本發(fā)明涉及分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種茶葉鮮樣中茶氨酸含量的快速分析方法。

背景技術(shù)：

茶是世界三大天然飲料之一，具有獨(dú)特的香氣、豐富的營(yíng)養(yǎng)和保健功效，深受消費(fèi)者喜愛。茶葉中含有豐富的氨基酸，它們是構(gòu)成茶葉滋味的重要成分，直接影響茶葉的品質(zhì)。其中，茶氨酸是茶葉中特有的一種氨基酸，占茶葉氨基酸總量的50%以上。茶氨酸安全無毒，具有降血壓、抗疲勞、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能，隨著茶氨酸生理功能和醫(yī)藥價(jià)值的發(fā)現(xiàn)，茶氨酸在醫(yī)療、保健、食品、飲料和精細(xì)化工等領(lǐng)域被廣泛利用。茶氨酸的準(zhǔn)確定量分析，對(duì)于茶葉品質(zhì)的評(píng)價(jià)、茶氨酸的應(yīng)用研究開發(fā)及其功能代謝等方面的研究具有十分重要的意義。

目前對(duì)茶葉中茶氨酸分析方法的研究中以干樣較多和較為成熟，如國(guó)標(biāo)gb/t8303-2013中規(guī)定，茶樣需磨碎后在電熱恒溫干燥箱中加熱、除去水分至恒重后再用于氨基酸含量的測(cè)定。由于干樣通常經(jīng)高溫殺青、烘干和粉碎而成，高溫過程中蛋白質(zhì)變性，其蛋白酶的生物活性喪失，易造成蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致氨基酸含量增加，同時(shí)烘干等步驟可能會(huì)引起茶葉各種生化成分的轉(zhuǎn)化，使得測(cè)定的數(shù)據(jù)并不能反應(yīng)茶葉中氨基酸的真實(shí)水平，從而產(chǎn)生檢測(cè)誤差。

茶葉中茶氨酸的分析方法主要有茚三酮比色法、氣相色譜及其質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法等。經(jīng)典的分析方法一般采用氨基酸分析儀，使用茚三酮作為衍生試劑柱后衍生測(cè)定。但氨基酸分析儀價(jià)格昂貴，分析時(shí)間長(zhǎng)，專屬性強(qiáng)，只能用于分析茶氨酸等游離氨基酸，限制了其廣泛應(yīng)用。相對(duì)于其他幾種方法，柱前衍生-高效液相色譜法無需特殊反應(yīng)裝置，具有儀器普及率高、分析時(shí)間短、方法靈活多樣、靈敏度高、易于推廣的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為茶氨酸檢測(cè)的常規(guī)手段。中國(guó)發(fā)明專利“利用反相高效液相色譜檢測(cè)茶葉中游離氨基酸的方法”（專利號(hào)zl201510109474.4）以6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，使用氨基酸專用分析柱進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)合反相高效液相色譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)茶葉中茶氨酸等19種氨基酸的定量分析。但該發(fā)明采用氨基酸分離專用色譜柱，需要進(jìn)行復(fù)雜的梯度分離，使用成本高，運(yùn)行周期長(zhǎng)（1h左右），在大量樣品分析過程中，十分的費(fèi)時(shí)，不利于茶氨酸的快速分析和推廣普及。更重要的是，該發(fā)明沒有對(duì)方法的準(zhǔn)確性、靈敏性、精密性等進(jìn)行必要的方法學(xué)驗(yàn)，技術(shù)效果無法得到有效保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種茶葉鮮樣中茶氨酸含量的快速分析方法，其目的在于解決現(xiàn)有的茶葉茶氨酸分析方法中存在的速度慢、效率低、成本高、基礎(chǔ)應(yīng)用推廣難等問題。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種茶葉鮮樣中茶氨酸含量的快速分析方法，包括以下兩部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立已知梯度濃度的被測(cè)的茶氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由以下步驟組成：

