本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿托伐他汀(atorvastatin，at)結(jié)構(gòu)式如圖1、圖2、圖3所示，是羥甲戊二酰輔酶a選擇性抑制劑，可以有效降低血脂水平。at在人體內(nèi)主要由細(xì)胞色素p450酶代謝為鄰羥基阿托伐他汀(ortho-hydroxyatorvastatin，o-oat)和對羥基阿托伐他汀(para-hydroxyatorvastatin，p-oat)。o-oat和p-oat占總體抑制活性的70％。同其他他汀類化合物一樣，at、o-oat和p-oat結(jié)構(gòu)中含有羥基羧酸結(jié)構(gòu)，無論在體內(nèi)和體外均能脫水關(guān)環(huán)形成內(nèi)酯，并且，該體內(nèi)內(nèi)酯代謝物在體外也易于水解轉(zhuǎn)化為羥基羧酸，因而，羥基羧酸濃度測定易受影響不準(zhǔn)確。

現(xiàn)有技術(shù)測定阿托伐他汀及其代謝物，對準(zhǔn)確度和靈敏度均有要求。為了減弱上述羥基羧酸結(jié)構(gòu)與內(nèi)酯間相互轉(zhuǎn)化，一般需要在生物分析各個(gè)步驟控制溫度和ph值，且樣品預(yù)處理步驟越少，越有利于防止羥基羧酸型代謝物和內(nèi)酯型代謝物相互轉(zhuǎn)化。由于阿托伐他汀鈣人體常用劑量較低，一般僅10mg。服藥后血漿中阿托伐他汀的濃度很低，藥物達(dá)峰濃度為10ng/ml左右。其活性代謝物p-oat濃度更小，通常低于1ng/ml。因此，為了同時(shí)監(jiān)測阿托伐他汀及其代謝物濃度，對檢測方法的靈敏度要求很高。

目前，提取血漿中藥物的方法主要有蛋白沉淀法、液-液提取法和固相萃取法。蛋白沉淀預(yù)處理法操作較簡單，也已有報(bào)道將蛋白沉淀預(yù)處理用于測定at及其代謝物。但實(shí)際操作過程中，蛋白沉淀提取后的樣品中含有內(nèi)源性基質(zhì)，容易造成基質(zhì)效應(yīng)等問題。當(dāng)儀器檢測的靈敏度無法達(dá)到研究目的時(shí)，常常需要濃縮大量血漿，因?yàn)橥敫嗟幕|(zhì)。為防止基質(zhì)在色譜柱上蓄積，一般采用長時(shí)間梯度洗脫來避免基質(zhì)蓄積，這無疑極大地降低了分析通量。鑒于蛋白沉淀法的以上缺點(diǎn)，已報(bào)道的測定阿托伐他汀及其代謝物方法中，樣品預(yù)處理方法多為液-液提取法和固相萃取法。然而兩種方法的預(yù)處理步驟比較繁瑣、費(fèi)時(shí)、溫度和ph不易控制，易導(dǎo)致阿托伐他汀及其代謝物的測定結(jié)果不準(zhǔn)確。由于上述不足，出現(xiàn)了鹽析輔助液-液提取方法，該法操作簡單、成本低、樣品純凈，近年來受到廣泛關(guān)注。鹽析是一種結(jié)晶蛋白的常用方法?；陔娊赓|(zhì)-非電解質(zhì)相互作用理論。當(dāng)電解質(zhì)濃度升高時(shí)，非電解質(zhì)在水溶液中的溶解度降低。在水溶液中增加電解質(zhì)的濃度即可降低親脂性物質(zhì)在水中的溶解度，將待測物提取到有機(jī)試劑層中，與水溶性內(nèi)源基質(zhì)分離。但該法普遍存在靈敏度低和血漿用量大的缺點(diǎn)。

