本申請(qǐng)涉及一種磁性雙功能納米探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于化學(xué)檢測(cè)及生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著現(xiàn)代基因技術(shù)的快速發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)許多人類疾病與核酸分子中的堿基序列變化、折疊、以及它們?cè)诒磉_(dá)數(shù)量、表達(dá)位置和修飾狀態(tài)上發(fā)生的變化密切相關(guān)。致病基因內(nèi)三核苷酸重復(fù)序列(如cgg,cag,ctg和gaa)的不穩(wěn)定異常增多而導(dǎo)致的遺傳病稱作三核苷酸重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變性遺傳疾病。例如在fmr1基因的5'-非翻譯區(qū)存在的cgg三核苷酸重復(fù)序列與脆性x綜合癥相關(guān)，gaa三核苷酸重復(fù)序列突變引起了弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)，cag三核苷酸重復(fù)序列的異常增加導(dǎo)致了亨廷頓舞蹈疾病，因此對(duì)三核苷酸重復(fù)序列的識(shí)別和檢測(cè)一直是研究人員面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前，常用的三核苷酸重復(fù)序列的檢測(cè)方法有：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，重復(fù)擴(kuò)增檢測(cè)，dna印記，納米技術(shù)，蛋白質(zhì)印記，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)等。近年來(lái)dna生物傳感器發(fā)展迅速，鑒于該方法的優(yōu)越性，如快速靈敏、免標(biāo)記、低成本、易操作、高效選擇性和無(wú)污染等，因此它們被廣泛應(yīng)用于疾病標(biāo)記、dna損傷、堿基識(shí)別以及功能性適體核酸等，是生命科學(xué)研究的前沿?zé)衢T領(lǐng)域。納米材料(如金納米粒子，磁性納米粒子，量子點(diǎn)等)常常作為捕獲探針、信號(hào)分子、目標(biāo)標(biāo)記物或者電極載體等在電化學(xué)檢測(cè)體系中發(fā)揮著重要的作用。相比傳統(tǒng)的電化學(xué)材料，納米材料擁有優(yōu)異的生物相容性，高的結(jié)合位點(diǎn)和信號(hào)強(qiáng)度，其中磁性納米粒子由于其易分離，無(wú)毒和高的生物相容性有著廣泛的應(yīng)用。電活性物質(zhì)(如二茂鐵，亞甲基藍(lán)和三氯化六氨合釕等)、納米粒子以及量子點(diǎn)標(biāo)記的核酸都被用來(lái)提供電化學(xué)信號(hào)。目前大多數(shù)電化學(xué)核酸傳感器是建立在dna雜交基礎(chǔ)上的，所以我們把磁性納米粒子、二茂鐵衍生物與前期研究的核酸識(shí)別分子結(jié)合起來(lái)，設(shè)計(jì)合成了一種新型磁性雙功能納米探針，并將其應(yīng)用于電化學(xué)傳感器中檢測(cè)cgg三核苷酸重復(fù)序列，為與cgg三核苷酸重復(fù)酸序列相關(guān)的神經(jīng)性疾病的早期診斷和治療提供了一種可行性方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本申請(qǐng)的目的之一在于提供一種磁性雙功能納米探針。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用如下技術(shù)方案：

一種磁性雙功能納米探針，其特征在于，所述探針以以羧基化fe3o4磁性納米粒子作為納米載體，同時(shí)固定萘啶衍生物和二茂鐵衍生物；同時(shí)具有兩種作用：一是表面的修飾的二茂鐵提供電信號(hào)；二是表面修飾的萘啶衍生物具有識(shí)別核酸序列的功能。

一種磁性雙功能納米探針，所述磁性雙功能納米探針按照以下方法制備：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子分散到pbs緩沖溶液中，同時(shí)加入萘啶衍生物溶液和二茂鐵衍生物溶液，在25～37℃下超聲反應(yīng)1～1.5h，得到反應(yīng)后的溶液；

將所述的反應(yīng)后溶液進(jìn)行磁分離，得到下層的磁性納米粒子，再用pbs緩沖溶液洗滌，之后分散到pbs緩沖溶液中，得到所述的磁性雙功能納米探針。

優(yōu)選地，所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子，按照如下方法得到：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品分散在水中，得到羧基化fe3o4磁性納米粒子的懸浮液；取出所述懸浮液加入到mes緩沖溶液中，同時(shí)加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，然后在超聲條件下進(jìn)行反應(yīng)得到反應(yīng)后的溶液；將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行磁分離和洗滌得到所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子。