步驟（1），準(zhǔn)備茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，再分別配制0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液、0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液、1mg/ml的aqc衍生液、6種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為1μmol/l、5μmol/l、50μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；

步驟（2），對(duì)所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取6種濃度的所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均取10μl，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定衍生化的所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中茶氨酸的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，然后以所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出所述標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，儀器分離條件為：

色譜柱：xbridgec18色譜柱（規(guī)格為3.9mm×15cm，4μm）；柱溫37℃；流速2.0ml/min；

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm；

流動(dòng)相：a為磷酸鹽緩沖液，按l:10的體積比用超純水稀釋；b為100%乙腈；c為100%超純水；梯度洗脫程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；進(jìn)樣量10μl；

第二部分，測(cè)定茶葉鮮樣中所述第一部分中的茶氨酸含量，包括以下步驟：

步驟（1），樣品制備；

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，向茶葉鮮樣中加入沸水，所述茶葉鮮樣與所述沸水的投入比為向每1g茶葉鮮樣中投入40ml沸水，在88~92℃條件下浸提18~22min，冷卻至室溫后，2500~3500r/min離心4~6min，上清液加水定容10ml，過0.45μm微孔濾膜后得到茶鮮葉樣品溶液；

步驟（2），對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取10μl茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），根據(jù)所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中茶氨酸的色譜峰保留時(shí)間對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸定性，使用外標(biāo)曲線法計(jì)算茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸的含量；其中，測(cè)定茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸的儀器分離條件與所述第一部分的步驟（3）中的儀器分離條件相同。

上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下：

1、上述方案中，在所述第一部分的步驟（1）中，0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取19.0g三水醋酸鈉、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸調(diào)節(jié)ph至5.05，加edta，用0.45μm濾膜過濾；

0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至8.8，然后加水稀釋至500ml；

1mg/ml的aqc衍生液的配制方法為：向1mgaqc粉末中加入1ml乙腈，渦旋混合，在55℃條件下加熱至溶解。aqc即指6-氨基喹啉基-n-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯，waters公司生產(chǎn)，乙腈為色譜純。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液的配制：精密稱取茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25ml容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。再用所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制成上述6種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

本發(fā)明工作原理以及有益效果是：本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有茶氨酸分析技術(shù)中存在的速度慢、效率低、成本高、推廣難等問題，通過技術(shù)創(chuàng)新，建立了一種快速、實(shí)用、高效、準(zhǔn)確的茶葉鮮樣中茶氨酸的分離分析的方法。將茶葉鮮樣攪碎混勻，以超純水作為萃取溶劑，在90℃條件下浸提20min，離心過濾后，以6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為衍生劑柱前衍生化，使用xbridgec18色譜柱梯度洗脫，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器分離檢測(cè)。傳統(tǒng)方法均以茶葉干樣作為樣品來檢測(cè)茶氨酸含量，這是由于茶葉鮮樣比茶葉干樣含有更多的水分、色素、水溶性灰分、茶多酚等干擾物質(zhì)，容易造成后續(xù)分離困難，也就是說，現(xiàn)有的測(cè)定茶葉干樣中茶氨酸的檢測(cè)方法不適用于茶葉鮮樣的測(cè)定。本發(fā)明以茶葉鮮樣代替茶葉干樣作為樣品，為了解決分離困難的難題，創(chuàng)造性、針對(duì)性地選用6-氨基喹啉-n-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯為柱前衍生劑，聯(lián)合利用xbridgec18色譜柱以及高效液相色譜-熒光檢測(cè)器分離分析，發(fā)現(xiàn)能夠快速、高效、準(zhǔn)確地分離分析茶葉鮮樣中茶氨酸。尤其是選用規(guī)格為4μm的高效xbridgec18色譜柱與aqc柱前衍生法聯(lián)用，在保證分析速度更快的同時(shí)，能夠很好地分離茶葉鮮樣中茶氨酸，從而保證了對(duì)茶葉鮮樣中茶氨酸的定性定量分析。