現(xiàn)有血漿藥物濃度的儀器檢測方法有液相色譜-紫外法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法等。液相色譜-紫外法是藥物濃度檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但該檢測技術(shù)具有選擇性差、靈敏度低等特點(diǎn)，限制了該技術(shù)在生物樣品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，兼容了色譜的分離能力與質(zhì)譜的高選擇性，已經(jīng)成為生物分析領(lǐng)域的最重要的工具。盡管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)極大地增強(qiáng)了定量分析能力，但該技術(shù)也同樣存在一些缺點(diǎn)，面臨著一些挑戰(zhàn)。如質(zhì)譜中待測物離子化的過程常被樣品中的生物基質(zhì)所影響，導(dǎo)致響應(yīng)的波動(dòng)，影響測定的準(zhǔn)確性。相關(guān)報(bào)道如下：

zhou于2013年建立了液-液提取聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中at、o-oat和p-oat。該方法靈敏度較高，可達(dá)20pg/ml左右，但血漿用量較大，為0.5毫升。液-液提取的方法，步驟復(fù)雜且不能有效控制提取體系的ph值，也沒有對內(nèi)酯和羥基羧酸之間的相互轉(zhuǎn)化做有效的評估。色譜運(yùn)行時(shí)間較長，需要約6分鐘，不適合大批量樣品測試。

liu于2008年建立固相萃取-聯(lián)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定血漿中at、p-oat的分析方法。盡管色譜運(yùn)行短，僅為2.5min。血漿用量少，僅0.1毫升。但分析方法的靈敏度不足，p-oat的定量下限僅為0.2ng/ml，無法完整的檢測其藥動(dòng)學(xué)特征，且該分析方法不能檢測o-oat。同時(shí)，固相萃取法步驟復(fù)雜、耗時(shí)長，同樣不適合大批量樣品檢測。

hassan于2014建立了salle聯(lián)合液相色譜法測定人血漿中at。方法中使用了氯化鎂作為鹽析試劑。該氯化鎂為不揮發(fā)性鹽，不適合質(zhì)譜檢測。該分析方法使用紫外檢測器，選擇性差，方法的靈敏度很低為1.00ng/ml，并且提取方法使用了1毫升血漿樣品，血漿消耗量過大。靈敏度低和血漿用量大的特點(diǎn)使該方法不適合現(xiàn)有的臨床研究。

有鑒于上述的缺陷，為滿足臨床大批量樣品分析的需求，需開發(fā)更簡單、可靠、高通量的樣品預(yù)處理方法及血漿藥物濃度測定方法，用于測定阿托伐他汀及其代謝物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種解決血漿用量大、提取步驟復(fù)雜、提取條件不可控、靈敏度低、色譜運(yùn)行時(shí)間長，無法同時(shí)高靈敏及低樣品量檢測等問題的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，用于檢測阿托伐他汀及兩種代謝物。本發(fā)明技術(shù)方案如下：

檢測人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，含下述步驟：

預(yù)處理，取血漿，加入阿托伐他汀及代謝物同位素內(nèi)標(biāo)溶液，以6m醋酸銨水溶液和乙腈為鹽析分層試劑沉淀蛋白，渦流及離心后制得血漿樣品；

色譜，將血漿樣品液相色譜分離，采用kinetexxbc18柱，梯度洗脫，流動(dòng)相a:流動(dòng)相b初始體積比為60:40，流速0.8ml/min，柱溫40℃，流動(dòng)相a為水，流動(dòng)相b為乙腈；

質(zhì)譜，電噴霧電離源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描，噴霧電壓5500v，內(nèi)源氣體1(n2)65psi，氣體2(n2)75psi，氣簾氣體(n2)35psi，離子源溫度500℃，阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z559→m/z440，ce22ev，d5-阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z564→m/z445，ce22ev，鄰羥基阿托伐他汀和對羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z575→m/z440，ce34ev，d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z580→m/z445，ce34ev；

計(jì)算，以阿托伐他汀及代謝物濃度為橫坐標(biāo)，阿托伐他汀及代謝物與阿托伐他汀及代謝物內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，回歸制得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算阿托伐他汀及代謝物的血藥濃度。

