(→所示)。若二者有混合，會使離心后液體分層效果不佳，會不同程度地影響淋巴細胞的獲得率；如圖1b所示，加入的抗凝血與下層淋巴細胞分離液有明顯混合時，則離心后獲得的絮狀中間層厚度變薄，且與上層清液分界不清(→所示)。因此，在分離雞外周血淋巴細胞的過程中，要按圖1a所示的方法在淋巴細胞分離液上方加入血液，盡量避免二者混合，保證外周靜脈血與淋巴細胞分離液分界清晰，并及時離心，以保證獲取足量的外周血白細胞。

其中，離心分離的轉(zhuǎn)速為2500r/min，時間為15min。離心后液體分為三層，中間乳白色絮狀液體層為外周血白細胞層。

步驟2，用pbs液對所述外周血白細胞離心洗滌后，制備單細胞懸液；

進一步地，所述制備單細胞懸液具體為：用移液槍小心吸取中間層細胞于另一流式管中，加入1ml預冷的4℃pbs液，混勻后離心洗滌，棄上清后調(diào)整細胞濃度為1×10⁶-1×10⁷個/ml的單細胞懸液，于4℃保存?zhèn)溆?。單細胞懸液濃度過高會導致染色不充分；濃度過低則會使上機檢測時細胞流速低，影響檢測結(jié)果的準確性。

其中，離心洗滌的轉(zhuǎn)速為600-1000r/min、時間5min。

步驟3，吸取100μl所述單細胞懸液于另一流式管中，分別加入抗雞cd3、cd4、cd8單克隆抗體，旋渦混勻，于4℃避光染色30min，用作檢測管；

同時，吸取100μl所述單細胞懸液于另一流式管中，用做陰性設置管，以備流式細胞儀上機檢測時設置陰性區(qū)。

進一步地，陰性設置管的處理方式有兩種，一是用同型對照試劑染色；二是不染色。

進一步地，同型對照試劑的選擇方法具體為：選擇與抗體對應表面標志的一抗完全相同種屬來源、相同亞型及熒光標記的抗體。例如，檢測管使用的是小鼠抗雞的cd4fitc標記的抗體，說明書上顯示其成份是mouseigg1，那么同型對照就是fitc標記的mouseigg1。熟悉各單抗陽性細胞的分群情況后，通常使用空白對照來設置陰性對照區(qū)即可。

步驟4，染色后，用500μl預冷pbs液洗滌并重懸細胞，使用流式細胞儀進行檢測；

進一步地，所述步驟4中使用流式細胞儀進行檢測，包括：在前向散射光/側(cè)向散射光(fsc/ssc)雙參數(shù)圖中調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益(amp)參數(shù)，使淋巴細胞與周圍細胞分開，如圖2a所示；選取淋巴細胞并設門；設置陰性區(qū)；用檢測管調(diào)節(jié)熒光補償，完成數(shù)據(jù)獲取。

本實施例中，在檢測時，將細胞液置于上樣口，以低速模式運行流式細胞儀。

其中，所述調(diào)節(jié)電壓和電流線性增益(amp)參數(shù)，具體為：調(diào)節(jié)側(cè)向散射光(ssc)通道的電壓，使細胞沿ssc軸方向分為較明顯的兩團；調(diào)節(jié)前向散射光(fsc)通道的amp參數(shù)，使細胞團與左側(cè)火箭形的細胞碎片分開。根據(jù)雞t淋巴細胞分化成熟的規(guī)律，外周血中cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞比率相對較多，而cd4⁺cd8⁺t淋巴細胞比率較少，據(jù)此正確調(diào)節(jié)各通道的熒光補償。

其中，所述選取淋巴細胞具體為：設門圈取靠近前向散射光軸的細胞團。

其中，所述設置陰性區(qū)，具體為：用陰性設置管上機，在cd3/cd4、cd3/cd8和cd4/cd8的雙參數(shù)圖中，調(diào)節(jié)十字門左下角的細胞，使其百分比大于98％。