與現(xiàn)有茶葉茶氨酸分析技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果：

①首次建立了針對(duì)茶葉鮮樣中茶氨酸的快速定量分析方法，優(yōu)點(diǎn)在于以茶葉鮮樣作為樣品，代替了傳統(tǒng)方法中以茶葉干樣作為樣品來檢測(cè)茶氨酸含量，避免了高溫、烘干等步驟可能引起的茶葉各種生化成分間的轉(zhuǎn)化、導(dǎo)致茶氨酸含量變化而產(chǎn)生的檢測(cè)誤差，測(cè)定數(shù)據(jù)更加精準(zhǔn)可靠，可真實(shí)地反應(yīng)茶葉中茶氨酸的含量水平；

②選用xbridgec18色譜柱，代替氨基酸專用分析柱，對(duì)茶氨酸進(jìn)行分離分析，通過技術(shù)優(yōu)化，整個(gè)分析周期只有14分鐘，大大提高了對(duì)茶氨酸的分析效率，可滿足大批量樣品分析對(duì)進(jìn)度的要求。同時(shí)，xbridgec18色譜柱價(jià)格相對(duì)便宜，專屬性不強(qiáng)，可以用于其他物質(zhì)的檢測(cè)，在節(jié)省分析成本的前提下，彌補(bǔ)了目前基于高效液相色譜不能準(zhǔn)確對(duì)茶葉中茶氨酸進(jìn)行快速分析的空缺，特別適合在廣大基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和單位推廣使用。

總之，本發(fā)明的樣品制備快速簡(jiǎn)單、成本低，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性以及線性關(guān)系良好，整個(gè)分析過程快速、靈敏且重現(xiàn)性好，適用于茶葉鮮樣中茶氨酸的快速分析，為茶葉中茶氨酸的質(zhì)量控制提供了有效的分析方法，適宜于推廣應(yīng)用。

附圖說明

附圖1為本發(fā)明茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的hplc圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

實(shí)施例：一種茶葉鮮樣中茶氨酸含量的快速分析方法

所述快速分析方法包括以下兩部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立已知梯度濃度的被測(cè)的茶氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由以下步驟組成：

步驟（1），準(zhǔn)備茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，再分別配制0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液、0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液、1mg/ml的aqc衍生液、6種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為1μmol/l、5μmol/l、50μmol/l、500μmol/l、1000μmol/l、1250μmol/l；

0.14mol/l的磷酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取19.0g三水醋酸鈉、1.72g三乙胺溶于1000ml水，用磷酸調(diào)節(jié)ph至5.05，加edta，用0.45μm濾膜過濾；

0.4mol/l的硼酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取12.36g硼酸，加400ml水溶解，用400g/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)ph至8.8，然后加水稀釋至500ml；

1mg/ml的aqc衍生液的配制方法為：向1mgaqc粉末中加入1ml乙腈，渦旋混合，在55℃條件下加熱至溶解。

茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液的配制：精密稱取茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于25ml容量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，得茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為12.5μmol/l，于-20℃冰箱保存。再用所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)母液配制成上述6種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

準(zhǔn)備儀器與設(shè)備：2695高效液相色譜儀，配2475熒光檢測(cè)器（waters公司）；tg16-ws臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器公司）；k600粉碎機(jī)（德國(guó)博朗公司）；le-3000電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司）；direct-q5uv超純水機(jī)（美國(guó)millipore公司）。

步驟（2），對(duì)所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取6種濃度的所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均取10μl，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合10～20s，靜置1min后在55℃下加熱10min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定衍生化的所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中茶氨酸的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，然后以所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出所述標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，儀器分離條件為：

