本發(fā)明屬于生物檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種定量檢測(cè)牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法。
背景技術(shù)：
：定量蛋白質(zhì)組學(xué)的目的是對(duì)復(fù)雜的混合體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，并對(duì)蛋白質(zhì)的量及量的變化進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，是當(dāng)前系統(tǒng)生物科學(xué)研究的重要內(nèi)容。近年來(lái)，由于質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步，定量蛋白質(zhì)組學(xué)在分析蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組方面已取得了令人矚目的成就。在種種成熟的蛋白質(zhì)定量分析技術(shù)中，應(yīng)用三重四極桿質(zhì)譜(triplequadrupole)，在選擇反應(yīng)監(jiān)控模式(selectedreactionmonitoring，srm)中，對(duì)蛋白質(zhì)中特異肽進(jìn)行檢測(cè)，在完全酶解的情況下，特異肽的摩爾濃度與對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的摩爾濃度相同，故可以通過(guò)其與蛋白質(zhì)分子量計(jì)算獲得蛋白質(zhì)的濃度。公開(kāi)號(hào)為cn103616454a的專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種定量檢測(cè)人β-酪蛋白含量的方法以及試劑盒，該方法中利用人β-酪蛋白酶解后所獲得的特異多肽序列，設(shè)計(jì)出同位素標(biāo)記的特異肽和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的序列，并基于內(nèi)標(biāo)法對(duì)人β-酪蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。公開(kāi)號(hào)為cn103642895a的專(zhuān)利文獻(xiàn)公開(kāi)了一種定量檢測(cè)人α-乳白蛋白含量的方法以及試劑盒。該專(zhuān)利文獻(xiàn)利用人α-乳白蛋白酶解后所獲得的特異多肽序列，設(shè)計(jì)出同位素標(biāo)記的特異肽和同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物的序列，并基于內(nèi)標(biāo)法對(duì)人α-乳白蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。上述方法中，通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)記策略，提高特異肽的檢測(cè)準(zhǔn)確度，但是若蛋白質(zhì)未完全將所有的特異肽酶解釋放出來(lái)時(shí)，那么上述方法將不能準(zhǔn)確的測(cè)定得到的特異肽的濃度，即不能準(zhǔn)確的換算出蛋白質(zhì)的含量。而現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于蛋白質(zhì)酶解效果的檢測(cè)一直缺乏一種簡(jiǎn)單有效的方法，因此如何對(duì)蛋白質(zhì)的酶解效果進(jìn)行快速而且有效的檢測(cè)，對(duì)于后續(xù)所有提高特異肽檢測(cè)準(zhǔn)確度的研究至關(guān)重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種定量檢測(cè)牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法，提高牛羊乳中蛋白質(zhì)含量檢測(cè)的準(zhǔn)確度。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種定量檢測(cè)牛羊乳中蛋白質(zhì)含量的方法，包括以下步驟：(1)以與待測(cè)牛羊乳樣品中加入蛋白酶酶解得到酶解物；(2)對(duì)所述酶解物中驗(yàn)證肽和特異肽進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的酶解效果；若通過(guò)酶解效果驗(yàn)證，表示特異肽已完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則用所獲得的特異肽濃度乘以待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的分子量獲得蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；若未通過(guò)酶解效果驗(yàn)證，表示特異肽未完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到，則將酶解物再次進(jìn)行酶解優(yōu)化處理；所述驗(yàn)證肽中至少含有一個(gè)或一個(gè)以上在待測(cè)蛋白質(zhì)中最后被所述酶所酶解的位點(diǎn)；或，所述驗(yàn)證肽為所述特異肽向n端或者c端延長(zhǎng)至一個(gè)或一個(gè)以上酶解位點(diǎn)的多肽。