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述預(yù)處理步驟，采用冰凍醋酸銨水溶液和乙腈。

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述預(yù)處理步驟，內(nèi)標(biāo)溶液配制：稱取d5-阿托伐他汀、d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對羥基阿托伐他汀，以甲醇溶解并定容制得1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液，吸取各內(nèi)標(biāo)貯備液適量，加入稀釋液得濃度10.0ng/ml的d5-阿托伐他汀、d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對羥基阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)溶液，所述稀釋液為甲醇和水混合液，甲醇:水的體積比為50:50。

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述預(yù)處理步驟，取100μl血漿，分別加入20.0μl內(nèi)標(biāo)溶液、100μl6m醋酸銨水溶液和400μl乙腈，渦流及離心后取上清液于氮?dú)饬鞔蹈蓾饪s，殘留物以乙腈和水溶解且渦流混勻得血漿樣品，乙腈:水的體積比為40:60。

本發(fā)明方法更進(jìn)一步地，經(jīng)所述渦流提取血漿樣品的時(shí)間控不超過1min。

本發(fā)明方法更進(jìn)一步地，所述渦流及離心條件為渦流1min，14000rpm離心1min。

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述色譜步驟，流動(dòng)相a含0.1％甲酸

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述色譜步驟，將血漿樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，進(jìn)樣體積為2.0μl。

本發(fā)明方法進(jìn)一步地，所述色譜步驟，所述色譜步驟，kinetexxbc18柱為核殼色譜柱，其長度50mm、直徑2.1mm、填料粒徑2.6μm。

本發(fā)明目的之二，提供檢測人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法在評價(jià)阿托伐他汀生物等效性的應(yīng)用，是以d5-阿托伐他汀為分析檢測阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)物。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①對樣品預(yù)處理、色譜分離和質(zhì)譜檢測，建立經(jīng)濟(jì)簡便的阿托伐他汀及代謝物檢測方法，采用本發(fā)明條件的鹽析輔助液-液提取預(yù)處理方法，獲得高回收率且有效降低內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾，既避免傳統(tǒng)蛋白沉降法通過濃縮大量血漿提高檢測靈敏度造成的基質(zhì)效應(yīng)擴(kuò)大的缺點(diǎn)，也避免傳統(tǒng)液-液提取法和固相萃取預(yù)處理方法的繁瑣和條件不易受控，滿足方法學(xué)的各項(xiàng)考證指標(biāo)；

③本發(fā)明以氘代阿托伐他汀及代謝物做內(nèi)標(biāo)物，測定血液中阿托伐他汀及代謝物濃度的重現(xiàn)性、準(zhǔn)確性均較好；

④專一性選擇性強(qiáng)，kinetexxbc18柱，分離度好，色譜僅在2min內(nèi)完成測定，本發(fā)明條件下的分離過程，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)物兩者的測定；

⑤靈敏度高，血漿樣品中阿托伐他汀的最低限量可低至0.02ng/ml，阿托伐他汀代謝物的最低限量可低至0.01ng/ml；

⑥檢測快速，2min左右完成血漿樣品的一次測定，滿足高通量大批量生物樣品的檢測；

⑦用量小，每次血漿樣品測試僅需12μl即可準(zhǔn)確測定出阿托伐他汀及其代謝物的濃度；

⑧本發(fā)明系統(tǒng)的評估了阿托伐他汀及其內(nèi)酯代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化情況，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性；

⑨采用本發(fā)明建立的lc-ms/ms方法測定阿托伐他汀血藥濃度，得到阿托伐他汀及其代謝物的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，可用于評價(jià)阿托伐他汀及其代謝物各劑型的生物等效性。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是阿托伐他汀(上)、鄰羥基阿托伐他汀(中)、對羥基阿托伐他汀(下)化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖；

圖2是阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖3是d5-阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖4是鄰羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖5是d5-鄰羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖6是對羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖7是d5-對羥基阿托伐他汀產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖；

圖8是阿托伐他汀(上)、鄰羥基阿托伐他汀(中)、對羥基阿托伐他汀(下)離子反應(yīng)推測的斷裂方式示意圖；

圖9是空白樣品(左)、lloq樣品(右)阿托伐他汀mrm色譜圖

圖10是空白樣品(左)、lloq樣品(右)d5-阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖11是空白樣品(左)、lloq樣品(右)對羥基阿托伐他汀與鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖12是空白樣品(左)、lloq樣品(右)d5-對羥基阿托伐他汀與d5-鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖13是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖14是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)d5-阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖15是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)對羥基阿托伐他汀與鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖16是空白含內(nèi)標(biāo)樣品(左)、受試者口服阿托伐他汀鈣片樣品(右)d5-對羥基阿托伐他汀與d5-鄰羥基阿托伐他汀mrm色譜圖；

