本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及rnag-四鏈體的檢測(cè)方法。更具體地，本發(fā)明涉及硫磺素t在制備試劑盒中的用途、確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法及用于檢測(cè)rnag-四鏈體的試劑盒。

背景技術(shù)：

rnag-四鏈體是由富含鳥嘌呤的rna序列形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的基本單元為三或四個(gè)鳥嘌呤堿基通過hoogsteen氫鍵形成的g-tetrad平面結(jié)構(gòu)，在一價(jià)陽離子(例如鉀離子或鈉離子)存在的情況下，通過多個(gè)g平面的堆積，形成獨(dú)特的平行結(jié)構(gòu)的g-四鏈體。在人類的轉(zhuǎn)錄基因的研究中發(fā)現(xiàn)，許多與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的基因(如nras、zic1、mt3-mmp、ncam2、bcl-2、trf2、fgf-2、vegf等)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mrna的5’-utr可形成大量的rnag-四鏈體結(jié)構(gòu)，研究表明這些rnag-四鏈體在蛋白質(zhì)的翻譯過程中有重要的調(diào)控作用。因此，準(zhǔn)確有效地檢測(cè)識(shí)別rnag-四鏈體結(jié)構(gòu)對(duì)于抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)以及惡性腫瘤的早期檢測(cè)都具有非常重要的意義。

然而，目前rnag-四鏈體的檢測(cè)方法仍有待改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人對(duì)下列問題和現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)而完成的：

目前，大多利用rnag-四鏈體的cd光譜特性及g-四鏈體的亞氨基氫nmr譜特性來檢測(cè)rnag-四鏈體的存在。但是，rnag-四鏈體和其他rna結(jié)構(gòu)的cd光譜，差異較小，難以簡(jiǎn)單區(qū)分。此外，nmr譜識(shí)別rnag-四鏈體需要足夠量的rnag-四鏈體，而rna序列價(jià)格昂貴、合成困難，大大提高了檢測(cè)成本。還有一些利用菁染料對(duì)rnag-四鏈體進(jìn)行識(shí)別檢測(cè)。但是，菁染料分子是一種未商業(yè)化的分子，進(jìn)而限制了其使用范圍。

基于此，發(fā)明人提出了利用硫磺素t檢測(cè)識(shí)別rnag-四鏈體的方法，該方法靈敏度高而且操作簡(jiǎn)便。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了硫磺素t在制備試劑盒中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒主要用于檢測(cè)rnag-四鏈體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，硫磺素t與rnag-四鏈體接觸時(shí)，硫磺素t的某些特征會(huì)發(fā)生變化，例如紫外-可見光譜的最大吸收波長(zhǎng)、熒光強(qiáng)度或熒光壽命，進(jìn)而能夠通過檢測(cè)硫磺素t的特征變化，以確定rnag-四鏈體的存在。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的硫磺素t在制備試劑盒中的用途能夠有效地檢測(cè)rnag-四鏈體，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)將待測(cè)樣品與硫磺素t接觸，以便得到混合溶液，所述待測(cè)樣品被預(yù)先確定含有rna；(2)對(duì)所述混合溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析；(3)基于所述紫外-可見吸收光譜分析結(jié)果，確定所述待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體，其中，所述紫外-可見吸收光譜分析結(jié)果中硫磺素t的最大吸收峰位置在424～544nm是所述待測(cè)樣品中含有rnag-四鏈體的指示。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，硫磺素t與rnag-四鏈體結(jié)合后，其最大吸收波長(zhǎng)移動(dòng)至424～454nm，可作為待測(cè)樣品中含有rnag-四鏈體的判定指標(biāo)。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法能夠有效地檢測(cè)rnag-四鏈體，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述方法的步驟(1)進(jìn)一步包括：將所述待測(cè)樣品溶解在tris緩沖液中，以便獲得溶液a；將所述硫磺素t、高純水和tris緩沖液混合，以便獲得溶液b；將所述溶液a和溶液b混合并在避光條件下反應(yīng)4～8小時(shí)，以便獲得所述混合溶液，其中，所述混合溶液中rna與所述硫磺素t的分子摩爾比為0.5～4。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述tris緩沖液含有鉀離子，所述鉀離子的濃度是40mm，所述tris緩沖液ph為7.0～8.0。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tris緩沖液可以穩(wěn)定rna，保持rna的生物活性，在該緩沖液條件下，硫磺素t與rnag-四鏈體具有較強(qiáng)的相互作用。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法準(zhǔn)確性、靈敏度進(jìn)一步提高。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)將待測(cè)樣品與硫磺素t接觸，以便得到混合溶液，所述待測(cè)樣品被預(yù)先確定含有rna；(2)對(duì)所述混合溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析；以及(3)基于所述熒光強(qiáng)度分析結(jié)果，確定所述待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體，其中，所述熒光強(qiáng)度分析結(jié)果中硫磺素t熒光特征峰強(qiáng)度與預(yù)定參數(shù)相比高100～600倍是所述待測(cè)樣品中含有rnag-四鏈體的指示，所述預(yù)定參數(shù)是利用硫磺素t進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)所確定的，其中，所述硫磺素t熒光特征峰位置在480nm～512nm。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，硫磺素t與rnag-四鏈體接觸，能夠使得硫磺素t熒光特征峰強(qiáng)度發(fā)生顯著改變，進(jìn)而能夠確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法能夠有效地檢測(cè)rnag-四鏈體，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便。

