本發(fā)明涉及用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的微流體系統(tǒng)，具體為一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基于硅納米線基底的微流體系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

隨著污染程度的增加，腫瘤的患病幾率已經(jīng)高于1/3的比例。對(duì)于腫瘤的診斷方法主要包括：病理學(xué)(活檢切片)；影像學(xué)(超聲、x光、ct或pet等)和血清學(xué)(血清腫瘤相關(guān)蛋白，如ca-125、ca-199或cea等)。然而這些方法對(duì)存在自身的缺陷，不能為不斷變化腫瘤和診斷預(yù)警提供幫助。目前臨床公認(rèn)的人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell，簡(jiǎn)稱(chēng)ctc)檢測(cè)目前已被公認(rèn)為最好檢測(cè)手段之一。

在2004年，美國(guó)藥品與食品監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)通過(guò)了第一個(gè)有關(guān)ctc富集和計(jì)數(shù)的技術(shù)產(chǎn)品。這一產(chǎn)品是利用細(xì)胞表面所表達(dá)的上皮細(xì)胞粘附分子(epcam)與干細(xì)胞因子受體(ckit)來(lái)完成細(xì)胞的分選的。epcam在絕大多數(shù)的上皮細(xì)胞上多有表達(dá)，因此在來(lái)源于上皮細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞中也有表達(dá)。c-kit是典型的ⅲ型受體酪氨酸激酶,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲、遷移和復(fù)發(fā)過(guò)程中起著十分重要的作用,是目前腫瘤分子靶向治療的熱門(mén)靶標(biāo)之一。修飾有anti-epcam或anti-ckit的磁珠與固化的血液細(xì)胞相互作用，這樣一來(lái)所有表達(dá)epcam或ckit的細(xì)胞表面都會(huì)附著一些磁珠，最后再通過(guò)磁場(chǎng)進(jìn)行分選。要進(jìn)一步識(shí)別雙陽(yáng)性ctc,所有被捕獲的細(xì)胞會(huì)首先從磁珠上解離下來(lái)，然后用細(xì)胞角蛋白krt19以及白細(xì)胞抗原(cd45)的熒光抗體進(jìn)行標(biāo)記。在這一系統(tǒng)中，對(duì)于ctc的技術(shù)定義是epcam+/ckit+/cd45-有細(xì)胞核的物體。該設(shè)備和方法已被作為一個(gè)嵌入式生物標(biāo)志物應(yīng)用在幾個(gè)治療相關(guān)的臨床試驗(yàn)中。首個(gè)有關(guān)ctc計(jì)數(shù)檢測(cè)的大規(guī)模臨床試驗(yàn)是于2004年進(jìn)行的，主要針對(duì)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人。這次試驗(yàn)所得出的治療前和治療期間的ctc檢測(cè)結(jié)果同時(shí)預(yù)測(cè)了無(wú)進(jìn)展生存期(pfs)和總生存期(os)。很短的時(shí)間內(nèi)，在多種不同的癌癥研究中也進(jìn)行了類(lèi)似的ctc計(jì)數(shù)測(cè)試，其中就包括腸癌、皮膚癌、肺癌和前列腺癌，并且得出了類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，這些研究大多將ctc計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果分為兩類(lèi)：定性的作為(對(duì)于評(píng)價(jià)病人病情)有利或者不利，而不是把他們作為一個(gè)可連續(xù)變化的定量數(shù)據(jù)。

