本發(fā)明屬于食品添加劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種測定梔子黃中黃曲霉毒素b1的方法。
背景技術(shù)：
：黃曲霉毒素b1對包括人和若干動物具有強(qiáng)烈的毒性，是已知的化學(xué)物質(zhì)中致癌性最強(qiáng)的一種，對人畜危害極大。黃曲霉毒素是黃曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。黃曲霉毒素廣泛存在于土壤、大豆、稻谷、玉米、通心粉、調(diào)味品、牛奶及其制品、食用油、肉類(魚)制品、花生和核桃中等動植物和各種堅(jiān)果中，特別是花生和核桃中。當(dāng)人攝入含黃曲霉毒素b1污染的食物，可發(fā)生急性肝炎、出血性壞死等急性中毒，甚至死亡；當(dāng)微量持續(xù)攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，致癌、致畸等。黃曲霉毒素在農(nóng)產(chǎn)品中幾乎無法避免，在天然食物中以黃曲霉毒素b1最為多見，危害性最強(qiáng)，國家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素b1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定：玉米、花生油、花生及其制品中黃曲霉毒素不得>20μg/kg；大米、其它食用油不得>10μg/kg；其它糧食、豆類、發(fā)酵食品不得>5μg/kg；嬰兒代乳食品不得檢出黃曲霉毒素。歐盟等國于2002年對糧食，花生及其產(chǎn)品中的黃曲霉毒素b1含量規(guī)定，人類直接使用的花生中黃曲霉毒素b1含量需≤2μg/kg，作為食品原料進(jìn)口的花生黃曲霉毒素b1含量需≤8μg/kg。人們?nèi)羰称分悬S曲霉毒素含量超出一定標(biāo)準(zhǔn)，就會直接威脅到人的健康?，F(xiàn)有黃曲霉毒素b1的檢測方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。薄層層析法不需要特殊的儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴(yán)重、準(zhǔn)確性差，不能準(zhǔn)確定量，且對實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的污染危害較大，此法已逐漸被淘汰。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高校液相色譜法，其靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過程繁瑣，耗時長，對實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測。免疫學(xué)分析法包括酶免疫法、放射免疫法和時間分辨熒光法，酶免疫法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低、適于批量檢測等優(yōu)點(diǎn)，但一般為定性或半定量方法，在檢測成分復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素時易受干擾，并存在假陽性的比例較高，檢測準(zhǔn)確度不高等缺點(diǎn)。放射免疫法與酶免疫法相似，但放射免疫法還存在放射污染，對操作者及環(huán)境容易帶來額外不利影響，應(yīng)用較少。時間分辨熒光法是今年已有應(yīng)用，檢測靈敏度比前兩者更高，但前處理仍較復(fù)雜，切所需儀器昂貴，限于醫(yī)學(xué)臨床診斷領(lǐng)域使用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服傳統(tǒng)檢測方法處理繁瑣、定性不準(zhǔn)確、檢出限高(靈敏度差)等缺點(diǎn)，本發(fā)明提供了一種測定梔子黃中黃曲霉毒素b1的方法，該方法步驟簡單、定性準(zhǔn)確、檢出限低(靈敏度高)，能滿足檢測梔子黃中黃曲霉毒素b1的需求。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種測定梔子黃中黃曲霉毒素b1的方法，所述的方法包括以下步驟：1)提取梔子黃中黃曲霉毒素b1：將梔子黃粉狀樣品與水混合，得到混合液，然后采用三氯甲烷萃取劑對混合液進(jìn)行萃取，得到萃取液，萃取液濃縮、凈化并過濾，得到待測液；2)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對步驟1)得到的待測液進(jìn)行測定。本發(fā)明中采用三氯甲烷作為萃取劑為本發(fā)明的一個重要發(fā)明點(diǎn)，現(xiàn)有方法對梔子黃樣品中黃曲霉毒素測定前處理過程繁瑣，易受色素等雜質(zhì)干擾，靈敏度差，因此，申請人從黃曲霉毒素的化學(xué)性質(zhì)入手進(jìn)行研究，從溶解性能上看，黃曲霉毒素b1難溶于水而易溶于三氯甲烷，而梔子黃易溶于水難溶于三氯甲烷，采用三氯甲烷對梔子黃樣品水溶液進(jìn)行萃取，能較好的將黃曲霉毒素b1萃取出來，并且克服了因樣品基質(zhì)對目標(biāo)物的干擾，降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，可有效避免假陽性或假陰性結(jié)果，定性準(zhǔn)確。