本發(fā)明涉及一種基于手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)檢測和監(jiān)測生物或環(huán)境樣品中(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，屬于農(nóng)藥分析和農(nóng)殘檢測/監(jiān)測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
據(jù)統(tǒng)計，至2015年，世界上農(nóng)藥有25％是手性分子，絕大多數(shù)以外消旋體形式出售和使用，而單一異構(gòu)體只占7％。由于酶、蛋白質(zhì)、離子通道等受體的不對稱環(huán)境，手性農(nóng)藥與受體的結(jié)合具有立體選擇性；其被生物吸收后，代謝、轉(zhuǎn)化、排泄等過程往往也是選擇性的。在多數(shù)情況下，對映體中的一種異構(gòu)體對目標生物體具有殺蟲或殺菌活性，或者對非目標生物體毒性較大，而另一種卻不具備藥效或藥效很低。因此通過非手性分析得到的外消旋農(nóng)藥的總濃度所指示的可能與實際生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)并不相符。只有在對映異構(gòu)體水平上研究手性農(nóng)藥的毒性問題、環(huán)境問題，才能準確評價人體健康和生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險性。
惡唑酰草胺(metamifop,cas:256412-89-2)是芳氧苯氧丙酸酯類除草劑，屬acc酶抑制劑。該藥物有一個手性中心，兩個光學(xué)異構(gòu)體，即(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺，現(xiàn)有的毒理、環(huán)境影響和生物體內(nèi)代謝研究，都沒有涉及到惡唑酰草胺的手性中心。介于“海豹嬰兒”事件的影響，深入和細致的研究手性化合物不同異構(gòu)體在生物體內(nèi)的不同是非常必要和必須的；同時環(huán)境因素也有可能導(dǎo)致光學(xué)異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的農(nóng)藥污染問題。
hplc-pda或hplc-ms等方法常用于惡唑酰草胺環(huán)境中濃度檢測，但該方法只能檢測惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體的總濃度，無法分別檢測(r)和(s)-惡唑酰草胺。而上個世紀的“海豹嬰兒”悲劇，使得人們逐漸認識到，無論是手性藥物還是農(nóng)藥，其不同對映異構(gòu)體在生物體內(nèi)的差異是非常巨大。因此，同時建立(r)和(s)-惡唑酰草胺生物和環(huán)境中藥物濃度的分析方法是非常必要的。
反相手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合了手性色譜柱對光學(xué)異構(gòu)體的分離能力和質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)的高靈敏度，可以較好的解決手性藥物的光學(xué)異構(gòu)體的檢測問題。然而，針對不同的分離對象，需要對進樣量、柱溫、洗脫劑(即流動相)、流速、母離子/子離子選擇、碰撞能量、錐孔電壓等大量條件和參數(shù)進行優(yōu)化和篩選，既要保證光學(xué)異構(gòu)體的分離，還要達到生物或環(huán)境體內(nèi)微量或痕量藥物的檢測，難度極大。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測生物體內(nèi)和環(huán)境中惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，特別適合在手性農(nóng)藥惡唑酰草胺的生物體內(nèi)殘留或環(huán)境殘留的檢測/監(jiān)測中應(yīng)用。
為達到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
1)樣品的準備：將生物樣品或生物樣品的勻漿液與乙腈混合以沉淀蛋白，通過離心分離沉淀，將離心所得上清液吹干，得到待分析樣品；或用乙腈直接提取環(huán)境樣品中的惡唑酰草胺后離心,將離心所得上清液吹干，得到待分析樣品；
2)確定手性色譜分離條件：根據(jù)(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的分離度≥1.5的要求，手性高效液相色譜分離中采用的流動相為甲醇或乙腈與水、易揮發(fā)性緩沖鹽以及易揮發(fā)性酸的混合溶液，混合溶液中所述緩沖鹽的濃度為1-10mm，所述酸的體積分數(shù)為0.01-0.5％，甲醇或乙腈與水的體積比為1～9:1；柱溫為5-50℃；進樣量為1-10μl；流動相流速為0.3-0.8ml/min，等度洗脫；