圖17是24名健康受試者單次口服20mg受試制劑或參比制劑平均藥物濃度-時(shí)間曲線圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測血漿中藥物濃度的方法開發(fā)通?？煞譃槿齻€(gè)部分，即提取方法(即預(yù)處理方法)、液相色譜方法和質(zhì)譜方法。本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)，從以上這三個(gè)方面著手建立檢測方法。

【預(yù)處理】

取血漿，加入阿托伐他汀及代謝物同位素內(nèi)標(biāo)溶液，以6m醋酸銨水溶液和乙腈為鹽析分層試劑沉淀蛋白，渦流及離心后制得血漿樣品。

本發(fā)明采用上述提取方法，較現(xiàn)有分析方法操作簡單、提取時(shí)間短、適合高通量樣品預(yù)處理。通過使用冰凍乙腈和6m醋酸銨溶液實(shí)現(xiàn)了對溫度和ph兩個(gè)參數(shù)的控制，防止內(nèi)酯(lactone，lac)和羥基羧酸(carboxylate，car)型相互轉(zhuǎn)化。預(yù)處理步驟制得血漿樣品的時(shí)間控不超過1min，降低了預(yù)處理過程中發(fā)生相互轉(zhuǎn)化的概率，確保測定準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)蛋白沉淀相比，固相萃取和液-液提取法去除血中蛋白、鹽類、磷脂類等內(nèi)源性物質(zhì)能力強(qiáng)，可以獲得比較潔凈的提取物。然而由于操作步驟復(fù)雜、樣品預(yù)處理時(shí)間冗長，car型化合物和lac型化合物容易發(fā)生相互轉(zhuǎn)化。即使采取低溫或控制ph的方法可以有效降低相互轉(zhuǎn)化，但是在樣品預(yù)處理過程中的每一步都嚴(yán)格控制這些參數(shù)十分困難。因此需要建立步驟簡單的預(yù)處理方法。

本發(fā)明預(yù)處理方法，提取物潔凈度可以與液-液提取和固相萃取效果相當(dāng)，并具有操作簡單、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本研究選用乙腈和6m醋酸銨溶液，與質(zhì)譜兼容性好。預(yù)處理?xiàng)l件優(yōu)化時(shí)，考察了不同濃度的醋酸銨的分層效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)醋酸銨濃度大于6m時(shí)，與乙腈的分層清晰可見?，F(xiàn)有技術(shù)中，at的lac與car型相互轉(zhuǎn)化受ph影響較大，酸性條件下易于環(huán)合為lac，堿性條件下水解開環(huán)。本發(fā)明使用的6m醋酸銨溶液ph為6，可以有效抑制相互轉(zhuǎn)化的發(fā)生。并且，采用冰凍醋酸銨水溶液和乙腈，即乙腈和6m醋酸銨溶液在使用前置于冰浴中，可以降低提取過程溫度。為了降低提取時(shí)間，提高樣品預(yù)處理通量，對渦流提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取回收率在1min內(nèi)達(dá)到峰值，回收率大于80％。

【色譜】

將血漿樣品液相色譜分離，采用kinetexxbc18柱，梯度洗脫，流動(dòng)相a:流動(dòng)相b初始體積比為60:40，流速0.8ml/min，柱溫40℃，流動(dòng)相a為水，流動(dòng)相b為乙腈。

o-oat和p-oat是同分異構(gòu)體，并且有相同的質(zhì)譜裂解方式。因此，為了避免相互干擾，需要將兩種物質(zhì)色譜分離。o-oat結(jié)構(gòu)中鄰羥基和胺基之間可形成分子內(nèi)氫鍵，因此極性較p-oat低，易于色譜分離。現(xiàn)有技術(shù)常采用c18為鍵合相的色譜柱進(jìn)行分離，色譜運(yùn)行時(shí)間在2.5到20分鐘之間。