優(yōu)選的，步驟1)中所述的濃縮為在40-60℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干。優(yōu)選的，步驟1)中所述的凈化為采用n-丙基乙二胺和c18填料進(jìn)行凈化。優(yōu)選的，步驟1)中所述的凈化為濃縮后采用體積分?jǐn)?shù)為80-95％乙腈水溶液淋洗得到淋洗液，然后將淋洗液轉(zhuǎn)入裝有n-丙基乙二胺和c18填料的離心管中，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min得到凈化液。優(yōu)選的，步驟1)中所述的過濾為采用0.22μm有機(jī)濾膜進(jìn)行過濾。優(yōu)選的，步驟2)中，所述的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件為：色譜柱：behc18，2.1×50mm，1.7μm；柱溫：40℃；流動相：5mmol/l的甲酸銨+體積分?jǐn)?shù)0.1％的甲酸水溶液、乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.4ml/min；進(jìn)樣量：5μl；質(zhì)譜條件為：檢測方式：采用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行多離子反應(yīng)監(jiān)測；電離方式：esi+；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：900l/h；毛細(xì)管電壓：3.4kv；離子源溫度：150℃；錐孔氣流速：150l/h。優(yōu)選的，步驟2)中，所述的流動相進(jìn)行梯度洗脫程序?yàn)椋簳r間(min)流速(ml/min)流動相a(％)流動相b(％)00.4901020.4109030.4901040.49010其中，流動相a為5mmol/l的甲酸銨+體積分?jǐn)?shù)0.1％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈，兩者按照體積百分比混合。優(yōu)選的，步驟2)中，質(zhì)譜檢測器的采集參數(shù)為：本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)本發(fā)明中前處理方法簡單，目標(biāo)物在前處理過程中損失少，回收率高，重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確；2)本發(fā)明中通過選擇合適的色譜柱，設(shè)定合適的色譜柱洗脫程序、監(jiān)測離子、駐留時間、錐孔電壓和碰撞能量，對樣品中目標(biāo)物進(jìn)行最優(yōu)化的分離和監(jiān)測；3)本發(fā)明中采用三氯甲烷作為萃取劑，從溶解性能上看，黃曲霉毒素b1難溶于水而易溶于三氯甲烷，而梔子黃易溶于水難溶于三氯甲烷，采用三氯甲烷對梔子黃樣品水溶液進(jìn)行萃取，能較好的將黃曲霉毒素b1萃取出來，并且克服了因樣品基質(zhì)對目標(biāo)物的干擾，降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，可有效避免假陽性或假陰性結(jié)果，靈敏度高，定性準(zhǔn)確。附圖說明圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)溶液的選擇離子流圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1(加標(biāo)濃度0.10μg/kg)的選擇離子流圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例3中梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1(加標(biāo)濃度0.20μg/kg)的選擇離子流圖；三個選擇離子流圖中，縱坐標(biāo)代表峰的強(qiáng)度，橫坐標(biāo)代表峰的保留時間；“mrmof2channelses+”表示：正離子模式電離，多離子反應(yīng)監(jiān)測模式。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明：實(shí)施例1以體積分?jǐn)?shù)為90％乙腈水溶液為溶劑，配制濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0μg/l的黃曲霉毒素b1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，以外標(biāo)法定量。