本發(fā)明試劑盒涉及生化試劑領(lǐng)域，具體涉及一種檢測診斷試劑盒，主要是涉及一種穩(wěn)定的酶法肌酸激酶檢測診斷試劑盒。

背景技術(shù)：

肌酸激酶是細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)，肌肉收縮，atp再生有直接關(guān)系的一種重要激酶，通常存在于哺乳類動物的心臟，肌肉以及腦等重要組織器官中，肌酸激酶同工酶一般分為4種形式：線粒體型，主要存在于心肌和骨骼肌線粒體中；肌肉型，主要存在于各種肌肉細(xì)胞中；雜化型，主要存在于心肌細(xì)胞中；腦型，主要存在于腦細(xì)胞中，臨床上一般通過肌酸激酶檢測進(jìn)而診斷心肌梗塞，心肌梗塞患者發(fā)病后的2小時內(nèi)，血液中肌酸激酶濃度升高，和乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶相比，肌酸激酶活性變化，優(yōu)先表現(xiàn)出來，肌酸激酶是臨床上重要的一種可檢測酶，在診斷心肌梗塞上有較高臨床檢測價值和預(yù)防價值。

肌酸激酶檢測方法如圖1。

nadh在340nm處有吸收峰，通過監(jiān)測340nm處的吸光度變化，然后乘以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度即可計(jì)算出nadh變化速率，進(jìn)而計(jì)算出計(jì)算激酶酶活；肌酸激酶含有巰基集團(tuán)，具有較高的還原性，極易識貨，因此檢測時，要用帶有巰基的物質(zhì)來激活巰基集團(tuán)，常用的物質(zhì)主要有一下幾種：巰基乙醇、硫代甘油、乙酰半管氨酸等；巰基在試劑中及其活躍，因此巰基的保護(hù)使其穩(wěn)定，成為試劑中難以解決的一大難題；很大程度上一些專利和文獻(xiàn)報(bào)道和介紹了是巰基集團(tuán)穩(wěn)定的方法，主要是隔離巰基物質(zhì)，避免和氧氣接觸，但是缺陷依然存在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明內(nèi)容主要是在于解決巰基集團(tuán)在試劑中的穩(wěn)定性問題，進(jìn)而提高試劑穩(wěn)定性，改善產(chǎn)品質(zhì)量。

本發(fā)明是一種穩(wěn)定的酶法肌酸激酶檢測診斷試劑盒，本發(fā)明試劑盒是由r1和r2組成的雙試劑液體型檢測診斷試劑盒。試劑組成為：

試劑r1為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

醋酸鎂3-5g/l

乙酰半胱氨酸20mmol/l

羥乙基叉二磷酸15mmol/l

輔酶i1-5mmol/l

葡萄糖5g/l

己糖激酶2-8ku/l

曲拉通x-4050.5ml/l

穩(wěn)定劑復(fù)合物質(zhì)0.5-2.5%

試劑r2組成為：

咪唑0.1mol/l

羥乙基叉二磷酸10mmol/l

單磷酸腺苷鹽3g/l

二磷酸腺苷鹽5g/l

二五磷酸鹽0.45g/l

磷酸肌酸32g/l

曲拉通x-4051.5ml/l

其中穩(wěn)定劑復(fù)合物主要是葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通x-405和edta-na2按照不同的比例組成的。

本發(fā)明一種穩(wěn)定的酶法肌酸激酶檢測診斷試劑盒，試劑中物質(zhì)成分的選擇依據(jù)是：

咪唑緩沖液主要是緩沖作用，保證反應(yīng)時外環(huán)境的穩(wěn)定，致使檢測結(jié)果不會受到波動和影響。

醋酸鎂提供鎂離子，用于激活反應(yīng)中參與反應(yīng)的酶類的活性，保證酶能夠有效的發(fā)揮作用。

乙酰半胱氨酸用于提供巰基集團(tuán)，激活肌酸激酶中的巰基。

輔酶i、葡萄糖作為反應(yīng)底物。

己糖激酶催化6-p-葡萄糖反應(yīng)生成6-p-葡萄酸。

曲拉通x-405作為表面活性劑。

羥乙基叉二磷酸起到良好的緩蝕阻垢作用。

單磷酸腺苷鹽、二磷酸腺苷鹽、二五磷酸鹽和磷酸肌酸用來提供不同的磷酸集團(tuán)。

葡聚糖4000、丙三醇、甘露醇、曲拉通x-405和edta-na2按照不同比例組成的復(fù)合物能夠形成一種球形膜，將酶和巰基集團(tuán)包裹起來，起到一定的穩(wěn)定和保護(hù)作用。