本發(fā)明采kinetexxbc18熔融核色譜柱，具有高柱效、高通量、低背景壓力的特點(diǎn)。在方法開發(fā)過程中出現(xiàn)嚴(yán)重的色譜峰拖尾現(xiàn)象，通過在水相中添加1％甲酸的方法可以減輕拖尾，從而提高峰高和峰對稱性。使用了高流速，如0.8ml/min的快速洗脫程序，總的色譜運(yùn)行時(shí)間僅為2.2min，快速分離，尤其適合高通量樣品處理，試驗(yàn)證明，本發(fā)明o-oat和p-oat獲得基線分離。

本發(fā)明渦流及離心條件優(yōu)選為渦流1min，14000rpm離心1min。優(yōu)選流動(dòng)相a含0.1％甲酸。將血漿樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析時(shí)，進(jìn)樣體積僅為2.0μl即可。本發(fā)明采用的kinetexxbc18柱為核殼色譜柱，其長度50mm、直徑2.1mm、填料2.6μm。

【質(zhì)譜】

電噴霧電離源，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描，噴霧電壓5500v，內(nèi)源氣體1(n2)65psi，氣體2(n2)75psi，氣簾氣體(n2)35psi，離子源溫度500℃，阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z559→m/z440，ce22ev，d5-阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z564→m/z445，ce22ev。圖2至圖7為定量分析at和d5-at時(shí)監(jiān)測的離子。如圖2所示為阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖，圖3所示為d5-阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖，圖4所示為鄰羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖，圖5所示為d5-鄰羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖，圖6所示為對羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖，圖7所示為d5-對羥基阿托伐他汀正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描質(zhì)譜圖。

鄰羥基阿托伐他汀和對羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z575→m/z440，ce34ev，d5-鄰羥基阿托伐他汀和d5-對羥基阿托伐他汀反應(yīng)監(jiān)測離子[m+h]+m/z580→m/z445，ce34ev，圖8是at(上)、o-oat(中)、p-oat(下)離子反應(yīng)推測的斷裂方式示意圖，反映at、o-oat、p-oat以及同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜斷裂方式，“*”號為氘代位點(diǎn)。

實(shí)施例：

【縮寫說明】

1材料

1.1儀器

色譜儀：lc-30ad快速液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司。

質(zhì)譜儀：6500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源(turboionspray)，加拿大sciex公司。

數(shù)據(jù)處理采用軟件：analyst(version1.6.2)，加拿大sciex公司。

離心機(jī)：ct15re型離心機(jī)，日本hitachi公司。

分析天平：cd225d型分析天平，北京賽多利斯儀器有限公司。

1.2對照品和試劑

阿托伐他汀鈣(純度，96％)和d5-阿托伐他汀鈣鹽(純度，98％)購自加拿大torontoresearchchemicals公司。

鄰羥基化阿托伐他汀(純度，98.5％)、對羥基化阿托伐他汀(純度，98％)、d5-鄰羥基化阿托伐他汀(純度，99.2％)和d5-對羥基化阿托伐他汀(純度，99.2％)購自加拿大tlc公司。

甲醇、乙腈、醋酸銨(hplc級)購自美國sigma公司。

去離子水(18.2mω，toc≤50ppb)由法國milli-q超純水系統(tǒng)制備。

2方法

2.1溶液及樣品的配制

【標(biāo)準(zhǔn)系列樣品】精密稱取各對照品適量，以甲醇分別溶解并定容，配制成at、o-oat和p-oat濃度約為1.00mg/ml的貯備液。精密吸取各自貯備液適量，以人空白血漿逐級稀釋得到混合標(biāo)準(zhǔn)系列樣品，at、o-oat和p-oat濃度范圍分別為0.0200～15.0、0.0200～15.0和0.0100～2.00ng/ml。