需要說明的是，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，“空白對(duì)照試驗(yàn)”是指以只含有硫磺素t的tris緩沖液(含鉀離子)為對(duì)照溶液，其中，硫磺素t的濃度與上述混合溶液中硫磺素t的濃度相同，在與混合溶液相同檢測(cè)條件下對(duì)上述對(duì)照溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。與對(duì)照溶液中的硫磺素t熒光發(fā)射強(qiáng)度相比，rnag-四鏈體可以使得硫磺素t的熒光發(fā)射增強(qiáng)100～600倍，從而使得硫磺素t熒光特征峰比對(duì)照溶液中的硫磺素t熒光特征峰強(qiáng)度高100～600倍，進(jìn)一步確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述方法的步驟(1)進(jìn)一步包括：將所述待測(cè)樣品溶解在tris緩沖液中，以便獲得溶液a；將所述硫磺素t、高純水和tris緩沖液混合，以便獲得溶液b；將所述溶液a和溶液b混合并在避光條件下反應(yīng)4～8小時(shí)，以便獲得所述混合溶液，其中，所述混合溶液中rna與所述硫磺素t的分子摩爾比為0.5～4。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述tris緩沖液含有鉀離子，所述鉀離子的濃度是40mm，所述tris緩沖液ph為7.0～8.0。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tris緩沖液可以穩(wěn)定rna，保持rna的生物活性，在該緩沖液條件下，硫磺素t與rnag-四鏈體具有較強(qiáng)的相互作用。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體方法的準(zhǔn)確度、靈敏度進(jìn)一步提高。

本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)將待測(cè)樣品與硫磺素t接觸，以便得到混合溶液，所述待測(cè)樣品被預(yù)先確定含有rna；(2)對(duì)所述混合溶液進(jìn)行熒光壽命分析；以及(3)基于所述熒光壽命分析結(jié)果，確定所述待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體，其中，所述熒光壽命分析結(jié)果中硫磺素t的熒光壽命值達(dá)到納秒級(jí)別是所述待測(cè)樣品中含有rnag-四鏈體的指示，所述預(yù)定參數(shù)是利用硫磺素t進(jìn)行空白對(duì)照試驗(yàn)確定的，其中，所述硫磺素t的熒光壽命在皮秒級(jí)別。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，rnag-四鏈體可以使得硫磺素t的熒光壽命增加至納秒級(jí)別，該結(jié)果可作為待測(cè)樣品中含有rnag-四鏈體的顯著判定指標(biāo)。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法能夠有效地檢測(cè)rnag-四鏈體，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述方法的步驟(1)進(jìn)一步包括：將所述待測(cè)樣品溶解在tris緩沖液中，以便獲得溶液a；將所述硫磺素t、與高純水和tris緩沖液混合，以便獲得溶液b；將所述溶液a和溶液b混合并在避光條件下反應(yīng)4～8小時(shí)，以便獲得所述混合溶液，其中，所述混合溶液中rna與所述硫磺素t的分子摩爾比為0.5～4。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述tris緩沖液含有鉀離子，所述鉀離子的濃度是40mm，所述tris緩沖液ph為7.0～8.0。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tris緩沖液可以穩(wěn)定rna，保持rna的生物活性，在該緩沖液條件下，硫磺素t與rnag-四鏈體具有較強(qiáng)的相互作用。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體方法的準(zhǔn)確度、靈敏度進(jìn)一步提高。

