本發(fā)明涉及膽汁酸的檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)五種游離型膽汁酸的方法。
背景技術(shù)：
：膽汁酸(bileacid)，為膽汁的主要有機(jī)成分，是一類24碳膽烷酸羥基衍生物的總稱。膽汁酸按結(jié)構(gòu)可分為：游離型膽汁酸(freebileacid)和結(jié)合型膽汁酸(conjugatedbileacid)。人體中游離膽汁酸按其生成部位及結(jié)構(gòu)不同分為初級(jí)和次級(jí)膽汁酸。初級(jí)膽汁酸由肝內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)變而來(lái)，通過(guò)一系列反應(yīng)，最終生成膽酸(cholicacid，CA)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholicaic，CDCA)。初級(jí)膽汁酸在肝細(xì)胞合成后，在肝細(xì)胞毛細(xì)膽管膜一系列轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以膽鹽形式進(jìn)入毛細(xì)膽管，存儲(chǔ)于膽囊，進(jìn)食后膽囊收縮，膽囊排空，膽汁酸進(jìn)入腸道。在腸道中受細(xì)菌作用，初級(jí)膽汁酸經(jīng)過(guò)水解、氧化和核羥基的差向異構(gòu)生成的膽汁酸，稱為次級(jí)膽汁酸，包括脫氧膽酸(deoxycholicacid，DCA)、石膽酸(lithocholicacid，LCA)和熊脫氧膽酸(ursodeoxycholicacid，UDCA)。游離型膽汁酸是膽固醇的代謝產(chǎn)物，體內(nèi)存在多種復(fù)雜機(jī)制調(diào)節(jié)游離型膽汁酸的代謝。游離型膽汁酸在脂肪代謝中起著重要作用。游離型膽汁酸主要存在于肝腸循環(huán)系統(tǒng)，并通過(guò)再循環(huán)以達(dá)到對(duì)人體機(jī)體的保護(hù)作用。同時(shí)，游離型膽汁酸還是FXR、PXR、VDR和GPCR等許多受體的天然配體，調(diào)節(jié)其代謝相關(guān)的酶類和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)游離型膽汁酸的水平，能夠激活肝臟和胃腸道細(xì)胞中相應(yīng)受體和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而改變和編碼調(diào)控葡萄糖、脂肪酸和脂蛋白質(zhì)的合成、代謝、運(yùn)輸以及能量代謝的相關(guān)酶的基因表達(dá)。正因?yàn)榫哂腥绱诉€總要的生理功能，因此檢測(cè)檢測(cè)每一種游離型膽汁酸的體內(nèi)水平，對(duì)于肝膽和腸道疾病的篩查、診斷和鑒別診斷具有重要價(jià)值。分離和定量游離型膽汁酸及其結(jié)合物是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@類化合物的生化特征各異，有的還存在同分異構(gòu)體，且它們?cè)谌梭w中的含量較低。目前常規(guī)檢測(cè)方法是循環(huán)酶法測(cè)定生理溶液中的膽汁酸，雖然操作較為簡(jiǎn)單，然而該方法只能檢測(cè)總膽汁酸含量，無(wú)法做到測(cè)定不同游離型膽汁酸的差異；氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用在檢測(cè)膽汁酸時(shí)需要復(fù)雜的樣品制備才能進(jìn)行分析；高效液相色譜串聯(lián)紫外檢測(cè)器在檢測(cè)復(fù)雜生物基質(zhì)中的膽汁酸會(huì)導(dǎo)致靈敏度和特異性不足。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血清中五種游離型膽汁酸的方法，其能解決現(xiàn)有技術(shù)中游離型膽汁酸檢測(cè)操作復(fù)雜，靈敏度和特異性不足的問(wèn)題。本發(fā)明的目的采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)血清中五種游離型膽汁酸的方法，所述五種游離型膽汁酸為：膽酸，石膽酸，脫氧膽酸，熊脫氧膽酸，鵝脫氧膽酸；包括如下步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將上述五種游離型膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品用乙腈稀釋到若干個(gè)不同濃度備用，每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品中加入等量的含有已知濃度內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液；所述游離型膽汁酸乙腈溶液的濃度均控制在400pmol/L～2μmol/L之間，所述內(nèi)標(biāo)為氘代膽酸、氘代脫氧膽酸、氘代熊脫氧膽酸，高速離心后吸取上清液，進(jìn)行凍干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后離心，取上清液于96孔板用于高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；(2)高效液相色譜分離：利用超高壓液相色譜以及相應(yīng)的流動(dòng)相，在反向C18分析柱上對(duì)五種游離型膽汁酸進(jìn)行分離；(3)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)：色譜上分離后的五種游離型膽汁酸進(jìn)入到質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式特異性地檢測(cè)五種游離型膽汁酸，根據(jù)信號(hào)噪音比計(jì)算得到定量檢測(cè)限與鑒定檢測(cè)限，根據(jù)比值以及已知標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖并得到定量校正方程；(4)血清中游離型膽汁酸的檢測(cè)：取血清樣本，加入含內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液進(jìn)行蛋白沉淀，充分沉淀后第一次離心，移取血清上清液利用離心濃縮冷凍系統(tǒng)凍干后，加入一定量的含有乙腈的水溶液后離心，取上清液于96孔板上備用，用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析步驟同步驟(2)、步驟(3)，液相色譜質(zhì)譜檢測(cè)得到游離型膽汁酸與內(nèi)標(biāo)的比值，將比值代入到定量校正方程，計(jì)算得到血清中游離型膽汁酸的含量。