(3)待特異肽已完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到后，將所述酶解物經(jīng)由質(zhì)譜檢測(cè)；(4)制作待測(cè)蛋白質(zhì)的特異肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；(5)將步驟(3)得到的檢測(cè)結(jié)果代入步驟(4)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，獲得樣品的特異肽摩爾濃度，然后按下式計(jì)算獲得待測(cè)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；待測(cè)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度＝待測(cè)樣品中待測(cè)蛋白特異肽摩爾濃度×待測(cè)蛋白質(zhì)摩爾質(zhì)量。本發(fā)明中對(duì)于驗(yàn)證肽的選擇來(lái)說(shuō)，能被相應(yīng)酶完全酶解的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，驗(yàn)證肽中至少含有最后被所述酶所酶解的位點(diǎn)；但是對(duì)于部分蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，難以完全酶解，因此本發(fā)明對(duì)于此類(lèi)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，可以選擇特異肽向n端或者c端延長(zhǎng)至少一個(gè)以上酶解位點(diǎn)的多肽作為驗(yàn)證肽。本發(fā)明中若酶解物中不含有所述驗(yàn)證肽時(shí)，則所述待測(cè)蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，可以對(duì)特異肽的濃度進(jìn)行測(cè)定，再通過(guò)特異肽的濃度測(cè)定結(jié)果換算出待測(cè)蛋白質(zhì)的含量；反之，若酶解物中含有所述驗(yàn)證肽時(shí)，則所述待測(cè)蛋白質(zhì)樣品未完全酶解釋放得到特異肽，則所述待測(cè)蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，待測(cè)蛋白質(zhì)樣品還需再次進(jìn)行酶解，并重復(fù)上述驗(yàn)證過(guò)程。作為優(yōu)選，所述待測(cè)蛋白質(zhì)與其特異肽的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：一般來(lái)說(shuō)，為每個(gè)蛋白質(zhì)只需選擇一條多肽作為特異肽。在此情況下，所以無(wú)需追求蛋白質(zhì)徹底水解，只要保證所選擇的特異肽完全釋放出來(lái)即可。因此本發(fā)明在此情況下，本發(fā)明還可以選擇特異肽向n端或者c端延長(zhǎng)至一個(gè)或一個(gè)以上酶解位點(diǎn)的多肽作為驗(yàn)證肽。本發(fā)明中驗(yàn)證肽的選擇有多種，作為優(yōu)選，所述驗(yàn)證肽為所述特異肽向特異肽的n端延長(zhǎng)至下一個(gè)酶解位點(diǎn)的多肽。對(duì)于位于蛋白質(zhì)c端的特異肽，可以選擇向n端延伸至下一個(gè)酶解位點(diǎn)的多肽作為驗(yàn)證肽。作為優(yōu)選，所述驗(yàn)證肽為所述特異肽向特異肽的c端延長(zhǎng)至下一個(gè)酶解位點(diǎn)的多肽。對(duì)于位于蛋白質(zhì)n端的特異肽，可以選擇向c端延伸至下一個(gè)酶解位點(diǎn)的多肽作為驗(yàn)證肽。作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述驗(yàn)證肽和特異肽采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明中對(duì)驗(yàn)證肽進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以采用與特異肽相同的檢測(cè)方法，其中預(yù)處理方法和儀器通用參數(shù)與特異肽完全一致，僅增加驗(yàn)證肽專(zhuān)屬的srm參數(shù)。因此本發(fā)明可以在不增加實(shí)驗(yàn)操作和成本的前提下，僅通過(guò)參數(shù)的設(shè)置即能完成本發(fā)明，從而本發(fā)明具有很高的便利性和實(shí)用性。作為優(yōu)選，在步驟(1)和步驟(4)中加入同位素標(biāo)記的同位素特異肽作為內(nèi)標(biāo)，并且采用同位素稀釋法進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)算。本發(fā)明人工合成同位素內(nèi)標(biāo)，在樣品預(yù)處理階段和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備階段加入，用同位素稀釋法的原理進(jìn)行檢測(cè)和結(jié)果計(jì)算，以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度。作為優(yōu)選，所述待測(cè)蛋白質(zhì)與所述同位素特異肽的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：其中v*是[13c5,15n]-纈氨酸，i*是[13c6,15n]-異亮氨酸，l*是[13c6,15n]-亮氨酸，f*是[13c9,15n]-苯丙氨酸。