本發(fā)明一種穩(wěn)定的酶法肌酸激酶檢測診斷試劑盒，在很大程度上解決了試劑不穩(wěn)定問題；本發(fā)明試劑盒成本較低，相對于市場流通的同類試劑盒，造價遠(yuǎn)低于同類試劑盒。

應(yīng)用本發(fā)明試劑盒，可以在迪瑞系列，邁瑞系列，東芝系列和日立系列全自動生化分析儀上進(jìn)行操作，具體操作方式以bs-800為例：樣本量：試劑r1：試劑r2=10ul:225ul:75ul，檢測波長設(shè)置為340nm檢測方法為速率法，反應(yīng)方向?yàn)樯仙磻?yīng)，校準(zhǔn)物質(zhì)以朗道復(fù)合校準(zhǔn)品為主。

附圖說明

圖1為常規(guī)肌酸激酶檢測方法；

圖2為試劑盒與對照試劑盒相關(guān)性曲線圖；

圖3為對照試劑與本發(fā)明試劑盒穩(wěn)定性檢測結(jié)果；

圖4為本發(fā)明與對照試劑重復(fù)性檢測結(jié)果；

圖5為本發(fā)明試劑盒與對照試劑盒臨床檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

我們將結(jié)合圖表、實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行說明：

實(shí)施例1

試劑r1為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

醋酸鎂4.5g/l

乙酰半胱氨酸20mmol/l

羥乙基叉二磷酸15mmol/l

輔酶i2.5mmol/l

葡萄糖5g/l

己糖激酶3.5ku/l

穩(wěn)定復(fù)合物5%

穩(wěn)定劑復(fù)合物組成為：

曲拉通x-4050.5ml/l

葡聚糖40001g/l

丙三醇15g/l

甘露醇37g/l

edta-na20.6g/l

試劑r2組成為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

羥乙基叉二磷酸10mmol/l

單磷酸腺苷鹽3g/l

二磷酸腺苷鹽5g/l

二五磷酸鹽0.45g/l

磷酸肌酸32g/l

曲拉通x-4051.5ml/l

實(shí)施例2

試劑r1為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

醋酸鎂4.5g/l

乙酰半胱氨酸20mmol/l

羥乙基叉二磷酸15mmol/l

輔酶i2.5mmol/l

葡萄糖5g/l

己糖激酶3.5ku/l

曲拉通x-4050.5ml/l

穩(wěn)定復(fù)合物7.5%

穩(wěn)定劑復(fù)合物組成為：

葡聚糖40004g/l

丙三醇25g/l

甘露醇17g/l

edta-na20.8g/l

試劑r2組成為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

羥乙基叉二磷酸10mmol/l

單磷酸腺苷鹽3g/l

二磷酸腺苷鹽5g/l

二五磷酸鹽0.45g/l

磷酸肌酸32g/l

曲拉通x-4051.5ml/l

實(shí)施例3

試劑r1為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

醋酸鎂4.5g/l

乙酰半胱氨酸20mmol/l

羥乙基叉二磷酸15mmol/l

輔酶i2.5mmol/l

葡萄糖5g/l

己糖激酶3.5ku/l

曲拉通x-4050.5ml/l

穩(wěn)定復(fù)合物10%

穩(wěn)定劑復(fù)合物組成為：

葡聚糖400020g/l

丙三醇15g/l

甘露醇57g/l

edta-na20.5g/l

試劑r2組成為：

咪唑緩沖液0.1mol/l

羥乙基叉二磷酸10mmol/l

單磷酸腺苷鹽3g/l

二磷酸腺苷鹽5g/l

二五磷酸鹽0.45g/l

磷酸肌酸32g/l

曲拉通x-4051.5ml/l

本發(fā)明試劑盒性能檢測試驗(yàn)：

穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測：