目前ctc技術(shù)的局限性所帶來(lái)的各種問(wèn)題。首先，在ctc研究中檢測(cè)靈敏度還是至關(guān)重要的影響因素。fda批準(zhǔn)通過(guò)的ctc技術(shù)在50％的食管鱗狀細(xì)胞癌病人中都無(wú)法檢測(cè)出ctc。其次，基于epcam單獨(dú)抗體的ctc富集技術(shù)會(huì)無(wú)法檢測(cè)出正在發(fā)生上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。早期的ctc研究已經(jīng)證明有些病人的ctc具有間質(zhì)化特征，所以通常認(rèn)為上皮間質(zhì)化現(xiàn)象在ctc的產(chǎn)生過(guò)程中起著非常重要的作用。第三，僅僅對(duì)ctc進(jìn)行計(jì)數(shù)，忽視了ctc中亞群的重要意義。在最近的研究中顯示，一些ctc所具有的特異形貌特征和剪接變異體的表達(dá)與腫瘤內(nèi)臟轉(zhuǎn)移和癌癥抗藥性有關(guān)聯(lián)。這些發(fā)現(xiàn)都指出ctc作為腫瘤標(biāo)志物，不僅僅用來(lái)做計(jì)數(shù)。第四，將血液樣品先固定化再進(jìn)行檢測(cè)的方法會(huì)限制分離ctc后下游的分子分析研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)ctc檢測(cè)時(shí)純度和靈敏度不夠高，同時(shí)捕獲的ctc不能繼續(xù)用于后序研究的缺陷，提供一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的基于硅納米線基底的微流體系統(tǒng)。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)，采用以下步驟制備：

一、pdms微流體芯片的制作

pdms微流體管道系統(tǒng)包括一個(gè)入口和一個(gè)出口，從入口處分為2條以上平行的微流體信道，微流體信道內(nèi)設(shè)置有若干個(gè)魚(yú)骨結(jié)構(gòu)；優(yōu)選的魚(yú)骨結(jié)構(gòu)為由pdms打印成的若干個(gè)v形槽，單個(gè)魚(yú)骨結(jié)構(gòu)內(nèi)v形槽相互平行，相鄰的魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的v形槽的頂角上下交錯(cuò)；在入口和出口處均設(shè)置有pdms孔洞；

優(yōu)選的所述pdms微流體管道系統(tǒng)從入口處分為2條平行的微流體信道，各信道長(zhǎng)為25mm，寬位2mm；所述微流體信道內(nèi)魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的寬為50微米，間距50微米，高30微米。這種魚(yú)骨結(jié)構(gòu)增加了細(xì)胞捕捉效率，而且可以在流道內(nèi)產(chǎn)生明顯的渦流，可以批量低成本生產(chǎn)。

優(yōu)選的，所述pdms微流體管道的各分流處設(shè)置有圓角，一方面增加樣本導(dǎo)流，另一方面減低細(xì)胞因剪切力造成的傷害。在進(jìn)入信道0.5mm處才開(kāi)始產(chǎn)生由魚(yú)骨結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的渦流效應(yīng)，魚(yú)骨結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞溶液攪動(dòng)，增加細(xì)胞接觸硅納米線的機(jī)會(huì)；

pdms微流體管道系統(tǒng)采用單進(jìn)單出的設(shè)計(jì)，以及較大的流道設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了高通量ctc純化方法，與傳統(tǒng)方法相比，可減少一半的操做時(shí)間，而且搭配分析軟件后可以用作影像分析。

二、硅納米線基底的刻蝕

1)、在硅片上旋轉(zhuǎn)涂覆su-8光阻膠，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)光刻方法限定刻蝕區(qū)域，僅刻蝕平行的微流體信道需要覆蓋的區(qū)域；優(yōu)選的，硅納米線基底的刻蝕時(shí)選用厚度為0.7毫米、長(zhǎng)為50毫米和寬為25毫米的硅片，鈉米線長(zhǎng)度為2～5微米。

2)、通過(guò)nh4f/agno3試劑引入ag納米顆粒沉積，在硅片表面形成鈉米粒子膜；優(yōu)選的，ag納米顆粒沉積小于等于50nm；優(yōu)選的，采用超聲波震蕩輔助ag納米顆粒的沉積；更能均勻的蝕刻出均勻的納米線，粗細(xì)均勻的納米線比較均勻、平整，提供了更好的細(xì)胞捕捉環(huán)境，有利于增加純化后細(xì)胞的存活率；