同位素特異肽與特異肽的序列相同，兩者的區(qū)別僅在于：同位素特異肽與特異肽上的某些元素互為同位素。本發(fā)明中采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)驗(yàn)證肽進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為了降低檢測(cè)誤差，本發(fā)明需要合理設(shè)置驗(yàn)證肽的檢測(cè)參數(shù)，由于儀器品牌型號(hào)、狀態(tài)、信號(hào)的表達(dá)方式的差異，相同濃度的驗(yàn)證肽在不同設(shè)備上所產(chǎn)生的信號(hào)也不同。所以驗(yàn)證肽的閾值無(wú)法是一個(gè)絕對(duì)值，而是是一個(gè)相對(duì)值，作為優(yōu)選，所述驗(yàn)證肽的信號(hào)強(qiáng)度閾值設(shè)置為所述特異肽信號(hào)強(qiáng)度的1％。若驗(yàn)證肽的信號(hào)強(qiáng)度小于所述驗(yàn)證肽的信號(hào)強(qiáng)度閾值時(shí)，則特異肽已完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到。作為優(yōu)選，所述驗(yàn)證肽的信噪比低于3。若驗(yàn)證肽的信號(hào)強(qiáng)度小于所述驗(yàn)證肽的信噪比時(shí)，則特異肽已完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到，反之，特異肽未完全從待測(cè)蛋白質(zhì)樣品酶解得到。針對(duì)蛋白質(zhì)含量特別低的樣品(例如乳糖)，作為優(yōu)選，將所述步驟(1)中的酶解物進(jìn)行富集純化操作。通過(guò)富集純化操作，提高樣品中多肽濃度，降低基質(zhì)濃度，使本發(fā)明適用于更為廣泛的濃度范圍。作為優(yōu)選，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，所述的待測(cè)蛋白質(zhì)的特異肽可由人工合成方法獲得，或者通過(guò)待測(cè)蛋白質(zhì)酶解的辦法獲得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明中若酶解物中含有驗(yàn)證肽時(shí)，則待測(cè)蛋白質(zhì)樣品未完全酶解釋放得到特異肽；反之，則待測(cè)蛋白質(zhì)樣品完全酶解釋放得到特異肽，待測(cè)蛋白質(zhì)樣品還需再次進(jìn)行酶解并重復(fù)上述驗(yàn)證肽的檢測(cè)，直至酶解物中不含有驗(yàn)證肽。因此本發(fā)明中可以對(duì)于待測(cè)蛋白質(zhì)是否酶解完全釋放得到所對(duì)應(yīng)的特異肽進(jìn)行驗(yàn)證，以獲得準(zhǔn)確的特異肽的濃度，進(jìn)而準(zhǔn)確的換算出待測(cè)蛋白質(zhì)的含量。具體實(shí)施方式實(shí)施例1以合成的特異肽為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)牛羊奶粉中6種蛋白質(zhì)的含量。樣品預(yù)處理方式：稱(chēng)取10g樣品于100ml容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度。取上述溶液10μl于2ml塑料離心管中，依次加入10μl混合同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和945μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；再加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min；加入胰蛋白酶溶液10μl，于37℃水浴鍋中反應(yīng)2h；加入5μl甲酸溶液，通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，通過(guò)用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)樣分析，其中目標(biāo)多肽(特異肽)和子離子信息見(jiàn)表1，液相色譜條件和質(zhì)譜條件高效液相色譜分離條件如下：色譜柱為c18色譜柱，柱溫為40℃；流動(dòng)相a為體積百分比為0.1％的甲酸的乙腈溶液，流動(dòng)相b為體積百分比為0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3ml/min；其中，梯度洗脫為：流動(dòng)相a的體積百分比由3％耗時(shí)10min上升至40％，對(duì)應(yīng)地流動(dòng)相b的體積百分比由97％耗時(shí)10min下降至60％，然后改為100％流動(dòng)相a沖洗2min，最后改為流動(dòng)相a體積百分比3％和流動(dòng)相b體積百分比97％保留3min；進(jìn)樣分析質(zhì)譜條件：毛細(xì)管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900l/min，錐孔反吹氣流量：30l/hr，碰撞室壓力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5v，高端分辨率1：15.0v，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8v，高端分辨率2：15.0v，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0v，入口透鏡電壓：0.5v，出口電壓：0.5v，碰撞梯度：1.0。