本申請(qǐng)的磁性雙功能納米探針，將羧基化fe3o4磁性納米粒子、具有可逆電化學(xué)性質(zhì)的二茂鐵衍生物和能夠特異性識(shí)別cgg三核苷酸重復(fù)序列的萘啶衍生物結(jié)合在一起，合成了一種具有核酸識(shí)別和電化學(xué)活性的磁性雙功能納米探針，利用上述探針構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器對(duì)cgg三核苷酸重復(fù)序列進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)。

本申請(qǐng)的目的之二在于提供一種磁性雙功能納米探針的制備方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用如下技術(shù)方案：

一種磁性雙功能納米探針的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子分散到pbs緩沖溶液中，同時(shí)加入萘啶衍生物溶液和二茂鐵衍生物溶液，在25～37℃下超聲反應(yīng)1～1.5h，得到反應(yīng)后的溶液；

將所述的反應(yīng)后溶液進(jìn)行磁分離，再用pbs緩沖溶液洗滌，之后分散到pbs緩沖溶液中，得到所述的雙功能納米探針。

優(yōu)選地，所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子，按照如下方法得到：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品分散在水中，得到羧基化fe3o4磁性納米粒子的懸浮液；取出所述懸浮液加入到mes緩沖溶液中，同時(shí)加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，然后在超聲條件下進(jìn)行反應(yīng)得到反應(yīng)后的溶液；將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行磁分離和洗滌得到所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子。

優(yōu)選地，所述的制備方法具體包括：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子重新分散到2mlpbs緩沖溶液，同時(shí)加入80μl濃度為1mm的萘啶衍生物溶液和100μl濃度為1mm的二茂鐵衍生物溶液，在37℃下超聲反應(yīng)90min，將反應(yīng)得到的溶液進(jìn)行磁分離，用pbs緩沖溶液洗滌3次，之后分散到120μlpbs緩沖溶液中，得到所述的雙功能納米探針。

優(yōu)選地，所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子，按照如下方法得到：

將羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品分散在50ml超純水中，取出20μl上述制備好的懸浮液加入到2mlmes緩沖溶液中，再同時(shí)加入76mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和46mgn-羥基琥珀酰亞胺，在37℃下超聲反應(yīng)40min，將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行磁分離，用超純水洗滌3次，即得到所述的羧基化fe3o4磁性納米粒子。

優(yōu)選地，所述二茂鐵衍生物的制備包括以下步驟：

a)將二茂鐵甲酸在苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)和n,n-二異丙基乙胺(dipea)作用下，與n-boc-乙二胺反應(yīng)得到二茂鐵衍生物boc-affa；

b)將二茂鐵衍生物boc-affa在4m鹽酸乙酸乙酯溶液中脫保護(hù)得二茂鐵衍生物affa。

優(yōu)選地，所述mes緩沖溶液為0.1m，ph＝6.0并含有0.5mnacl的嗎啉乙磺酸緩沖溶液。

優(yōu)選地，所述pbs緩沖溶液為10mm,ph＝7.4的磷酸鹽緩沖溶液。

作為優(yōu)選方案，二茂鐵衍生物(affa)的制備方法選擇為：將二茂鐵甲酸在hbtu和dipea作用下，與n-boc-乙二胺反應(yīng)得到二茂鐵衍生物(boc-affa)；將二茂鐵衍生物(boc-affa)在4m鹽酸乙酸乙酯溶液中脫保護(hù)得二茂鐵衍生物(affa)。

反應(yīng)過(guò)程如下：

本申請(qǐng)的目的之三在于提供該磁性雙功能納米探針在識(shí)別cgg三核苷酸重復(fù)序列中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

通過(guò)構(gòu)建一種電化學(xué)檢測(cè)體系，在磁性雙功能納米探針的作用下，這種電化學(xué)傳感能夠選擇識(shí)別cgg三核苷酸重復(fù)序列。

本申請(qǐng)中，羧基化fe3o4磁性納米粒子簡(jiǎn)稱為cmnps，萘啶衍生物簡(jiǎn)稱為nc-linker，二茂鐵衍生物簡(jiǎn)稱為affa。

本申請(qǐng)的雙功能納米探針用uv-vis進(jìn)行了表征，結(jié)果表明二茂鐵衍生物和萘啶衍生物成功修飾到磁性納米粒子表面。同時(shí)也采用方波伏特安培測(cè)量法(swv)對(duì)本申請(qǐng)合成的雙功能納米探針的電化學(xué)性能進(jìn)行了研究，結(jié)果表明本申請(qǐng)合成的雙功能納米探針有明顯的電信號(hào)。