具體操作如下：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件為：色譜柱：behc18，2.1×50mm，1.7μm；柱溫：40℃；流動相：5mmol/l的甲酸銨+體積分?jǐn)?shù)0.1％的甲酸水溶液(流動相a)、乙腈(流動相b)作為流動相進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.4ml/min；進(jìn)樣量：5μl；質(zhì)譜條件為：檢測方式：采用質(zhì)譜檢測器進(jìn)行多離子反應(yīng)監(jiān)測；電離方式：esi+；脫溶劑氣溫度：450℃；脫溶劑氣流速：900l/h；毛細(xì)管電壓：3.4kv；離子源溫度：150℃；錐孔氣流速：150l/h；將黃曲霉毒素b1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液樣品注入所述色譜柱中，流動相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如下：流動相進(jìn)行梯度洗脫程序?yàn)椋簳r間(min)流速(ml/min)流動相a(％)流動相b(％)00.4901020.4109030.4901040.49010其中，流動相a為5mmol/l的甲酸銨+體積分?jǐn)?shù)0.1％的甲酸水溶液，流動相b為乙腈，兩者按照體積百分比混合。所述被色譜柱分離的樣品進(jìn)入質(zhì)譜檢測器進(jìn)行檢測，質(zhì)譜檢測器的采集參數(shù)為：其中，標(biāo)準(zhǔn)溶液選擇離子流圖如圖1，以峰面積y為縱坐標(biāo)，濃度x為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果如表1。表1黃曲霉毒素b1的保留時間，監(jiān)測離子，線性方程及相關(guān)系數(shù)真菌毒素名稱保留時間(min)定量離子對線性方程相關(guān)系數(shù)黃曲霉毒素b11.32313.2/241.3y＝1939x+61.2520.9997在上述條件下，黃曲霉毒素b1選擇離子流圖峰形尖銳、對稱、保留時間穩(wěn)定，黃曲霉毒素b1的濃度與對應(yīng)的峰面積相關(guān)性顯著，說明檢測方法可信。實(shí)施例2(1)稱取10g梔子黃樣品(不含黃曲霉毒素b1)精確至0.01g，添加黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)濃度為0.10μg/kg，得到含黃曲霉毒素b1的梔子黃樣品，將樣品置于100ml燒杯中，用100ml水分次溶解轉(zhuǎn)移樣品至250ml分液漏斗；(2)向分液漏斗中加入100ml三氯甲烷，劇烈震蕩，混勻，靜止分層；(3)將下層溶液轉(zhuǎn)入250ml圓底燒瓶，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用2ml體積分?jǐn)?shù)為90％乙腈水溶液淋洗圓底燒瓶得到淋洗液；(4)將淋洗液轉(zhuǎn)入裝有0.5gn-丙基乙二胺和0.5gc18填料的離心管中，以10000r/min轉(zhuǎn)速離心10min；(5)將上述離心液通過0.22μm有機(jī)濾膜后，得到待測液；(6)利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測步驟(5)得到的待測液，具體操作如實(shí)施例1，設(shè)置三個平行測定，實(shí)驗(yàn)編號分別為s-1、s-2、s-3，選擇離子流圖如圖2。由圖2可知，梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1峰形尖銳，對稱，目標(biāo)物保留時間1.32分鐘處無明顯雜質(zhì)峰干擾，說明前處理過程中提取、凈化效果較好。梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1的測試結(jié)果見表2，由表2可知，平行樣中黃曲霉毒素b1的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)為4.9％。對第一個平行樣(實(shí)驗(yàn)編號s-1)平行測定5次，分析結(jié)果見表3。由表3可知，重復(fù)性測試的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0％。按照稱樣量10g，定容體積100ml、濃縮50倍計(jì)算，梔子黃樣品中的黃曲霉毒素b1的檢出限為0.1μg/kg。表2梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1的測試結(jié)果表3梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1的重復(fù)性測試實(shí)施例3按照實(shí)施例2中樣品前處理方法和儀器分析檢測方法，對梔子黃樣品(不含黃曲霉毒素b1)添加黃曲霉毒素b1標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行不同加標(biāo)濃度的實(shí)驗(yàn)。設(shè)置三個加標(biāo)量，每個加標(biāo)含量的樣品作3次平行測量取平均值，根據(jù)實(shí)際加入量和實(shí)測結(jié)果，計(jì)算樣品的加標(biāo)回收率。結(jié)果見表4。由表4可知，樣品的加標(biāo)回收率范圍為91.5-104％。加標(biāo)濃度為0.20μg/kg的選擇離子流圖如圖3所示，由圖可知，梔子黃樣品中黃曲霉毒素保留時間穩(wěn)定，濃度與響應(yīng)值線性關(guān)系良好，目標(biāo)物回收率理想。表4梔子黃樣品中黃曲霉毒素b1的加標(biāo)回收率最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。當(dāng)前第1頁12