3)、采用h2o2/nh4f進(jìn)行刻蝕，得到與平行的微流體信道相對(duì)應(yīng)的鈉米線；

4)、先采用濃硝酸洗去ag納米顆粒，然后采用濃硫酸/雙氧水混合溶液清洗硅片表面，然后去離子水洗滌干凈；濃硫酸/雙氧水的體積比為3:1；

優(yōu)選的，硅納米線基底的刻蝕時(shí)選用厚度為0.7毫米、長(zhǎng)為50毫米和寬為25毫米的硅片，鈉米線長(zhǎng)度為2～5微米，最佳ctc捕獲效率鈉米線長(zhǎng)度3μm；

本發(fā)明的硅納米線基底的刻蝕，與傳統(tǒng)的硅納米線不同，沒(méi)有引入hf這種對(duì)環(huán)境和操作者具有非常大危害的試劑，在保護(hù)環(huán)境的同時(shí)可以將整個(gè)操作和制備過(guò)程在普通化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中完成，為后期產(chǎn)品生產(chǎn)提供容易的制作條件，同時(shí)確保了材料表面的生物安全性，更適合細(xì)胞捕捉之用。制作而成的硅納米線基底芯片可與病理載玻片搭配使用，可以用于熒光分析，也可以與標(biāo)準(zhǔn)的病理分析切片一樣儲(chǔ)存。

三、硅納米線的表面修飾和生物功能化

1)、用無(wú)水乙醇清洗硅納米線基底，超凈環(huán)境下n2氣吹干；

2)、新鮮制備的質(zhì)量濃度為1.0％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并將清洗干燥后的具有硅納米線的硅片浸泡在其中半小時(shí)；優(yōu)選的，可以使用轉(zhuǎn)速為60rpm的震蕩槽增加反應(yīng)速率；

3)、取出表面鍵合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅片，用工業(yè)級(jí)乙醇清洗，n2氣吹干；

4)、將硅片在新鮮制備的50ng/ml的聚乙二醇2-氨基乙基醚生物素pbs溶液中靜置3小時(shí)，以工業(yè)級(jí)乙醇清洗，n2氣吹干后保存在4℃干燥環(huán)境下備用；

5)、在樣品測(cè)試前，用pbs清洗芯片表面兩次后，加入200μl5.0μm鏈霉親和素溶液，37℃孵育1小時(shí)；pbs清洗后，再和含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)，以pbs清洗后用于ctc的捕獲；

本步驟通過(guò)安全的化學(xué)鍵和方法將硅納米線表面修飾上生物素，再通過(guò)鏈霉親和素的引入，進(jìn)一步將具有ctc識(shí)別功能的多肽分子修飾在其表面，便于后期專(zhuān)一性的細(xì)胞捕獲后的剪切與釋放；由于peg分子量為2300，可以用來(lái)減少非特異性吸附，peg的吸水能力可以明顯地避免細(xì)胞破裂造成的細(xì)胞死亡,增加在后續(xù)ctc的分子分析的可行性。

四、硅納米線基底的修飾和pdms微流體芯片的組裝

1)、制備5.0μm的鏈霉親和素pbs溶液200μl，覆蓋在pdms微流體芯片上，于37℃靜置1小時(shí)，pbs清洗三遍；pbs清洗后，再和含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)，以pbs清洗后用于ctc的捕獲；

2)、再將硅納米線基底的芯片放置到芯片載臺(tái)上，并將平行的微流體信道與鈉米線相對(duì)應(yīng)，再以載臺(tái)的上蓋壓住微流體芯片；

3)、將入口和出口處的pdms孔洞連接分別連接tygon流體輸送管，并和已經(jīng)安裝在注射泵上的注射器鏈接。

本發(fā)明的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)的使用方法，包括以下步驟：

1)、將待測(cè)樣本細(xì)胞與含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)，之后以1000rpm的離心方式分離出有生物素修飾p-epcam和p-ckit兩種多肽的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；p-epcam,p-ckit是兩種特異性高的多肽分子，無(wú)論是對(duì)人工樣品和血液樣品都具有較高的特異性；