雙功能納米探針在cgg三核苷酸重復(fù)序列中的應(yīng)用。本申請(qǐng)所提供的雙功能納米探針既具有識(shí)別功能又具有電信號(hào)，可應(yīng)用于電化學(xué)傳感器中檢測(cè)cgg三核苷酸重復(fù)序列，有較高的選擇性，同時(shí)具有快速、操作簡(jiǎn)便、靈敏及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1：雙功能納米探針的制備示意圖。

圖2：雙功能納米探針的(a)紫外吸收?qǐng)D和(b)方波伏安法圖。其中(a)：羧基化fe3o4磁性納米粒子(b)：nc-linker修飾的羧基化fe3o4磁性納米粒子；(c)affa修飾的羧基化fe3o4磁性納米粒子；(d)：雙功能納米探針。

圖3a和圖3b分別為不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖和循環(huán)伏安圖。其中(a)：裸金電極；(b)裸金電極+sh-dna；(c)：裸金電極+sh-dna+mch；(d)裸金電極+sh-dna+mch+cgg；(e)裸金電極+sh-dna+mch+cgg+雙功能納米探針。

圖4a和圖4b分別為不同三核苷酸重復(fù)序列修飾的電化學(xué)傳感器與雙功能納米探針的磷酸鹽緩沖溶液培育后的方波伏安氧化峰曲線及相應(yīng)的柱狀圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例是對(duì)于本申請(qǐng)內(nèi)容的進(jìn)一步說(shuō)明以作為對(duì)本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容的闡釋，但本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容并不僅限于下述實(shí)施例所述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以且應(yīng)當(dāng)知曉任何基于本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神的簡(jiǎn)單變化或替換均應(yīng)屬于本申請(qǐng)所要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1雙功能納米探針的制備

(1)羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品的制備：將4.05gfecl3·6h2o溶解在75ml超純水中，轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中之后加熱至70℃，在攪拌下加入2.3074gfeso4·7h2o，之后快速加入9ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％的濃氨水，反應(yīng)1min之后逐滴加入2.5g油酸，繼續(xù)在70℃下攪拌1h，溶液中出現(xiàn)黑色溶膠狀物質(zhì)，待溶液冷卻至室溫后用乙醇反復(fù)洗滌，再用超純水洗滌至中性。隨后加入80ml濃度為10mg/ml的kmno4溶液，在室溫下持續(xù)超聲震蕩反應(yīng)4h。將上述溶液進(jìn)行磁分離后用超純水洗滌3次，得到羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品。

(2)二茂鐵衍生物(affa)的制備：將345mg二茂鐵甲酸、1.1377ghbtu和1.0451mldipea一起溶解在30ml干燥的ch2cl2中并在冰浴下持續(xù)攪拌1h，然后加入315.4μln-boc-乙二胺，在30℃下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)混合液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，溶于ch2cl2，分別用飽和na2co3溶液和h2o洗滌，用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾之后旋干得到boc-affa的粗產(chǎn)物，柱色譜純化(rf＝0.6,vchcl3/vch3oh＝8:1)得到橘黃色固體化合物(boc-affa)253mg，產(chǎn)率為45％。¹hnmr和ms的表征結(jié)果，¹hnmr(cdcl3,600mhz)δ:1.46(s,9h),3.37(t,2h),3.49(t,2h),4.20(s,5h),4.34(s,2h),4.69(s,2h),and6.61(s,1h)。化合物分子式為c18h24fen2o3，分子量理論值m/z:373.25，檢測(cè)值m/z:373.11。

取9.3mgboc-affa溶于4mlchcl3中，在冰浴攪拌下逐滴加入2.0ml,4mhcl/etoac進(jìn)行脫保護(hù)，然后在室溫下反應(yīng)0.5h，旋干后用少量chcl3洗滌得到二茂鐵衍生物(affa)。affa的分子式為c13h16fen2o，分子量理論值m/z:273.13，檢測(cè)值esi-msm/z:273.06。

(3)雙功能納米探針的制備：將羧基化fe3o4磁性納米粒子粗品分散在50ml超純水中，取出20μl上述制備好的懸浮液加入到2mlmes緩沖溶液中，再同時(shí)加入76mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)和46mgn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，在37℃下超聲反應(yīng)40min，將反應(yīng)后的溶液進(jìn)行磁分離，用超純水洗滌3次；將上述反應(yīng)后的羧基化fe3o4磁性納米粒子重新分散到2mlpbs緩沖溶液，同時(shí)加入80μl濃度為1mm的萘啶衍生物(nc-linker)溶液和100μl濃度為1mm的二茂鐵衍生物(affa)溶液，在37℃下超聲反應(yīng)90min，將反應(yīng)得到的溶液進(jìn)行磁分離，用pbs緩沖溶液洗滌3次，之后分散到120μlpbs緩沖溶液中，得到雙功能納米探針，如圖1所示。