在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了一種用于檢測(cè)rnag-四鏈體的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒包括硫磺素t。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述試劑盒包括tris緩沖液。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，所述試劑盒包括高純水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出的試劑盒能夠方便快捷地檢測(cè)rnag-四鏈體，且具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述試劑盒還可以進(jìn)一步具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述tris緩沖液含有鉀離子，所述鉀離子的濃度是40mm，所述tris緩沖液ph為7.0～8.0。發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，tris緩沖液可以穩(wěn)定rna，保持rna的生物活性，在該緩沖液條件下，硫磺素t與rnag-四鏈體具有較強(qiáng)的相互作用。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的用于檢測(cè)rnag-四鏈體的試劑盒的準(zhǔn)確度、靈敏度進(jìn)一步提高。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)液丙(對(duì)照組)的紫外-可見吸收光譜圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜圖；

圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測(cè)液丙(對(duì)照組)的熒光光譜圖；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)液甲的熒光光譜圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例2的檢測(cè)液乙的熒光光譜圖；

圖7是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜圖；

圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜圖；

圖9是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)液甲的熒光光譜圖；

圖10是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例3的檢測(cè)液乙的熒光光譜圖；

圖11是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4的檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜圖；

圖12是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4的檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜圖；

圖13是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4的檢測(cè)液甲的熒光光譜圖；

圖14是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例4的檢測(cè)液甲的熒光光譜圖；

圖15是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5的檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜圖；

圖16是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5的檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜圖；

圖17是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5的檢測(cè)液甲的熒光光譜圖；以及

圖18是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5檢測(cè)液乙的熒光光譜圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種利用硫磺素t確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體的方法。

在本發(fā)明中，硫磺素t的分子結(jié)構(gòu)如式i所示，

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，硫磺素t本身對(duì)光的吸收能力較差，產(chǎn)生的光信號(hào)較差。然而，硫磺素t與rna-g四鏈體結(jié)合后，硫磺素t的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，使得其對(duì)光的吸收能力增強(qiáng)，從而可以通過光信號(hào)的檢測(cè)，確定rna-g四鏈體的存在。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可通過如下方法利用硫磺素t確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體：

制備rna和硫磺素t的混合溶液

將含有rna的待測(cè)樣品溶于ph值為7.0-8.0的tris緩沖液中，得到溶液a；將硫磺素t溶于高純水，再用ph值為7.0～8.0的tris緩沖液稀釋，得到溶液b；將溶液a和溶液b混合，使溶液中待測(cè)rna與硫磺素t的分子摩爾比為0.5～4，避光條件下反應(yīng)4-8h后，以便獲得rna和硫磺素t的混合溶液。

其中，緩沖液具體為tris-hcl(含k⁺)緩沖溶液，k⁺的濃度是40mm。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在該緩沖液中，硫磺素t與rnag-四鏈體具有較強(qiáng)的相互作用，而與單鏈rna幾乎沒有作用。基于硫磺素t的此特性，發(fā)明人進(jìn)一步采用了紫外-可見吸收光譜分析法、熒光強(qiáng)度分析法或熒光壽命分析方法對(duì)待測(cè)含有rna的樣品和硫磺素t的混合溶液進(jìn)行測(cè)定，以此來確定待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體。

紫外-可見吸收光譜分析

對(duì)上述待測(cè)含有rna的樣品和硫磺素t的混合溶液進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析，同時(shí)以僅含有硫磺素t的tris緩沖液的溶液作為對(duì)照組。對(duì)照組中硫磺素t最大吸收峰的位置為414nm。如果混合溶液中硫磺素t最大吸收峰的位置紅移到424-454nm，則證明待測(cè)樣品中存在rnag-四鏈體。

