本發(fā)明涉及蝦青素組合物抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

蝦青素(astaxanthin,3,3′-二羥基-4,4′-二酮-β,β′-胡蘿卜素)，又名蝦黃質(zhì)、龍蝦殼色素，是一種動(dòng)物界中分布最廣泛的脂溶性類胡蘿卜素。蝦青素不溶于水，是迄今自然界中發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的氧化劑，其抗氧化能力比β胡蘿卜素高10倍以上，比維生素e高550倍以上。蝦青素還具有很強(qiáng)的抑制腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫功能、抵御紫外線傷害等多種生理功效，因而廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、保健品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。蝦青素與其它抗氧化劑如生物黃酮等的組合可以充分發(fā)揮蝦青素與其它抗氧化劑的協(xié)同抗氧化作用，明顯增加蝦青素的活性，已萬(wàn)為蝦青素產(chǎn)品研發(fā)的重點(diǎn)，但由于蝦青素是脂溶性，而多數(shù)抗氧化劑是水溶性或醇溶性，很難找到這類溶解特征不同的抗氧化劑組合物的評(píng)價(jià)體系，制約了蝦青素組合物的篩選。

脂質(zhì)過氧化作用是指在氧化條件下多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)的氧化變質(zhì)，這種作用對(duì)細(xì)胞膜、脂蛋白以及其他含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，包括細(xì)胞膜流動(dòng)性以及滲透性的改變、dna以及蛋白質(zhì)的損傷，進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能。許多重大疾病，如腫瘤發(fā)生、心腦血管、糖尿病、及衰老等都涉及自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用，因此，尋找篩選脂質(zhì)過氧化作用抑制劑具有重要意義。目前脂質(zhì)過氧化抑制劑的評(píng)價(jià)方法有體外和體內(nèi)的方法，體內(nèi)方法需要進(jìn)行大量動(dòng)物試驗(yàn)，成本高周期長(zhǎng)，體外試驗(yàn)方琳基于水溶液自由基與細(xì)胞生物膜或者卵磷脂囊泡的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，通過檢測(cè)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物如丙二醛(mba)類似物實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化抑制活性的評(píng)價(jià)。

蝦青素具有明顯的脂質(zhì)過氧化抑制活性，但目前的數(shù)據(jù)多是動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果，原因在于蝦青素具有明顯疏水性，在已有的水溶液自由基體系中，很難均勻、快速和穩(wěn)定的參與抑制自由基對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)的過氧化作用，因此，難于準(zhǔn)確、可靠評(píng)介蝦青素組合物的抑制脂質(zhì)過氧化能力。

綜上所述，發(fā)展穩(wěn)定準(zhǔn)確的水溶液自由基體系中，蝦青素與其它溶解特征不同的抗氧化劑組合物的脂質(zhì)過氧化評(píng)價(jià)方法，對(duì)于蝦青素研究和蝦青素制劑的開發(fā)具有重要價(jià)值，對(duì)于其它溶解特征不同的的抗氧化劑組合研究亦具有重要應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種蝦青素組合物抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定方法，本測(cè)定方法能夠準(zhǔn)確、可靠的評(píng)介溶解特征不同的蝦青素組合物的抑制脂質(zhì)過氧化能力，克服前述已有的脂質(zhì)過氧化反體系，無(wú)確定的計(jì)量關(guān)系，無(wú)法用于準(zhǔn)確、可靠評(píng)介溶解特征不同的蝦青素組合物抑制脂質(zhì)過氧化能力的問題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種蝦青素組合物抗脂質(zhì)過氧化活性的測(cè)定方法，所述測(cè)定方法包括：

(1)將蝦青素組合物、10.0mg/ml蛋黃卵磷脂、5.0mg/ml膽固醇混合于和環(huán)己烷，超聲至溶液澄清，得到成膜溶液；

(2)將所述20～50μl成膜溶液滴涂于載體上，干燥后得到蝦青素-雙層磷脂膜薄層；

(3)將含有蝦青素組合物-雙層磷脂膜薄層的載體浸入自由基發(fā)生溶液體系中反應(yīng)，之后取出；其中，所述自由基發(fā)生體系溶液由0.45-0.55ml濃度為75mmol/l的fe²⁺-edta、0.45-0.55ml濃度為150mmol/l的h2o2溶液和1.45-1.55ml濃度為0.75mol/l的pbs緩沖溶液組成；