實(shí)施例2雙功能納米探針的結(jié)構(gòu)和性能表征

(1)雙功能納米探針的紫外表征：分別檢測(cè)雙功能納米探針、羧基化fe3o4磁性納米粒子、萘啶衍生物(nc-linker)和二茂鐵衍生物(affa)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)的紫外吸收光譜。如圖2a所示，萘啶衍生物(nc-linker)在225，319和320nm處有很強(qiáng)的紫外吸收，二茂鐵衍生物(affa)在260nm處有最大吸收峰，雙功能納米探針在225，319，320和260nm處有很強(qiáng)的紫外吸收，結(jié)果表明萘啶衍生物(nc-linker)和二茂鐵衍生物(affa)成功修飾到羧基化羧基化fe3o4磁性納米粒子表面。

(2)雙功能納米探針的電化學(xué)性能表征：將裸金電極分別檢測(cè)雙功能納米探針、羧基化fe3o4磁性納米粒子、萘啶衍生物(nc-linker)和二茂鐵衍生物(affa)的磷酸鹽緩沖溶液(ph＝7.4)的方波伏安曲線圖。如圖2b所示，雙功能納米探針和只修飾了二茂鐵衍生物(affa)的羧基化fe3o4磁性納米粒子的磷酸鹽緩沖溶液在0.46v左右有明顯的電信號(hào)，此結(jié)果說(shuō)明我們?cè)O(shè)計(jì)合成的這種新型雙功能納米探針具有良好的電活性。

實(shí)施例3：基于磁性雙功能探針的電化學(xué)傳感器的構(gòu)建和制備

將拋光過(guò)的金電極在0.5mh2so4中進(jìn)行活化，然后將其浸泡在2μm的sh-dna(5'-hs-(ch2)6-ggccacgagttgaca-3')中13小時(shí)后取出，清洗，再用0.1mm6-巰基己醇封閉金電極表面空出的電化學(xué)活性位點(diǎn)。然后將該金電極浸入4μm的d(cgg)10(5'-cggcggcggcggcggcggcggcggcggcggtgtcaactcgtggcc-3')中培養(yǎng)7小時(shí)，使得d(cgg)10的3'端與sh-dna堿基雜化，最終得到cgg三核苷酸重復(fù)序列修飾的電化學(xué)傳感器。通過(guò)電化學(xué)交流阻抗和循環(huán)伏安法進(jìn)行表征，如圖3所示,經(jīng)dna修飾后的電化學(xué)交流阻抗逐漸增大，峰電流的逐漸降低，表明sh-dna和cgg三核苷酸重復(fù)序列成功組裝到金電極上。

實(shí)施例4：電化學(xué)傳感器對(duì)cgg三核苷酸重復(fù)序列的選擇性識(shí)別

將制備好的電化學(xué)傳感器在本發(fā)明中的新型雙功能納米探針的磷酸鹽緩沖溶液(10mm,ph＝7.4)中培育3h，而后用磷酸鹽緩沖溶液清洗以除去非特異性吸附的探針?lè)肿?。培育后的傳感器通過(guò)swv來(lái)表征本發(fā)明中雙功能納米探針對(duì)三核苷酸重復(fù)序列cgg的選擇性識(shí)別。如圖4所示，cgg傳感器在0.46v左右表現(xiàn)出在明顯的電化學(xué)信號(hào)，然而其它三核苷酸重復(fù)序列(tgg,ccg,gaa,cag,ctg,att和cgg)修飾的電化學(xué)傳感器卻沒(méi)有明顯的電化學(xué)信號(hào)。這些結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明中的新型雙功能納米探針能夠應(yīng)用于電化學(xué)傳感器中選擇性識(shí)別cgg三核苷酸重復(fù)序列。

以上所述，僅是本申請(qǐng)的幾個(gè)實(shí)施例，并非對(duì)本申請(qǐng)做任何形式的限制，雖然本申請(qǐng)以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限制本申請(qǐng)，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本申請(qǐng)技術(shù)方案的范圍內(nèi)，利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許的變動(dòng)或修飾均等同于等效實(shí)施案例，均屬于技術(shù)方案范圍內(nèi)。