色譜柱：xbridgec18色譜柱（規(guī)格為3.9mm×15cm，4μm，waters公司）；柱溫37℃；流速2.0ml/min；

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm；

流動(dòng)相：a為磷酸鹽緩沖液，按l:10的體積比用超純水稀釋；b為100%乙腈；c為100%超純水；梯度洗脫程序：0min，100%a；0.5min，98%a+2.0b%；0.5-9.0min，96.5%a+3.5%b；9.0-9.5min，95.0%a+5.0%b；9.5-11.5min，91.5%a+8.5%b；11.5-13.0min，83.0%a+17.0%b，保持4min；17.0min，60.0%b+40%c，保持2min；19-23min，100%a；進(jìn)樣量10μl；

第二部分，測(cè)定茶葉鮮樣中所述第一部分中的茶氨酸含量，包括以下步驟：

步驟（1），樣品制備；

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，稱取0.25g，加入10ml沸水，在90℃的水浴鍋中浸提20min，冷卻至室溫后，3000r/min離心5min，上清液加水定容10ml，過0.45μm微孔濾膜后備用得到茶鮮葉樣品溶液；

步驟（2），對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取10μl茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70μl所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取15μl所述aqc衍生液和5μl乙腈，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合10～20s，靜置1min后在55℃下加熱10min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），根據(jù)所述茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中茶氨酸的色譜峰保留時(shí)間對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸定性，使用外標(biāo)曲線法計(jì)算茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸的含量；其中，測(cè)定茶鮮葉樣品溶液中茶氨酸的儀器分離條件與所述第一部分的步驟（3）中的儀器分離條件相同。

本實(shí)施例的試驗(yàn)結(jié)果：

1、茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜分離

從附圖1中可以看出，茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)衍生后測(cè)定，出峰時(shí)間在11min左右，出峰前后無其他干擾，說明此方法可用作茶氨酸準(zhǔn)確定性及定量測(cè)定。

2、方法的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

配制濃度分別1、5、50、500、1000、1250μmol/l的茶氨酸標(biāo)液，衍生化后進(jìn)樣測(cè)定，以茶氨酸溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（表1）。

結(jié)果表明，在5～250μmol/l范圍內(nèi)，茶氨酸的濃度與其峰面積的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9991。以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限為0.05μmol/l。

表1茶氨酸的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

3、方法回收率

精密稱取0.25g已知茶氨酸含量的茶鮮葉樣品5份，向其中加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平相當(dāng)于50μmol/l，進(jìn)行樣品制備、衍生反應(yīng)后測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，得出茶氨酸的平均回收率為87.91，rsd為9.02。說明本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，方法可靠。

4、方法精密度

取適量含茶氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法衍生后進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，以色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算rsd，考察其精密度。得出茶氨酸保留時(shí)間rsd為0.49%，峰面積rsd為1.97%，說明本方法精密度較高。

5、方法重復(fù)性

取同一茶鮮葉樣品5份，按上述方法提取、衍生、測(cè)定，以色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算rsd，考察方法的重復(fù)性。茶鮮葉所含茶氨酸峰保留時(shí)間rsd為1.68%，峰面積rsd為2.55，重復(fù)性較好。

6、方法穩(wěn)定性

取同一茶鮮葉樣品供試溶液，按照上述方法衍生，分別在0、4、8、12、24h進(jìn)樣，以色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為指標(biāo)計(jì)算rsd，考察茶鮮葉衍生化溶液的穩(wěn)定性。茶氨酸衍生化產(chǎn)物保留時(shí)間rsd為1.50%（n=5），峰面積rsd為2.54%(n=5)。表明氨基酸衍生化溶液在室溫下可以穩(wěn)定24h。

7、方法應(yīng)用

應(yīng)用建立的方法，分別對(duì)取自蘇州洞庭東山和洞庭西山的2個(gè)碧螺春茶葉鮮樣中的茶氨酸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2茶葉鮮樣中茶氨酸的檢測(cè)結(jié)果

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。