2)、將細(xì)胞待測(cè)樣本通過(guò)注射器注射進(jìn)入微流體系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

本發(fā)明通過(guò)硅納米線基底的表面修飾和生物素功能修飾與pdms微流體管道系統(tǒng)相配合，待測(cè)樣本細(xì)胞采用有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽分子共孵后，可以識(shí)別和結(jié)合出含量極低的ctc，結(jié)合捕獲后的ctc被吸附在硅納米線表面，可以進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫熒光染色，得到檢出結(jié)果和表型分析結(jié)果，也可以進(jìn)一步釋放，實(shí)現(xiàn)ctc的純化，提高純度以適應(yīng)基因檢測(cè)限度的要求，適合用于分子診療和精準(zhǔn)醫(yī)療的要求，因?yàn)橛糜卺尫與tc的試劑主要針對(duì)的是與ctc結(jié)合的多肽分子，所以釋放具有特異性，最終收集的ctc樣品具有很高的純度，為后期的基因檢測(cè)提供可能。

附圖說(shuō)明

附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1是本發(fā)明實(shí)施例的pdms微流體管道系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是圖1中a處的放大結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是在pdms微流體管道系統(tǒng)的平行信道內(nèi)不設(shè)置魚(yú)骨結(jié)構(gòu)時(shí)細(xì)胞的流動(dòng)模擬圖；

圖4是在pdms微流體管道系統(tǒng)的平行信道內(nèi)設(shè)置魚(yú)骨結(jié)構(gòu)時(shí)細(xì)胞的流動(dòng)模擬圖；

圖5是在pdms微流體管道系統(tǒng)分流處設(shè)置圓角時(shí)的細(xì)胞流速模擬圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)，采用以下步驟制備：

一、pdms微流體芯片的制作

pdms微流體管道系統(tǒng)包括一個(gè)入口和一個(gè)出口，pdms微流體管道系統(tǒng)從入口處分為2條平行的微流體信道，各分流處設(shè)置有圓角，各信道長(zhǎng)為25mm，寬位2mm；所述微流體信道內(nèi)魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的寬為50微米，間距50微米，高30微米，如圖1所示，其中1為魚(yú)骨結(jié)構(gòu)，2為入口，3為出口，4為微流體信道。圖5顯示了分流處圓角設(shè)計(jì)對(duì)流速的影響。在圖5中，縱軸與橫軸都是流道大小，單位為毫米，右邊圖例顯示了流速的大小；從圖5中可知，圓角分流設(shè)計(jì)時(shí)，可以產(chǎn)生一層慢速層在圓角分流處，如圖圈選位置所示，該圓角分流處產(chǎn)生的慢速層可以有效的減少細(xì)胞在流動(dòng)時(shí)，因?yàn)樽矒舳a(chǎn)生的破壞，也因此提升了細(xì)胞的生物完整性。

魚(yú)骨結(jié)構(gòu)為由pdms打印成的若干個(gè)v形槽，單個(gè)魚(yú)骨結(jié)構(gòu)內(nèi)v形槽相互平行，相鄰的魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的v形槽的頂角上下交錯(cuò)，如圖2所示；在入口和出口處均設(shè)置有pdms孔洞；

在圖3和圖4中縱軸與橫軸都是流道大小，單位為毫米，右邊圖例顯示了流速的大小；由圖3和圖4可知，當(dāng)沒(méi)有魚(yú)骨結(jié)構(gòu)時(shí)，流體為穩(wěn)定的層流狀態(tài)，表示流體沒(méi)有受到擾動(dòng)，細(xì)胞也因而不會(huì)增加與底部的接觸機(jī)會(huì)；而設(shè)置了魚(yú)骨結(jié)構(gòu)后，流體有明顯的流速差異，以及產(chǎn)生許多擾亂流動(dòng)的現(xiàn)象。與沒(méi)有魚(yú)骨相比，流體內(nèi)的顆粒(或細(xì)胞)在這個(gè)流動(dòng)的情況下，與底下面積接觸的機(jī)會(huì)增加了。