(4)在上述自由基發(fā)生體系溶液中加入0.9-1.1ml1％硫代巴比妥酸(tba)溶液，水浴后將其在533nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定；

(5)根據(jù)步驟(4)所測(cè)過得的吸光度值計(jì)算脂質(zhì)過氧化抑制率，式中，a0為空白樣吸光度值，a樣為樣品的吸光度值。

優(yōu)選地，所述載體為直徑8mm長(zhǎng)6cm光譜純石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光膠封裝。

優(yōu)選地，所述載體在使用前需用砂紙打磨至光亮，并用乙醇和清水超聲清洗、吹干。

優(yōu)選地，步驟(3)中反應(yīng)的溫度為36-38℃，反應(yīng)的時(shí)間為10-30min。

優(yōu)選地，步驟(4)中水浴的溫度為85-88℃，水浴的時(shí)間為18-22min。

優(yōu)選地，所述pbs緩沖溶液的ph值為7.3-7.5。

有益效果：本發(fā)明提供了一種蝦青素組合物脂質(zhì)抗氧化活性的測(cè)定方法，克服前述已有的溶解特征不同的蝦青素組合物的水溶液自由基脂質(zhì)過氧化反體系，無(wú)確定的計(jì)量關(guān)系，無(wú)法用于準(zhǔn)確、可靠評(píng)介蝦青素組合物抑制脂質(zhì)過氧化能力的問題；同時(shí)，利用卵磷脂的助溶解作用，將溶解特征不同的蝦青素與其它抗氧化劑均勻分散于雙層磷脂膜中并形成良好反應(yīng)性薄層，與已報(bào)道的自由基水溶液發(fā)生體系、與脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物分光光法檢測(cè)體系具有良好的適配性。本發(fā)明所述技術(shù)方案易于實(shí)現(xiàn)，可靠性好，實(shí)現(xiàn)了溶解特征不同的蝦青素組合物抑制脂質(zhì)過氧化能力的測(cè)定，抑制脂質(zhì)過氧化能力是抗氧劑最重要的活性指標(biāo)之一，本發(fā)明為高價(jià)值的蝦青素組合抗氧劑開發(fā)提供了技術(shù)支持。

具體施方式

下面詳細(xì)說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

實(shí)施例1

將1：2(w/w)蝦青素-蘆丁組合物、10.0mg/ml蛋黃卵磷脂、5.0mg/ml膽固醇混合于和環(huán)己烷，超聲至溶液澄清，得到成膜溶液；將所述成膜溶液滴涂于載體(載體為光譜純石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光膠封裝，載體在使用前需用砂紙打磨至光亮，并用乙醇和清水超聲清洗、吹干)上，干燥后得到蝦青素組合物-雙層磷脂膜薄層；將含有蝦青素組合物-雙層磷脂膜薄層的載體浸入自由基發(fā)生體系溶液中反應(yīng)(反應(yīng)的溫度為36℃，反應(yīng)的時(shí)間為10min)，之后取出；其中，所述自由基發(fā)生體系溶液由0.45ml濃度為75mmol/l的fe²⁺-edta、0.45ml濃度為150mmol/l的h2o2溶液和1.45ml濃度為0.75mol/l的pbs緩沖溶液組成；在上述自由基發(fā)生體系溶液中加入0.9ml1％tba溶液，水浴(水浴的溫度為85℃，水浴的時(shí)間為18min)后將其在533nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