進(jìn)一步，所述步驟(1)中所述含已知濃度內(nèi)標(biāo)的乙腈溶液為，所述內(nèi)標(biāo)為氘代膽酸的濃度為76nmol/L，內(nèi)標(biāo)氘代脫氧膽酸的濃度為104nmol/L，內(nèi)標(biāo)氘代熊脫氧膽酸的濃度為126nmol/L。進(jìn)一步，所述步驟(2)中高效液相色譜分離條件為：色譜柱：WatersACQUITYUPLCC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色譜柱柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.4mL/min；流動(dòng)相組成：A相為0.1％甲酸水溶液，即甲酸在混合液中的體積占比為0.1％，B相為0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1，即甲酸和乙腈的混合液與甲醇的體積比為3:1,其中甲酸在甲酸和乙腈的混合液中體積占比為0.1％。采用梯度洗脫方式，見(jiàn)表1或表2；表1序號(hào)時(shí)間(min)流速(mL/min)A％B％曲線值1-0.46535-23.00.45743634.50.45446646.00.44159658.00.44159669.70.434666711.70.42981812.30.465351表2進(jìn)一步，所述步驟(3)中每一種游離型膽汁酸的檢測(cè)參數(shù)均先用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行優(yōu)化，然后利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式特異性地檢測(cè)五種游離型膽汁酸，所述質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)為：電噴霧針電壓：3.0kV，去溶劑氣流速：800L/h，去溶劑氣溫度：400℃，錐孔氣流速：50L/h，檢測(cè)為負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)控，質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)控參數(shù)如表3所示：表3進(jìn)一步，所述步驟(1)中兩次離心條件為：離心力位18000g，離心溫度為4℃，離心時(shí)間為5min。進(jìn)一步，所述步驟(4)中血清與含內(nèi)標(biāo)乙腈溶液的體積比為1:3。進(jìn)一步，所述步驟(4)中血清為人或動(dòng)物血清。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：1)可以同時(shí)定性并精準(zhǔn)定量人血清中的五種游離型膽汁酸；2)采用乙腈進(jìn)行蛋白沉淀，提取后便可使用高效液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，前處理步驟簡(jiǎn)單，并且可以有效去除血清基質(zhì)干擾，特異性好；3)采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，通量高，檢測(cè)靈敏度高，特異性好。附圖說(shuō)明圖1、本發(fā)明的檢測(cè)方法的流程示意圖；圖2、各游離型膽汁酸的色譜洗脫出峰的絕對(duì)保留時(shí)間；圖3、膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4、石膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5、脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6、熊脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖7、鵝脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：五種游離型膽汁酸：膽酸、石膽酸、脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸標(biāo)準(zhǔn)品以及同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)：氘代膽酸、氘代脫氧膽酸、氘代熊脫氧膽酸均采購(gòu)于SigmaAldrich公司。標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)首先用乙腈進(jìn)行溶解，然后保存在-80℃，需要進(jìn)行實(shí)際樣品檢測(cè)時(shí)，再利用乙腈將內(nèi)標(biāo)氘代膽酸稀釋濃度為76nmol/L，內(nèi)標(biāo)氘代脫氧膽酸稀釋濃度為104nmol/L，內(nèi)標(biāo)氘代熊脫氧膽酸稀釋濃度為126nmol/L，作為工作液。(1)標(biāo)準(zhǔn)品制備：分別取0.1mL9個(gè)不同濃度的膽汁酸乙腈溶液到1.5mLEP管中，再分別加入0.3mL低溫保存的含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸，氘代脫氧膽酸，氘代熊脫氧膽酸乙腈溶液，用旋渦混合器充分混合后，用1mL的移液槍轉(zhuǎn)移0.3mL含內(nèi)標(biāo)氘代的膽汁酸乙腈溶液到另外一個(gè)1.5mLEP管，然后用離心濃縮冷凍系統(tǒng)凍干；凍干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合組分使用低溫離心機(jī)在18000g離心力4℃下離心5min，取上清液于96孔板用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；(2)高效液相色譜分離：利用超高壓液相色譜以及相應(yīng)的流動(dòng)相，在反向C18分析柱上對(duì)樣品上清液中游離型膽汁酸進(jìn)行色譜洗脫分離，通過(guò)控制洗脫條件，分離出5種游離型膽汁酸；液相色譜條件為：色譜柱：WatersACQUITYUPLCC18Column:poresizeparticlesize1.7μm,2.1mm×50mm；cat.