熒光強(qiáng)度分析

對(duì)上述含有rna的待測(cè)樣品和硫磺素t的混合溶液進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，如果溶液在480nm～512nm處出現(xiàn)較強(qiáng)的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)，且混合溶液中硫磺素t熒光特征峰強(qiáng)度與預(yù)定參數(shù)相比高100～600倍，則待測(cè)樣品中存在rnag-四鏈體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為0.5～4時(shí)，可使硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)100～600倍。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，單鏈rna與硫磺素t的摩爾比在與rnag-四鏈體與硫磺素t摩爾比相同的條件下，硫磺素t本身的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)只有2-8倍。因此，通過檢測(cè)硫磺素t與待測(cè)rna相互作用后的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)熒光強(qiáng)度，就能夠快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)待測(cè)rna，從而判斷待測(cè)樣品中是否存在rnag-四鏈體。

熒光壽命分析

對(duì)上述含有rna的待測(cè)樣品和硫磺素t的混合溶液進(jìn)行熒光壽命分析，如果溶液的熒光壽命能夠達(dá)到納秒級(jí)別，則待測(cè)樣品中存在rnag-四鏈體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為0.5～4時(shí)，可使硫磺素t的熒光壽命增加至納秒級(jí)別。因此，通過檢測(cè)硫磺素t與待測(cè)rna相互作用后的硫磺素t的熒光壽命，就能夠快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)待測(cè)rna，從而判斷待測(cè)樣品中存在rnag-四鏈體。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出的利用硫磺素t檢測(cè)rnag-四鏈體的方法能夠在溶液體系中高效地識(shí)別rnag-四鏈體，能夠利用簡(jiǎn)單的光譜學(xué)儀器快捷地識(shí)別出rnag-四鏈體。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了硫磺素t在檢測(cè)rnag-四鏈體的新用途。應(yīng)用硫磺素t檢測(cè)rnag-四鏈體具有簡(jiǎn)單、快捷的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有檢測(cè)價(jià)格昂貴，靈敏度差，分子難以獲得的缺陷。硫磺素t檢測(cè)rnag-四鏈體的方法可以通過紫外-可見吸收光譜、熒光強(qiáng)度、熒光壽命的方法進(jìn)一步快速檢測(cè)rnag-四鏈體。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市場(chǎng)購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1制備樣本

在以下實(shí)施例中所用的樣本如下所述：

樣本1：rnag-四鏈體樣本，在以下實(shí)施例中用到的rnag-四鏈體，又稱為vegf，vegf具有seqidno:1所示核苷酸序列。

ggaggagggggaggagga(seqidno:1)。

vegf由廣州銳博生物有限公司合成。將vegf溶解于tris-hcl(含k⁺)溶液中，vegf終濃度為20微摩爾/升，并加溫至90℃后，然后自然降到室溫，即可得到樣本1。

樣本2：?jiǎn)捂渞na樣品，在以下實(shí)施例中用到的單鏈rna，又稱為af22，af22具有seqidno:2所示的核苷酸序列。

ugagcuuaauuguauauauucg(seqidno:2)。

af22由廣州銳博生物有限公司合成，將af22溶解于tris-hcl(含k⁺)溶液中，af22終濃度為20微摩爾/升，并加溫至90℃后，然后自然降到室溫，即可得到樣本2。

硫磺素t：硫磺素t是一種商業(yè)化產(chǎn)品，可以通過市場(chǎng)購買獲得。

硫磺素t購自sigma公司，在以下實(shí)施例中所用硫磺素t具有式i所示的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2檢測(cè)rnag-四鏈體

1、制備反應(yīng)液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入20微升20微摩爾/升的樣本1(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液甲，其中，rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為0.5：1。

2)溶液乙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入20微升20微摩爾/升的樣本2(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液乙，其中，單鏈rna與硫磺素t的摩爾比為0.5：1。

3)溶液丙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照樣品。

2、檢測(cè)反應(yīng)液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的濃度均為2微摩爾/升，溶液甲、乙、丙避光反應(yīng)5h，得到檢測(cè)液甲，檢測(cè)液乙和檢測(cè)液丙。

1)紫外-可見吸收光譜分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖1～3所示，其中圖1是檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜圖，圖2是檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜圖，圖3是檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜。