特異肽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)預(yù)處理方式：將合成的特異肽用水稀釋?zhuān)渲瞥上盗袠?biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，取10μl標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，依次加入10μl混合同位素特異肽溶液、10μl二硫蘇糖醇溶液(100mmol/l)和845μl碳酸氫銨溶液(500mm)，混合均勻后在70℃水浴鍋中孵育30min；加入10μl碘代乙酰胺(300mmol/l)溶液，混合均勻后在室溫環(huán)境中避光靜置30min，加入5μl甲酸溶液，通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣分析，分析參數(shù)同上。樣品完全酶解的驗(yàn)證方式：在檢測(cè)過(guò)程中為每條特異肽設(shè)置一條驗(yàn)證肽，驗(yàn)證肽是以特異肽為基礎(chǔ)，向n端或者c端延伸到下一個(gè)胰蛋白酶酶解位點(diǎn)。當(dāng)驗(yàn)證肽的信號(hào)強(qiáng)度小于閾值時(shí)，認(rèn)為該特異肽已經(jīng)完全酶解。由于儀器品牌型號(hào)、狀態(tài)、信號(hào)的表達(dá)方式的差異，相同濃度的驗(yàn)證肽在不同設(shè)備上所產(chǎn)生的信號(hào)也不同。所以驗(yàn)證肽的閾值無(wú)法是一個(gè)絕對(duì)值，而是是一個(gè)相對(duì)值，本方法將驗(yàn)證肽的閾值設(shè)置為對(duì)應(yīng)的特異肽的1％。若驗(yàn)證肽信號(hào)大于閾值，需要將樣品再次酶解，并且可以適量提高酶解時(shí)間和酶濃度。驗(yàn)證肽的分析參數(shù)見(jiàn)表2。樣品計(jì)算方式：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度＝特異肽的摩爾濃度×蛋白質(zhì)的分子量結(jié)果見(jiàn)表3表1特異肽和同位素特異肽的檢測(cè)參數(shù)表2驗(yàn)證肽檢測(cè)參數(shù)表3檢測(cè)結(jié)果實(shí)施例2用不同來(lái)源的牛奶和羊奶按照比例(質(zhì)量比)配制混合樣品，冷凍干燥后，在未告知濃度的情況下，以盲樣形式進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果，參見(jiàn)表4。表4檢測(cè)結(jié)果顯示，測(cè)得值與設(shè)計(jì)值具有高度相關(guān)性，證實(shí)了本發(fā)明的準(zhǔn)確性。除此之外，樣品制備單位和檢測(cè)單位采用不同的羊奶和牛奶用于樣品制備和檢測(cè)，說(shuō)明本發(fā)明所選擇的多肽具有普遍性，在不同來(lái)源的樣品中均能獲得穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果。實(shí)施例3乳糖主要是牛奶、羊奶中分離純化得到的，在配方奶粉中需要乳糖，若乳糖引入異源蛋白質(zhì)，會(huì)影響產(chǎn)品物種源性方面的純度和品質(zhì)。本實(shí)施例搜集了一個(gè)乳糖樣品，對(duì)其中牛源性蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。首先按照實(shí)施例1的方式進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表。作為優(yōu)化方法，在實(shí)施例1“加入5μl甲酸溶液”步驟之后加入純化富集操作。具體如下：(1)用3ml的甲醇活化c18固相萃取柱；(2)用10ml的純水平衡c18固相萃取柱；(3)加入5ml酶解溶液，緩速滴干后，用10ml的純水清洗；(4)用5ml甲醇水溶液(70/30，v/v)洗脫，搜集洗脫液后冷凍干燥；(5)用0.5ml純水復(fù)溶。上述兩種方法均重復(fù)三次，結(jié)果見(jiàn)表5。表5方法平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)施例117.2mg/kg8.7mg/kg50.6％優(yōu)化后的實(shí)施例122.5mg/kg1.3mg/kg5.8％用上述兩個(gè)方法都能得到相似的檢測(cè)結(jié)果，但是單純使用實(shí)施例1所述方法會(huì)產(chǎn)生非常大的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。主要原因是在乳糖樣品中蛋白質(zhì)含量偏低，未經(jīng)過(guò)富集，其濃度處于儀器檢測(cè)范圍的下限附近，雖然可以獲得濃度，但是其偏差較大，難以獲得較為精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。倘若單純使用蒸發(fā)等濃縮方式，會(huì)使樣品中大量的乳糖析出，樣品無(wú)法進(jìn)樣。本發(fā)明優(yōu)選固相萃取的方式進(jìn)行濃縮，可以提高樣品濃度的同時(shí)，降低基質(zhì)中的雜質(zhì)。當(dāng)前第1頁(yè)12