在步驟4中，調(diào)節(jié)熒光補償后，具體可達到的效果為：在cd4/cd8散點圖中，cd4⁺cd8⁺t淋巴細胞比率通常少于3％；在cd3/cd4和cd3/cd8散點圖中，十字門右下角的cd4或cd8單陽性細胞百分比通常少于2％。

步驟5，分析檢測結(jié)果，獲得雞外周血t淋巴細胞亞群比例。

進一步地，所述步驟5中分析檢測結(jié)果，包括：調(diào)出陰性區(qū)設置圖，確定十字門的具體位置；調(diào)出檢測結(jié)果圖，在fsc/ssc雙參數(shù)圖中圈取t淋巴細胞并設門；再分別在cd3/cd4、cd3/cd8、cd4/cd8象限圖中準確界定雙陰性區(qū)、單陰性區(qū)和雙陽性區(qū)，分別讀取cd3⁺、cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞百分比，從而獲得雞外周血t淋巴細胞亞群比例；計算cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞的比值。

具體的，應用cellquest或者flowjo軟件在fsc/ssc雙參數(shù)圖中正確圈取t淋巴細胞并設門。分析時選取淋巴細胞的設門位置會導致結(jié)果差異極大，應圈取靠近ssc軸的細胞團并設門，如圖2a所示。由圖2a所示圈取目標細胞時，右側(cè)象限圖中顯示cd3陽性t淋巴細胞占比例較多；按圖2b所示圈取目標細胞時，則其中cd3陽性細胞比例較少。因此，由于外周血淋巴細胞中成熟的cd3陽性t淋巴細胞占比例較多，應按圖2a所示的方法在fsc/ssc散點圖中圈取目的細胞，即圈取靠近ssc軸的細胞團。

其中，準確界定雙陰性區(qū)、單陰性區(qū)和雙陽性區(qū)，具體為：按照陰性區(qū)細胞數(shù)量大于98％的標準，用未染色細胞的cd3/cd4、cd3/cd8、cd4/cd8象限圖確定十字門的位置，由此確定染色細胞在相應象限圖中的十字門位置，十字門左下角顯示雙陰性區(qū)細胞比例，左上角和右下角顯示單陽性細胞比例，右上角顯示雙陽性細胞比例。

所述分別讀取cd3⁺、cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞百分比，具體為：cd3⁺t淋巴細胞百分比的值為cd3/cd4象限圖中左上角和右上角細胞百分比總和；cd3⁺cd4⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞百分比的值分別為cd3/cd4和cd3/cd8象限圖中右上角的細胞百分比。

在用流式細胞術(shù)檢測雞外周血t淋巴細胞亞群時，與檢測哺乳類動物的不同主要包括：一是雞的紅細胞有核，需要用淋巴細胞分離液獲得白細胞；二是在fsc和ssc二維象限圖中，要正確地圈取待分析的淋巴細胞群；三是熒光補償?shù)那‘斦{(diào)節(jié)及陽性細胞位置的正確選取對實驗結(jié)果有較大影響。本發(fā)明通過在分離外周血白細胞時盡量避免血液與淋巴細胞分離液互溶，以獲取足量的淋巴細胞；在檢測時，應正確圈取淋巴細胞群、合理調(diào)節(jié)電壓和amp參數(shù)，及合理調(diào)節(jié)熒光補償；從而成功建立了一種穩(wěn)定規(guī)范的雞外周血t淋巴細胞亞群的流式細胞儀檢測方法。

實施例

檢測經(jīng)口染毒afb1的雛雞新鮮外周血液中cd3/cd4/cd8的表達情況。

試驗雞平均分為兩組，對照組雛雞采食正常對照日糧，afb1組雛雞采食含一定劑量水平afb1的日糧。飼喂21天后，每組隨機選取6只雞，頸靜脈采血，制備抗凝血，用于檢測雞的外周血t淋巴細胞亞群分布情況。