由圖1～3結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰(此處為紫外-可見吸收峰)為414nm；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰(此處為紫外-可見吸收峰)紅移至424nm；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰仍然為414nm。

2)熒光強(qiáng)度分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

檢測(cè)結(jié)果如圖4～6所示，其中圖4是檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度，圖5是檢測(cè)液甲的熒光強(qiáng)度，圖6是檢測(cè)液乙的熒光強(qiáng)度。

由圖4～圖6結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(480nm)，強(qiáng)度為4；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的熒光強(qiáng)度中會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為480，檢測(cè)液甲的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)相對(duì)檢測(cè)液丙的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度高約100倍；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)未有明顯的增加。

3、結(jié)果分析

進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的紫外最大吸收峰位置在414nm。當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的最大吸收峰位置由414nm紅移至424nm。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的最大吸收峰位置基本沒有發(fā)生變化。

進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的熒光發(fā)射峰(494nm)(很弱，強(qiáng)度約為4，有時(shí)可忽略不計(jì))；當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的熒光發(fā)射峰增強(qiáng)至480。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化。

實(shí)施例3檢測(cè)rnag-四鏈體

1、制備反應(yīng)液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入40微升20微摩爾/升的樣本1(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液甲，其中，rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為1：1。

2)溶液乙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入40微升20微摩爾/升的樣本2(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液乙，其中，單鏈rna與硫磺素t的摩爾比為1：1。

3)溶液丙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照樣品。

2、檢測(cè)反應(yīng)液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的濃度均為2微摩爾/升，溶液甲、乙、丙避光反應(yīng)5h，得到檢測(cè)液甲，檢測(cè)液乙和檢測(cè)液丙。

1)紫外-可見吸收光譜分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析。

檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜，檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜如圖7所示，檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜如圖8所示。

由圖1，圖7和圖8結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰為414nm；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰紅移至445nm；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰仍然為414nm。

2)熒光強(qiáng)度分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度，圖9是檢測(cè)液甲的熒光強(qiáng)度，圖10是檢測(cè)液乙的熒光強(qiáng)度。

由圖4，圖9和圖10結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為4；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的熒光強(qiáng)度中會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為900，檢測(cè)液甲的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)相對(duì)檢測(cè)液丙的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度高約250倍；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度未有明顯的增加。

進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的紫外最大吸收峰位置在414nm。當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的最大吸收峰位置紅移至445nm。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的最大吸收峰位置基本沒有發(fā)生變化。

進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的熒光發(fā)射峰(494nm)(很弱，強(qiáng)度約為4，有時(shí)可忽略不計(jì))；當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的熒光發(fā)射峰增強(qiáng)至900。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化。

實(shí)施例4檢測(cè)rnag-四鏈體

1、制備反應(yīng)液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入80微升20微摩爾/升的樣本1(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液甲，其中，rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為2：1。

2)溶液乙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入80微升20微摩爾/升的樣本2(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液乙，其中，單鏈rna與硫磺素t的摩爾比為2：1。

3)溶液丙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照樣品。

2、檢測(cè)反應(yīng)液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的濃度均為2微摩爾/升，溶液甲、乙、丙避光反應(yīng)5h，得到檢測(cè)液甲、檢測(cè)液乙和檢測(cè)液丙。

1)紫外-可見吸收光譜分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析。

檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜，檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜如圖11所示，檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜如圖12所示。

由圖1，圖11和圖12結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰為414nm；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰紅移至450nm；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰仍然為414nm。

2)熒光強(qiáng)度分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度，圖13是檢測(cè)液甲的熒光強(qiáng)度，圖14是檢測(cè)液乙的熒光強(qiáng)度。

由圖4、圖13和圖14結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為4；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的熒光強(qiáng)度中會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為1400，檢測(cè)液甲硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)相對(duì)檢測(cè)液丙硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度高約400倍；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度未有明顯的增加。

3、結(jié)果分析

進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的紫外最大吸收峰位置在414nm。當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的最大吸收峰位置由414nm紅移至450nm。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的最大吸收峰位置基本沒有發(fā)生變化。

進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的熒光發(fā)射峰(494nm)(很弱，強(qiáng)度約為4，有時(shí)可忽略不計(jì))；當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的熒光發(fā)射增強(qiáng)至1400。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化。