3)確定質(zhì)譜/質(zhì)譜工作條件：采用三重四級桿質(zhì)譜以及多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式；母離子和子離子分別為441.09和318.05；錐孔電壓為20-35v；碰撞能量為15-40ev；
4)光學(xué)異構(gòu)體含量測定：對待分析樣品進行手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析，然后采用外標法計算樣品中的(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的含量。
所述生物樣品為血漿、體液、組織液或生物組織(如肝臟、腎臟、心臟、胰臟、大腦等)。
所述環(huán)境樣品為土壤、水、農(nóng)作物或其他可能污染的樣品。
所述步驟1)中，沉淀蛋白所用乙腈的體積為生物樣品體積的至少4倍。
所述手性高效液相色譜采用反相涂敷型或鍵合型手性色譜柱，手性填料包括多糖衍生物類填料。
所述緩沖鹽包括甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨或碳酸氫銨，所述酸包括甲酸、乙酸或三氟乙酸。
所述質(zhì)譜/質(zhì)譜的工作條件還包括：駐留時間為0.15-0.17s；esi離子源溫度為120-150℃；干燥氣的溫度為280-300℃，干燥氣的流速為600-900l/h；毛細管電壓為2.5-3.5kv。
所述外標法(即配制(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的標準溶液，制作標準曲線，利用標準曲線計算待分析樣品中的(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的含量)采用的標準曲線的范圍為0.1-150ng/ml。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
1)光學(xué)異構(gòu)體的分析靈敏度高、檢出限低。現(xiàn)有的手性hplc方法，靈敏度較差，其最低檢出限為μg/ml，很難實現(xiàn)生物體內(nèi)或環(huán)境中微量和痕量樣品的分析；本發(fā)明中采用三重四級桿中的mrm掃描模式，在保證光學(xué)異構(gòu)體分離的同時，極大的提高了靈敏度，最低檢出限為0.2ng/ml，可以滿足生物或環(huán)境樣品檢測的需要。
2)可同時實現(xiàn)(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的檢測。對于生物或環(huán)境樣品中藥物濃度的檢測，現(xiàn)有方法無法對惡唑酰草胺的光學(xué)異構(gòu)體進行分離測定，只能得到一個總的外消旋惡唑酰草胺的總濃度，不能檢測各個光學(xué)異構(gòu)體的濃度；本發(fā)明通過大量實驗對手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜的條件進行優(yōu)化，確定了母離子和子離子以及錐孔電壓、洗脫流速、干燥氣溫度等關(guān)鍵參數(shù)，在保證高靈敏度的同時，首次實現(xiàn)了同時檢測(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺，為惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體的體內(nèi)/環(huán)境檢測提供了技術(shù)支持，為研究手性農(nóng)藥體內(nèi)/環(huán)境轉(zhuǎn)化提供了新的思路。
3)可實現(xiàn)自動化的檢測，符合農(nóng)藥殘留檢測中大樣本量的需要：本發(fā)明利用hplc的自動進樣功能、可實現(xiàn)無人值守；極大的節(jié)省了人力物力，滿足多樣品、大數(shù)據(jù)處理的需要。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1血漿中外消旋惡唑酰草胺的濃度檢測
以外消旋惡唑酰草胺為例，但本發(fā)明的保護范圍不局限于該實驗，具體步驟如下：具體步驟包括：1)樣品的準備；2)確定手性色譜分離條件；3)確定質(zhì)譜條件；4)光學(xué)異構(gòu)體含量測定。
一、樣品準備
取已注射外消旋惡唑酰草胺的sd大鼠血漿100μl(采血時間點1.5h)，加入400μl乙腈，旋混30s后，12500轉(zhuǎn)離心10min，取上清液室溫下液氮氣吹干，得待分析樣品，-80℃凍存；
二、確定手性色譜分離條件
上述樣品加入50μl的流動相中復(fù)溶，采用waterstqdxevo分析(r)和(s)-惡唑酰草胺，條件如下；
色譜柱：大賽璐
色譜條件：
①自動進樣，體積5μl；
②流動相是乙腈:水＝90:10(體積比)的混合溶劑(含體積分數(shù)0.1％的甲酸和10mm的甲酸銨)，流速為0.3ml/min，等度洗脫；
③柱溫箱溫度為25℃；
該條件下(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的保留時間分別為：18.22和19.92min，分離度為1.8。
三、確定質(zhì)譜條件