分別打印出微流體通道結(jié)構(gòu)和魚(yú)骨結(jié)構(gòu)的掩模板；

二、硅納米線基底的刻蝕

1)、選用厚度為0.7毫米、長(zhǎng)為50毫米和寬為25毫米的硅片，在硅片上旋轉(zhuǎn)涂覆su-8光阻膠，旋轉(zhuǎn)涂布轉(zhuǎn)速為3000rpm，利用流體信道掩模板光照通道結(jié)構(gòu)區(qū)域，成像后得到通道結(jié)構(gòu)；

2)、通過(guò)nh4f/agno3試劑引入小于等于50nm的ag納米顆粒沉積，在硅片表面形成鈉米粒子膜；

3)、采用h2o2/nh4f進(jìn)行刻蝕，得到與平行的微流體信道相對(duì)應(yīng)的鈉米線，鈉米線長(zhǎng)度為2～5微米；

4)、先采用濃硝酸洗去ag納米顆粒，然后采用濃硫酸/雙氧水混合溶液清洗硅片表面，然后去離子水洗滌干凈；濃硫酸/雙氧水的體積比為3:1；

三、硅納米線的表面修飾和生物功能化

1)、用無(wú)水乙醇清洗硅納米線基底，超凈環(huán)境下n2氣吹干；

2)、新鮮制備的質(zhì)量濃度為1.0％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，并將清洗干燥后的具有硅納米線的硅片浸泡在其中半小時(shí)；優(yōu)選的，可以使用轉(zhuǎn)速為60rpm的震蕩槽增加反應(yīng)速率；

3)、取出表面鍵合3-氨基丙基三乙氧基硅烷的硅片，用工業(yè)級(jí)乙醇清洗，n2氣吹干；

4)、將硅片在新鮮制備的50ng/ml的聚乙二醇2-氨基乙基醚生物素pbs溶液中靜置3小時(shí)，以工業(yè)級(jí)乙醇清洗，n2氣吹干后保存在4℃干燥環(huán)境下備用；

5)、在樣品測(cè)試前，用pbs清洗芯片表面兩次后，加入200μl的5.0μm鏈霉親和素溶液，37℃孵育1小時(shí)；pbs清洗后，再和含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)，清洗后用于ctc的捕獲；

四、硅納米線基底的修飾和pdms微流體芯片的組裝

1)、制備5.0μm的鏈霉親和素pbs溶液200μl，覆蓋在pdms微流體芯片上，于37℃靜置1小時(shí)，pbs清洗三遍；pbs清洗后，再和含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)，以pbs清洗后用于ctc的捕獲；

2)、再將硅納米線基底的芯片放置到芯片載臺(tái)上，并將平行的微流體信道與鈉米線相對(duì)應(yīng)，再以載臺(tái)的上蓋壓住微流體芯片；

3)、將入口和出口處的pdms孔洞連接分別連接tygon流體輸送管，并和已經(jīng)安裝在注射泵上的注射器鏈接。

本發(fā)明的檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的微流體系統(tǒng)的使用方法，包括以下步驟：

1)、將待測(cè)樣本細(xì)胞與含有生物素修飾的p-epcam和p-ckit兩種多肽的200μlpbs溶液共孵育1小時(shí)；之后以1000rpm的離心方式分離出有生物素修飾p-epcam和p-ckit兩種多肽的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)；

2)、將200μl模擬樣品裝入1ml注射器中，連接好注射系統(tǒng)；

3)、注射完畢后，在注射器中裝載100μl濃度為1％的pfa(多聚甲醛)溶液，以流速1.0ml/h流經(jīng)芯片組，對(duì)捕獲的細(xì)胞進(jìn)行固定；