【質(zhì)控樣品】采用與標(biāo)準(zhǔn)系列樣品相似方法配制at、o-oat和p-oat四個(gè)濃度水平混合質(zhì)控樣品。lloq濃度為0.0200/0.0200/0.0100ng/ml，lqc濃度為0.0500/0.0500/0.0200ng/ml，mqc濃度為1.00/1.00/0.200ng/ml，mqc濃度為12.0/12.0/1.60ng/ml。

【內(nèi)標(biāo)溶液】精密稱取各內(nèi)標(biāo)對照品，即d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat。以甲醇溶解并定容，配制成d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat濃度均約為1.00mg/ml的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密吸取上述各內(nèi)標(biāo)貯備液適量，加甲醇:水(50:50，v/v)稀釋，獲得d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat濃度均為10.0ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2血漿樣品處理

取100μl血漿，分別加入20.0μl內(nèi)標(biāo)溶液、100μl6m醋酸銨水溶液和400μl乙腈。渦流1min，離心1min(14000g)，全取上清液于氮?dú)饬鞔蹈蓾饪s。殘留物以乙腈:水(40:60，v/v)溶解，渦流混勻，置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)，進(jìn)行l(wèi)c-ms-ms分析，進(jìn)樣體積為12.0μl。

2.3色譜及質(zhì)譜條件

【色譜條件】

色譜柱：kinetexxbc18(50mm×2.1mmi.d，2.6μm)。

流動(dòng)相a：水，含1％甲酸。

流動(dòng)相b：乙腈。

梯度程序洗脫：

柱溫：40℃。

流速：0.8ml·min-1。

【質(zhì)譜條件】

電噴霧電離源(turboionspray)。

電壓為5500v。

離子源溫度為500℃；

內(nèi)源氣體1(n2)65psi，氣體2(n2)75psi，氣簾氣體(n2)35psi。

掃描模式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(+mrm)掃描。

監(jiān)測離子反應(yīng)分別為：

at，m/z559→m/z440，碰撞能量(collisionenergy，ce)22ev；

d5-at，m/z564→m/z445，ce22ev；

o/p-oat，m/z575→m/z440，ce34ev；

d5-o/p-oat，m/z580→m/z445，ce34ev。

2.4方法學(xué)驗(yàn)證

按照美國fda指導(dǎo)原則對本方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，內(nèi)容包括穩(wěn)定性、選擇性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率基質(zhì)效應(yīng)。

【選擇性】

取六個(gè)來源不同的空白血漿及各自配制的lloq樣品處理后進(jìn)樣分析。色譜共流出干擾物的峰面積須小于lloq待測物峰面積的1/5，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的1/20。

【標(biāo)準(zhǔn)曲線】

以待測物理論濃度為橫坐標(biāo)(x)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行回歸分析計(jì)算的直線回歸方程(權(quán)重因子w＝1/x²)。方法驗(yàn)證每一分析批對標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品雙樣本分析。

【準(zhǔn)確度和精密度】

方法驗(yàn)證每一分析批測定四濃度質(zhì)控樣本各六樣本。lloq日內(nèi)、日間精密度以rsd計(jì)算小于20％方可接受。準(zhǔn)確度以re在20％～20％之間方可接受。其余各濃度水平的qc樣品各成分日內(nèi)、日間精密度需小于15％方可接受，準(zhǔn)確度在15％～15％之間方可接受。

【穩(wěn)定性】

考察各待測物在血漿樣品中的穩(wěn)定性時(shí)，將lqc和hqc置于不同溫度及環(huán)境中，放置結(jié)束后進(jìn)行三樣本分析。共考察四種放置條件，分別為：冰水浴放置6h，提取后進(jìn)樣器內(nèi)放置24h，經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)(從75±10℃到冰水浴)，75±5℃放置97天。

【回收率】

取空白血漿100μl(n＝9)，提取后(不加內(nèi)標(biāo)溶液)取全部乙腈層液體分別加入和lqc、mqc和hqc相同濃度的待測物溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦流混合后測定。另提取lqc、mqc和hqc各6份，進(jìn)樣測定。以2種處理方法的峰面積比值計(jì)算提取回收率。