采用waterstqd的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式(mrm)，條件如下：
母離子和子離子分別為441.09和318.05；
錐孔電壓為20v；
碰撞能量為40ev；
駐留時間為0.161s；
esi離子源溫度為150℃；
n2(干燥氣)的溫度及流速為300℃和900l/h；
毛細管電壓3.5kv。
四、光學(xué)異構(gòu)體含量測定
數(shù)據(jù)采集和處理采用masslynxsoftware(version4.1)，定量計算采用targetlynxtmsoftware。
配制外消旋惡唑酰草胺的標準溶液(體積分數(shù)50％乙腈的水溶液)，濃度分別為：0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml，80ng/ml，150ng/ml；上述標準溶液樣品與待分析樣品采用本實施例中的色譜和質(zhì)譜條件分析，targetlynxtmsoftware自動計算待測樣品中(r)-和(s)-惡唑酰草胺的含量。
該實施例中，(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的血藥濃度分別為26.55ng/ml和29.39ng/ml；(r)和(s)異構(gòu)體間存在吸收、分布和代謝的差異。
實施例2尿液中(r)-惡唑酰草胺的濃度檢測
除以下條件外，其他條件與實施例1相同：
①取已注射(r)-惡唑酰草胺的sd大鼠尿液100μl(24h的總尿液)；
②色譜柱：大賽璐
③流動相是甲醇:水＝90:10(體積比)的混合溶劑(含體積分數(shù)0.5％的乙酸和1mm的乙酸銨)，流速為0.8ml/min，等度洗脫；
④自動進樣，體積10μl；
⑤柱溫箱溫度為40℃；
⑥錐孔電壓為35v；
⑦碰撞能量為15ev。
該實施例中，(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的保留時間分別為：9.49和10.98min；其尿藥濃度分別為5.18ng/ml和0.66ng/ml；(r)-異構(gòu)體在大鼠體內(nèi)能夠部分轉(zhuǎn)化為(s)-異構(gòu)體。
實施例3肝臟中(s)-惡唑酰草胺的濃度檢測
除以下條件外，其他條件與實施例1相同：
①取已注射(s)-惡唑酰草胺的sd大鼠肝臟0.1g(給藥后12小時斷頸處死，迅速解剖取出肝臟)，加入pbs緩沖溶液0.5ml，4℃勻漿，離心后取上清液(勻漿液)100μl；向上述勻漿液中加入400μl乙腈，旋混30s后，12500轉(zhuǎn)/分離心5min，取上清液室溫下氮氣吹干，得待分析樣品；
②色譜柱：大賽璐
③流動相是乙腈:水＝70:30(體積比)的混合溶劑(含體積分數(shù)0.5％的三氟乙酸和5mm的碳酸氫銨)，流速為0.4ml/min，等度洗脫；
④自動進樣，體積1μl；
⑤柱溫箱溫度為50℃；
⑥錐孔電壓為30v；
⑦碰撞能量為30ev。
該實施例中，(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的保留時間分別為：14.28和15.65min；其肝臟藥物濃度分別為8.55ng/ml和65.58ng/ml；(s)-異構(gòu)體在大鼠肝臟中能夠部分轉(zhuǎn)化為(r)-異構(gòu)體。
實施例4土壤中(r)-惡唑酰草胺的檢測
除以下條件外，其他條件與實施例1相同：
①取已噴灑(r)-惡唑酰草胺(20克/畝)48小時后的土壤樣品0.1g，加入pbs緩沖溶液0.5ml和乙腈1.2ml，旋混30s，離心后取上清液1ml，n2吹干，20μl流動相復(fù)溶；
②色譜柱：大賽璐
③流動相是乙腈:水＝50:50(體積比)的混合溶劑(含體積分數(shù)0.2％的三氟乙酸和10mm的碳酸氫銨)，流速為0.8ml/min，等度洗脫；
④自動進樣，體積10μl；
⑤柱溫箱溫度為5℃；
⑥碰撞能量為15ev。
該實施例中，(r)-惡唑酰草胺和(s)-惡唑酰草胺的保留時間分別為：8.44和9.95min；其環(huán)境殘留濃度分別為3.89ng/ml和0.22ng/ml；存在環(huán)境中手性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。
本發(fā)明所針對的是惡唑酰草胺的光學(xué)純異構(gòu)體的檢測，不同來源的生物或環(huán)境樣品，受樣品中其他物質(zhì)的干擾，其色譜分離條件、質(zhì)譜檢測參數(shù)等均不相同，據(jù)此得出本發(fā)明中的條件范圍。
本發(fā)明選擇反相手性高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜技術(shù)定量檢測惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體含量的方法，是為了解決在實際科研、農(nóng)殘監(jiān)測中惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體的檢測/監(jiān)測所存在的問題，為惡唑酰草胺光學(xué)異構(gòu)體在生物體內(nèi)和環(huán)境中的轉(zhuǎn)化和檢測提供了一條新的思路和方法。