步驟1，先于流式管中加入1ml淋巴細胞分離液，再小心加入等體積的新鮮血液，使新鮮血液完全位于淋巴細胞分離液上層，避免二者混合；

步驟2，將流式管置于普通高速離心機中，以2500r/min的轉(zhuǎn)速離心15min；

步驟3，離心完成后，液體分為三層，用移液槍小心吸取中間層乳白色絮狀液體于另一流式管中，加入1ml預冷的pbs液(4℃)，混勻后以600-1000r/min的轉(zhuǎn)速離心洗滌5min，棄上清，再以pbs液重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10⁶-1×10⁷個/ml，得單細胞懸液；

步驟4，分別吸取制備好的單細胞懸液100μl于另外兩支流式管中，一支管置4℃保存?zhèn)溆米鳛殛幮栽O置管；另一支作為檢測管，分別加入鼠抗雞cd3-sprd(sba,usa)、鼠抗雞cd4-fitc(sba,usa)、鼠抗雞cd8a-pe(sba,usa)單克隆抗體各1頭份，旋渦混勻儀迅速混勻，于4℃靜置避光染色30min；

步驟5，染色后，向上述兩支流式管中加入500μl預冷pbs緩沖液，混勻后使用流式細胞儀(bdfacscalibur)進行檢測：以低速模式(lowspeed)運行流式細胞儀；在fsc/ssc雙參數(shù)圖中正確調(diào)節(jié)ssc通道的電壓和fsc通道的amp參數(shù)，使細胞分為較明顯的兩團，如圖3所示；選取靠近ssc軸的細胞團并設門；用陰性設置管設定陰性區(qū)；用檢測管調(diào)節(jié)熒光補償，完成樣品的數(shù)據(jù)獲取。

步驟6，分析檢測結(jié)果

應用flowjo7.6軟件在fsc/ssc雙參數(shù)圖中圈取t淋巴細胞并設門；再分別在cd3/cd4、cd3/cd8和cd4/cd8象限圖中劃十字門，十字門位置按陰性區(qū)細胞數(shù)量小于98％的標準設定，進而獲得cd3⁺、cd3⁺cd4⁺、cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞百分率值。

實驗結(jié)果如圖3所示，攝食含afb1日糧的雛雞外周血中cd3⁺和cd3⁺cd8⁺t淋巴細胞比例降低。結(jié)果表明，afb1會通過減少雞外周血中成熟t淋巴細胞亞群的分布而干擾其細胞免疫功能。

通過以上內(nèi)容可以看出，本發(fā)明通過在分離外周血白細胞時盡量避免血液與淋巴細胞分離液互溶，以獲取足量的淋巴細胞；在檢測時，應正確圈取淋巴細胞群并合理調(diào)節(jié)電壓及熒光補償；從而成功建立了一種穩(wěn)定規(guī)范的雞外周血t淋巴細胞亞群的流式細胞儀檢測方法，避免了試驗過程中人為因素造成的誤差。應用流式細胞術(shù)更直觀地展示雞外周血t淋巴細胞亞群的分群，為雞外周血t淋巴細胞亞群的研究提供了可靠的技術(shù)參考。

如在說明書及權(quán)利要求當中使用了某些詞匯來指稱特定成分或方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應可理解，不同地區(qū)可能會用不同名詞來稱呼同一個成分。本說明書及權(quán)利要求并不以名稱的差異來作為區(qū)分成分的方式。如在通篇說明書及權(quán)利要求當中所提及的“包含”為一開放式用語，故應解釋成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的誤差范圍內(nèi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在一定誤差范圍內(nèi)解決所述技術(shù)問題，基本達到所述技術(shù)效果。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明本發(fā)明的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當視所附權(quán)利要求所界定者為準。

還需要說明的是，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的商品或者系統(tǒng)不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種商品或者系統(tǒng)所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系統(tǒng)中還存在另外的相同要素。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應當理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進行改動。而本領(lǐng)域人員所進行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。