實(shí)施例5檢測(cè)rnag-四鏈體

1、制備反應(yīng)液(溶液甲、溶液乙、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入160微升20微摩爾/升的樣本1(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液甲，其中，rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為4：1。

2)溶液乙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入160微升20微摩爾/升的樣本2(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液乙，其中，單鏈rna與硫磺素t的摩爾比為4：1。

3)溶液丙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照樣品。

2、檢測(cè)反應(yīng)液

溶液甲、乙、丙中硫磺素t的濃度均為2微摩爾/升，溶液甲、乙、丙避光反應(yīng)5h，得到檢測(cè)液甲、檢測(cè)液乙和檢測(cè)液丙。

1)紫外-可見吸收光譜分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析。

檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的紫外-可見吸收光譜，檢測(cè)液甲的紫外-可見吸收光譜如圖15所示，檢測(cè)液乙的紫外-可見吸收光譜如圖16所示。

由圖1，圖15和圖16結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰為414nm；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰紅移至452nm；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的吸收光譜中硫磺素t的最大吸收峰仍然為414nm。

2)熒光強(qiáng)度分析

將檢測(cè)液甲、乙、丙進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。

檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度同實(shí)施例2中檢測(cè)液丙的熒光強(qiáng)度，圖17是檢測(cè)液甲的熒光強(qiáng)度，圖18是檢測(cè)液乙的熒光強(qiáng)度。

由圖4、圖17和圖18結(jié)果可以看出，檢測(cè)液丙(未加入rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為4；檢測(cè)液甲(含有rnag-四鏈體)的熒光強(qiáng)度中會(huì)出現(xiàn)很強(qiáng)的硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)(494nm)，強(qiáng)度為2200，檢測(cè)液甲硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)相對(duì)檢測(cè)液丙硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度高約600倍；檢測(cè)液乙(含有單鏈rna)的熒光強(qiáng)度中硫磺素t熒光特征峰(此處為熒光發(fā)射峰)強(qiáng)度未有明顯的增加。

3、結(jié)果分析

進(jìn)行紫外-可見吸收光譜分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的紫外最大吸收峰位置在414nm。當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的最大吸收峰位置由414nm紅移至452nm。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的最大吸收峰位置基本沒有發(fā)生變化。

進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析時(shí)，當(dāng)溶液中沒有rna存在時(shí)，硫磺素t的熒光發(fā)射峰(494nm)(很弱，強(qiáng)度約為4，有時(shí)可忽略不計(jì))；當(dāng)加入rnag-四鏈體時(shí)，硫磺素t與rnag-四鏈體發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使得硫磺素t的熒光發(fā)射峰增強(qiáng)至2200。當(dāng)加入單鏈rna時(shí)，硫磺素t的熒光強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化。

實(shí)施例6、檢測(cè)rnag-四鏈體

1、制備反應(yīng)液(溶液甲、溶液丙)

1)溶液甲

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后加入80微升20微摩爾/升的樣本1(ph7.2)，繼而用tris-hcl(含k⁺)定容到400微升，混勻，得到溶液甲，其中，rnag-四鏈體與硫磺素t的摩爾比為2：1。

2)溶液丙

在2ml的反應(yīng)管中加入4微升200微摩爾/升的硫磺素t的高純水溶液，然后用tris-hcl(含k⁺)溶液(ph7.2)定容到400微升，混勻，得到溶液丙，作為對(duì)照樣品。

2、熒光壽命分析

溶液甲和丙中硫磺素t的濃度均為2微摩爾/升，溶液甲和丙避光反應(yīng)5h，得到檢測(cè)液甲和檢測(cè)液丙。

分別對(duì)檢測(cè)液甲和丙進(jìn)行熒光壽命分析。

3、結(jié)果分析

溶液甲(含有rnag-四鏈體)中硫磺素t熒光壽命可以增加至納秒級(jí)別，溶液丙中硫磺素t的熒光壽命只有皮秒級(jí)別，因此，只需要對(duì)熒光壽命的長(zhǎng)短進(jìn)行檢測(cè)，即可確定rnag-四鏈體是否存在。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述針對(duì)的未必是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。