實(shí)施例2

將1：2(w/w)蝦青素-維生素c組合物、10.0mg/ml蛋黃卵磷脂、5.0mg/ml膽固醇混合于和環(huán)己烷，超聲至溶液澄清，得到成膜溶液；將所述成膜溶液滴涂于載體(載體為光譜純石墨棒，并采用四氟乙烯管包裹，光膠封裝，載體在使用前需用砂紙打磨至光亮，并用乙醇和清水超聲清洗、吹干)上，干燥后得到蝦青素組合物-雙層磷脂膜薄層；將含有蝦青素組合物-雙層磷脂膜薄層的載體浸入自由基發(fā)生體系溶液中反應(yīng)(反應(yīng)的溫度為38℃，反應(yīng)的時(shí)間為30min)，之后取出；其中，所述自由基發(fā)生體系溶液由0.55ml濃度為75mmol/l的fe²⁺-edta、0.55ml濃度為150mmol/l的h2o2溶液和1.55ml濃度為0.75mol/l的pbs緩沖溶液組成；在上述自由基發(fā)生體系溶液中加入1.1ml1％tba溶液，水浴(水浴的溫度為88℃，水浴的時(shí)間為22min)后將其在533nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

對(duì)比例1

將1：2(w/w)蝦青素-蘆丁組合物、10.0mg/ml蛋黃卵磷脂、5.0mg/ml膽固醇混合于和水，超聲至完全分散，加入自由基發(fā)生體系溶液中反應(yīng)(反應(yīng)的溫度為30℃，反應(yīng)的時(shí)間為8min)，之后取出；其中，所述自由基發(fā)生體系溶液由0.4ml濃度為75mmol/l的fe²⁺-edta、0.4ml濃度為150mmol/l的h²o²溶液和1.4ml濃度為0.75mol/l的pbs緩沖溶液組成；在上述自由基發(fā)生體系溶液中加入0.7ml1％tba溶液，水浴(水浴的溫度為80℃，水浴的時(shí)間為15min)后用過濾頭吸取清液在533nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

對(duì)比例2

將1：2(w/w)蝦青素-維生素c組合物將蘆丁、10.0mg/ml蛋黃卵磷脂、5.0mg/ml膽固醇混合于和環(huán)己烷，超聲至完全分散，加入自由基發(fā)生體系溶液中反應(yīng)(反應(yīng)的溫度為30℃，反應(yīng)的時(shí)間為8min)，之后取出；其中，所述自由基發(fā)生體系溶液由0.4ml濃度為75mmol/l的fe²⁺-edta、0.4ml濃度為150mmol/l的h²o²溶液和1.4ml濃度為0.75mol/l的pbs緩沖溶液組成；在上述自由基發(fā)生體系溶液中加入0.7ml1％tba溶液，水浴(水浴的溫度為80℃，水浴的時(shí)間為15min)后用過濾頭吸取清液在533nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定。

測(cè)試?yán)?/p>

上述實(shí)施例1-2蝦青素組合物五次平行測(cè)定的最大脂質(zhì)過氧化抑制率平均值分別為77.2％的和74.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.4％和4.2％，對(duì)比例1、2中，相同用量的蝦青素組合物五次平行測(cè)定的最大脂質(zhì)過氧化抑制率平均值為42.4％和51.6％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為21.3％和17.5％，利用下述計(jì)算公式計(jì)算出實(shí)施例1-2和對(duì)比例1、2的脂質(zhì)過氧化抑制率。

計(jì)算公式：

式中，a0為空白樣吸光度值，a樣為樣品的吸光度值。

通過計(jì)算可以得到，實(shí)施例1的最大脂質(zhì)過氧化抑制率為77.2％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.4％，實(shí)施例2的最大脂質(zhì)過氧化抑制率為74.5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2％，相同用量，對(duì)比例1的脂質(zhì)過氧化抑制率為42.4％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為21.3％，對(duì)比例2的脂質(zhì)過氧化抑制率為51.6％；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為17.5％。通過上述數(shù)據(jù)可以看出，在本發(fā)明范圍內(nèi)得到的蝦青素組合物脂質(zhì)過氧化抑制率具有更好的代表性，且偏差較低，而本發(fā)明范圍外得到的蝦青素組合物脂質(zhì)過氧化抑制率代表性較差，且偏差明顯較高。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。