【基質(zhì)效應(yīng)】

取不同來源空白血漿(n＝6)，提取后(不加內(nèi)標(biāo)溶液)，取全部乙腈層液體加入和lqc和hqc相同濃度的待測物溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，渦流混合后測定。另取去離子水代替血漿，按上述方法處理。以兩種方法獲得的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)因子，通過基質(zhì)因子的rsd評估基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)因子小于15％方可接受。

2.5阿托伐他汀內(nèi)酯(lac)和羥基羧酸(car)型結(jié)構(gòu)相互轉(zhuǎn)化評估

樣品吹干濃縮過程中以及提取后樣品放置過程中，可能存在lac和car型相互轉(zhuǎn)化，影響濃度測定準(zhǔn)確性。由于沒有待測物lac結(jié)構(gòu)的對照品，采用受試者的混合血漿樣品，評估這一影響。合并同一時(shí)間點(diǎn)三名受試者血漿樣品，編碼為1到16。

【吹干的影響】

使用本發(fā)明預(yù)處理方法提取以上樣品。將100μl上層乙腈置于96孔板內(nèi)吹干濃縮，殘留物以250μl乙腈：水(40:60，v/v)溶解，編號為set(a)。另取100μl上層乙腈，加入150μl去離子水，編號為set(b)。將兩套樣品進(jìn)樣分析，評估吹干對濃度測定的影響。

【預(yù)處理后放置過程的影響】

采用預(yù)處理后放置24h再分析的方法評估放置過程對濃度測定的影響。將1-16號樣品按照“2.2血漿樣品處理”方法提取后分析。該樣品于分析后置于自動(dòng)進(jìn)樣器內(nèi)(4℃)24h后再次分析。比較兩次測定濃度，評估預(yù)處理后放置過程對濃度測定的影響。

2.6生物等效性研究

應(yīng)用建立的定量分析方法測定血漿中at及代謝物的濃度，用于評價(jià)阿托伐他汀鈣片人體生物等效性。24名健康受試者隨機(jī)分成兩組，分別給予20mg阿托伐他汀片的參比制劑和受試制劑。8天清洗期后將參比制劑組與受試制劑組交換。于給藥前(0h)、給藥后0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h、16h、24h、36h、48h和72h，靜脈取血2～3ml，置肝素抗凝離心管中，離心(2000g，4℃)10min后分離血清，75±10℃保存

3結(jié)果與討論

3.1方法學(xué)驗(yàn)證

【方法的選擇性】

圖9至圖16所示為測定人血漿中at、o-oat、p-oat及內(nèi)標(biāo)典型mrm色譜圖，峰i、ii、iii、iv、v、vi分別為at、d5-at、o-oat、p-oat、d5-o-oat、d5-p-oat。at、o-oat和p-oat保留時(shí)間分別約為1.4、0.5、1.3min，保留時(shí)間附近未見共流出干擾峰。

【標(biāo)準(zhǔn)曲線】

本發(fā)明以at及代謝物濃度為橫坐標(biāo)，at及代謝物內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，回歸制得相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算at及代謝物的血藥濃度。測定人血漿中at和o-oat線性范圍均為0.0200～15.0ng/ml；p-oat線性范圍為0.0100～2.00ng/ml。待測物標(biāo)準(zhǔn)曲線直線平均回歸方程(n＝3x2)分別為：

at:y＝(0.461±0.042)x+(0.000335±0.000745)(r＝0.9986±0.0005)，

o-oat:y＝(0.649±0.060)x－(0.000014±0.000734)(r＝0.9983±0.0011)，

p-oat:y＝(0.404±0.031)x－(0.000534±0.000218)(r＝0.9986±0.0003)。

【方法的精密度與準(zhǔn)確度】

各成分lloq日間精密度均不大于9.2％，日內(nèi)精密度均不大于11.7％。如表1所示，準(zhǔn)確度在0.3～9.6％范圍內(nèi)。各成分其余濃度qc樣品日內(nèi)精密度均不大于9.2％，日間精密度均不大于8.3％，同樣如表1所示準(zhǔn)確度在.7～2.7％范圍內(nèi)。