#186002350IVD；色譜柱柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10μL；流速：0.4mL/min；流動(dòng)相組成：A相為0.1％甲酸水溶液，即甲酸在混合液中的體積占比為0.1％，B相為0.1％甲酸-乙腈：甲醇＝3：1，即甲酸和乙腈的混合液與甲醇的體積比為3:1,其中甲酸在甲酸和乙腈的混合液中體積占比為0.1％，采用梯度洗脫方式，見(jiàn)表1或表2；(3)質(zhì)譜檢測(cè)并制標(biāo)準(zhǔn)曲線：液相色譜上分離出的5種游離型膽汁酸進(jìn)入到三重四級(jí)桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，然后利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式檢測(cè)5種游離型膽汁酸的含量，并畫(huà)制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)不同的色譜洗脫時(shí)間，設(shè)置不同的檢測(cè)窗口以及參數(shù)，每一種物質(zhì)的檢測(cè)參數(shù)均先用標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化，然后利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜中的多重反應(yīng)監(jiān)控模式以及優(yōu)化好的特定質(zhì)譜參數(shù)特異性地檢測(cè)五種游離型膽汁酸。質(zhì)譜為WatersXevoTQDIVD(Waters,Milford,MA)；質(zhì)譜檢測(cè)條件如下：電噴霧針電壓：3.0kV，去溶劑氣流速：800L/h，去溶劑氣溫度：400℃，錐孔氣流速：50L/h，檢測(cè)為負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)控，每個(gè)待測(cè)物的特定反應(yīng)離子對(duì)、駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞能量等如表3所示(不同類型儀器，碰撞能量、錐孔電壓值有所不同，需要獨(dú)立優(yōu)化)。多重反應(yīng)監(jiān)控通過(guò)兩次篩選，即第一個(gè)四級(jí)桿進(jìn)行特定母離子篩選，第二個(gè)四級(jí)桿進(jìn)行母離子碎裂產(chǎn)生子離子，第三個(gè)四級(jí)桿進(jìn)行特定子離子篩選，具有非常好的檢測(cè)特異性。可以通過(guò)選擇反應(yīng)監(jiān)控檢測(cè)到的離子流，以及對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間，來(lái)確定游離型膽汁酸的檢測(cè)，再利用添加已知量的氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。樣品通過(guò)超高壓液相色譜分離后，不同的游離型膽汁酸在不同洗脫時(shí)間出峰，并且被質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)控模式檢測(cè)到，先后檢測(cè)到的物質(zhì)分別為：氘代熊脫氧膽酸，熊脫氧膽酸，氘代膽酸，膽酸，鵝脫氧膽酸，氘代脫氧膽酸，脫氧膽酸，石膽酸；膽酸保留時(shí)間為3.89min，氘代膽酸保留時(shí)間為3.87min，石膽酸保留時(shí)間為8.06min，脫氧膽酸保留時(shí)間為5.77min，氘代脫氧膽酸保留時(shí)間為5.76min，熊脫氧膽酸保留時(shí)間為3.61min，氘代熊脫氧膽酸保留時(shí)間為3.58min，鵝脫氧膽酸保留時(shí)間為5.57min。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖3至圖7；檢測(cè)限定義為信噪比>3，定量限定義為信噪比>10，保留時(shí)間為色譜洗脫出峰的絕對(duì)保留時(shí)間，所有檢測(cè)物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)R2均>0.99，每種游離型膽汁酸的保留時(shí)間，檢出限，定量限，線性范圍以及定量校正方程分別如圖4中所示。通過(guò)三日的精密度測(cè)試，包括低、中、高三個(gè)濃度，日內(nèi)日間精密度RSD均小于15％，如圖5所示，表明檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)。五種游離型膽汁酸的保留時(shí)間、檢測(cè)限、定量限、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)如下：表4五種游離型膽汁酸的日內(nèi)和日間精密度數(shù)據(jù)如下：表5(4)血清中游離型膽汁酸的檢測(cè)：取0.1mL血清樣品到1.5mLEP管中，再加入0.3mL低溫保存的含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸乙腈溶液，用旋渦混合器充分混合后，用1mL的移液槍轉(zhuǎn)移0.3mL含內(nèi)標(biāo)氘代膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代脫氧膽酸內(nèi)標(biāo)，氘代熊脫氧膽酸的膽汁酸乙腈溶液到另外一個(gè)1.5mLEP管，然后用真空冷凍干燥器凍干；凍干后加入一定量的含有乙腈的水溶液后，混合組分使用低溫離心機(jī)在18000g離心力4℃下離心5min，取上清液于96孔板用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜上樣分析；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析同步驟(2)和(3)，質(zhì)譜檢測(cè)得到游離型膽汁酸與內(nèi)標(biāo)的比值，將比值代入到定量校正方程，計(jì)算得到血清中游離型膽汁酸的含量。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及形變，而所有的這些改變以及形變都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3