運(yùn)用本發(fā)明實(shí)試劑盒（實(shí)施例1配方配制）和目前市場上流通的試劑盒進(jìn)行對比，校準(zhǔn)液和質(zhì)控品分別是朗道926un和1005un，使用儀器為全自動生化分析儀bs-800，本發(fā)明試劑盒參數(shù)設(shè)置如下，波長為340nm，反應(yīng)方向?yàn)榉捶较?，讀數(shù)點(diǎn)設(shè)置為21-27點(diǎn)，樣本量：試劑r1：試劑r2=10ul：225ul：75ul；對照試劑盒嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，檢測儀器為bs-800，以批號926un進(jìn)行校準(zhǔn)檢測，后進(jìn)行結(jié)果檢測，檢測結(jié)果如圖3所示。

通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒在4℃條件下歷時15天后，本發(fā)明試劑盒和對照試劑盒檢測結(jié)果基本沒有變化，相比對照試劑盒，檢測結(jié)果更佳；37℃條件下，本發(fā)明試劑盒歷時15天檢測結(jié)果基本沒有變化，但是對照試劑盒在37℃處理第7天時檢測結(jié)果已經(jīng)偏離靶值10%，15天后檢測結(jié)果偏離靶值40%；45℃條件下，本發(fā)明試劑盒與對照試劑盒，經(jīng)熱處理后均有不同程度的降低，本發(fā)明試劑盒歷經(jīng)15天，檢測結(jié)果尚未偏離靶值10%，對照試劑盒第三天已經(jīng)偏離檢測結(jié)果靶值10%，15天偏離檢測結(jié)果50%。通過上述數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑盒在穩(wěn)定性方面遠(yuǎn)優(yōu)于對照試劑盒。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

運(yùn)用朗道校準(zhǔn)品926un進(jìn)行校準(zhǔn)，對朗道質(zhì)控品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液重復(fù)測試n=20次，所用試劑為本發(fā)明實(shí)施例2配方試劑與市場流通肌酸激酶檢測試劑盒，使用bs-800全自動生化分析儀進(jìn)行檢測，檢測方法在此不在重述，檢測結(jié)果如圖4所示。

通過重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，無論是對照試劑盒還是本發(fā)明試劑盒，變異系數(shù)均在5%以內(nèi)，均能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)要求，從另一方面也反應(yīng)出本發(fā)明試劑盒能夠勝任該試劑盒在市場和醫(yī)學(xué)上的任務(wù)和要求。

臨床樣本檢測實(shí)驗(yàn)

本發(fā)明試劑盒與市場流通的同類試劑盒對隨機(jī)n=40個樣本進(jìn)行測試，測試結(jié)果以表格的形式在下表進(jìn)行體現(xiàn)，通過圖5記錄的數(shù)值，進(jìn)而計(jì)算出，本發(fā)明試劑盒與市場流通的試劑盒的相關(guān)性；本發(fā)明試劑盒采用實(shí)施例3配方進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果如圖5所示。

通過圖5和圖2說明本發(fā)明試劑盒與市場流通試劑盒在檢測臨床40個隨機(jī)樣本，二者的相關(guān)系數(shù)r超過了0.999，這說明本發(fā)明試劑盒與市場上流通的試劑盒均可滿足市場上的需求，亦可滿足醫(yī)院檢驗(yàn)科的臨床樣本檢測。

綜上所述，再加上本實(shí)驗(yàn)室長時間來的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)(有部分?jǐn)?shù)據(jù)在此沒有呈現(xiàn)),本發(fā)明試劑盒中當(dāng)試劑r1中復(fù)合穩(wěn)定劑的比例為5.5%為最好，每個實(shí)施例中我們都進(jìn)行了三組不同比例的檢測，每次均是選擇較好的一組，本發(fā)明試劑盒未將所有數(shù)據(jù)全部呈現(xiàn)，綜合所有檢測結(jié)果，均以實(shí)施例1的配方為最佳方案。