4)、拆裝芯片組后，取出硅納米線基底載玻片；

5)、pbs清洗后，將制備的一抗：5μm細(xì)胞角蛋白抗體anti-krt19和5μmcd45抗體(anti-cd45)混合溶液200μl覆蓋在硅納米線區(qū)域，4℃下，靜置8小時(shí)；

6)、之后清洗，并標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行二抗的染色。對(duì)應(yīng)ck抗體為alex488標(biāo)記，對(duì)應(yīng)cd45抗體為alex555標(biāo)記，二抗染色為室溫下40分鐘；

7)、以pbs清洗二次后，盡量吸取除去表面的溶液殘留，并用含有hoechest(dapi)染核試劑的封固液60μl封裝，加蓋蓋玻片；

8)、進(jìn)行熒光成像并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

9)、將成像結(jié)果中krt19+/cd45-/dapi+的細(xì)胞計(jì)數(shù)為捕獲的癌細(xì)胞，通過(guò)對(duì)比起始加入的癌細(xì)胞數(shù)目200顆，計(jì)算得出相應(yīng)的捕獲效率。

干擾實(shí)驗(yàn)

提取健康人血液中的白細(xì)胞作為干擾細(xì)胞2.0×10⁶/ml，制備模擬樣品，并比較了對(duì)于不同類(lèi)型的癌細(xì)胞(kyse-30,kyse-150和kyse-180)的捕獲能力，證明與實(shí)際血液中白細(xì)胞等量的干擾，不會(huì)影響檢測(cè)的效率。

癌癥患者血液樣本應(yīng)用舉例

一、用bdvacutainerglassacdsolutionatube采集腫瘤患者外周血，分兩次收集(以避免edta抗凝對(duì)于血液中細(xì)胞表面的抗原損傷，導(dǎo)致影響捕獲抗體的結(jié)合，降低捕獲效率)

采血的第一管只抽取2ml，并不用來(lái)進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)榇嬖谘褐写嬖卺橆^刺入時(shí)脫落的上皮細(xì)胞，出現(xiàn)假陽(yáng)性細(xì)胞讀出。第二管抽取4ml用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

二、采取梯度密度離心對(duì)收集的第二管血液樣本進(jìn)行初步純化

(a)加入4mlpbs溶液，對(duì)于血樣進(jìn)行等體積稀釋

(b)混合均勻后，在已經(jīng)加入4ml梯度密度離心液(1077)的15ml離心管中緩慢加入稀釋后的血液樣品。

(c)采用300g，40分鐘進(jìn)行離心。

(d)離心結(jié)束后收取約2-4ml的單核細(xì)胞層(pbmc，peripheralbloodmononuclearcell)。

(e)對(duì)收取的單核細(xì)胞層進(jìn)行離心，400g，5分鐘，去除上層清液

(f)用2mlpbs進(jìn)行清洗。

(g)離心去除上層清液后，加入新鮮制備的5μm細(xì)胞角蛋白抗體19(anti-krt19)和5μmcd45抗體(anti-cd45)混合溶液400μl，打散細(xì)胞聚集，37℃下共孵育45分鐘。

(h)清洗，并定容在400μlpbs中，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

結(jié)果：

在收集和研究的9個(gè)樣本中(6個(gè)食管鱗狀細(xì)胞癌病人和3個(gè)健康人)，收集了ctc的細(xì)胞懸浮液。在中和、清洗之后，ctc細(xì)胞沉積(cellpellet)使用全基因組擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行dna提取和擴(kuò)增。之后，針對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志性基因pik3ca進(jìn)行了擴(kuò)增和sanger測(cè)序。結(jié)果pik3ca亞型在6個(gè)食管鱗狀細(xì)胞癌患者中都有檢出，而3個(gè)健康人樣本中沒(méi)有檢出。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。