表1人血漿中at、o-oat、p-oat精密度和準(zhǔn)確度的測定

【處理回收率】

lqc、mqc和hqc濃度水平：at的提取回收率分別為81.1％、94.0％和88.7％；o-oat的提取回收率分別為85.8％、89.0％和85.6％；p-oat的提取回收率分別為95.7％、89.9％和102％。d5-at、d5-o-oat和d5-p-oat的回收率分別為89.4％、87.7％和94.9％。

【基質(zhì)效應(yīng)】

lqc、hqc濃度水平下at的基質(zhì)因子分別為100％和94.1％，rsd分別為4.0％和4.7％；d5-at的基質(zhì)因子為99.7％，rsd為3.8％；o-oat基質(zhì)因子分別為101％和93.0％，rsd分別為4.8％和7.3％；d5-o-oat的基質(zhì)因子為99.5％，rsd為4.3％；p-oat基質(zhì)因子分別為95.3％和94.4％，rsd為4.3％和4.6％；d5-p-oat的基質(zhì)因子為104％，rsd為4.3％。以上結(jié)果表明，基質(zhì)不干擾待測物定量分析。

【血漿穩(wěn)定性考察】

如表2所示，為血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果。at血漿樣品穩(wěn)定性樣品測定濃度的rsd范圍為0.6～6.7％，re為2.0～8.8％之間。o-oat血漿樣品穩(wěn)定性樣品測定濃度的rsd范圍為1.0～9.0％，re為4.5～8.9％之間。p-oat血漿樣品穩(wěn)定性樣品測定濃度的rsd范圍為2.0～8.9％，re為8.2～9.8％之間。結(jié)果表明在上述條件下at、o-oat和p-oat均穩(wěn)定。

表2at、o-oat、和p-oat在人血漿中的穩(wěn)定性(n＝3)

3.2lac和car型相互轉(zhuǎn)化考察

溫度、ph的影響：本發(fā)明考察了at及代謝物的car和lac型化合物在不同溫度、ph環(huán)境中的相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示在室溫放置條件下血漿中l(wèi)ac型容易轉(zhuǎn)化為car型。通過降低血漿溫度(4℃)或者調(diào)節(jié)ph低于6的方法，可以抑制轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

吹干方法的影響：盡管已有報(bào)道使用吹干的方法濃縮樣品，但目前為止，未見文獻(xiàn)考察該過程對待測物穩(wěn)定性的影響。本研究中，我們考察了吹干過程對相互轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果見表3，所示吹干前與吹干后的測定值偏差在-7.7～13.1％范圍內(nèi)。吹干過程不影響car型待測物測濃度測定。

表3混合血漿樣品經(jīng)吹干與不吹干處理后各待測物測定濃度對比

提取物復(fù)溶解及進(jìn)樣過程的影響：本發(fā)明考察了提取物復(fù)溶解后置于進(jìn)樣器內(nèi)(4℃)是否發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化。結(jié)果同樣如表3所示，放置24h以后重新測定值于原值之間變異在-6.3％～10.7％范圍內(nèi)，見表4。因此，盡管未將復(fù)溶劑的ph調(diào)節(jié)至低于6，lac型沒有水解開環(huán)生成car型代謝物。

表4混合血漿樣品經(jīng)吹干與不吹干處理后各待測物測定濃度對比

4人體生物等效性研究

提供檢測人血漿中阿托伐他汀及代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法在評價(jià)阿托伐他汀生物等效性的應(yīng)用，是以d5-阿托伐他汀為分析檢測阿托伐他汀的內(nèi)標(biāo)物。將驗(yàn)證后的方法用于同時(shí)定量檢測血漿中at、o-oat和p-oat，以評價(jià)阿托伐他汀鈣片的生物等效性。24名健康受試者單次口服10mg受試制劑阿托伐他汀鈣(中國某制藥公司)或者參比制劑(美國pfizer公司)。平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線見圖17。采用winnonlin軟件(美國pharsight公司)非房室模型計(jì)算的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)cmax、auc(0–t)、auc(0–∞)、tmax和t1/2。在90％置信區(qū)間內(nèi)，cmax和auc(0–∞)比值在0.80～1.25范圍內(nèi)，表明兩種藥物生物等效(數(shù)據(jù)未給出)。