本發(fā)明屬于藥物檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法。

背景技術(shù)：

乙酰谷酰胺具有維持神經(jīng)應(yīng)激能力，改善腦功能等作用。乙酰谷酰胺通過血腦屏障后首先在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)分解為γ-氨基丁酸（gaba）、谷氨酸。gaba從膠質(zhì)細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)釋放后與神經(jīng)元gaba受體結(jié)合，抑制突觸后神經(jīng)元興奮，并抑制興奮性氨基酸（eaa）的釋放，對抗興奮毒性，保護(hù)神經(jīng)；gaba可提高葡萄糖磷酸酯化酶的活性，促進(jìn)葡萄糖的代謝；gaba還可以促進(jìn)乙酰膽堿的合成，改善神經(jīng)細(xì)胞代謝，具有維持神經(jīng)應(yīng)激能力，改善腦功能。乙酰谷酰胺還有降低血氨的作用，在星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽，成為重要的抗氧化劑，在腦缺血和神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中有著重要的神經(jīng)保護(hù)作用；

谷紅注射液（國藥準(zhǔn)字h22026638）是復(fù)方制劑，有效成分為乙酰谷酰胺和紅花提取物，具有抗凝血、抗血栓、舒張血管、改善微循環(huán)及抗氧自由基等作用。因此用科學(xué)、準(zhǔn)確的方法來評(píng)估乙酰谷酰胺的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，了解其代謝產(chǎn)物和途徑對于谷紅注射液和乙酰谷酰胺的臨床運(yùn)用具有重要意義；

液質(zhì)聯(lián)用（lc-ms）技術(shù)可對相關(guān)成分進(jìn)行在線分析檢測，給出豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息，且由于其選擇性強(qiáng)、碎片離子重現(xiàn)性好，對推測未知代謝物結(jié)構(gòu)有重要意義，而且比目前采用化學(xué)結(jié)構(gòu)分析手段更快速、更靈敏。四極桿-線性離子阱型串聯(lián)質(zhì)譜儀具有比較明顯的特點(diǎn)，它既保留三重四極桿型的所有功能,如子離子掃描(pros)、母離子掃描(pres)、中性丟失掃描(nls)以及多反應(yīng)監(jiān)測或選擇反應(yīng)監(jiān)測(mrm或srm)；又增加離子阱的多級(jí)子離子掃描功能，并且使全掃描方式的靈敏度提高。另外，還增加增強(qiáng)型全掃描(ems)、增強(qiáng)型子離子掃描(epi)、增強(qiáng)分辨率的q3掃描(erms)、時(shí)間延遲碎裂掃描(tdf)和多電荷增強(qiáng)掃描等功能；以及自動(dòng)切換掃描(ida)等軟件功能。同時(shí)克服傳統(tǒng)3d離子阱的一些缺點(diǎn)，如低質(zhì)量截止現(xiàn)象(1/3效應(yīng))、碰撞效率低和定量分析性能較差等。因此，這種qtrap型是一種集多種特異的定性功能與定量分析功能于一體的串聯(lián)質(zhì)譜儀，可廣泛地應(yīng)用于藥物分析、藥物代謝產(chǎn)物的定性定量分析及新藥開發(fā)研究等多種領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法，具體采用四極桿-線性離子阱型串聯(lián)質(zhì)譜儀，結(jié)合mim-ida和q3mi-ida掃描方法，在一針進(jìn)樣中同時(shí)完成乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法；

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法，所述方法包括以下步驟：

(1)谷紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為8～15mg/kg。5min～8h分時(shí)間點(diǎn)靜脈采血，血樣置肝素化離心管中，離心分離血漿；

(2)血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿，加乙腈，血漿與乙腈體積比1：3～3.5，旋渦混勻，離心，取上清作為樣品待測；

(3)采用高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進(jìn)行檢測分析，儀器條件如下：

a、色譜條件：shimadzu20adxr；

柱溫:40～60oc；

流速:0.5～1.0ml/min；

流動(dòng)相a:水（5mm乙酸銨,ph4.0～6.2）；

流動(dòng)相b:乙腈；

色譜柱及洗脫方式：behamide柱，梯度洗脫：水相5%-60%；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500；

掃描模式scanmode：esinegativemode；

氣簾氣cur:25psi；

噴霧電壓is:5500v；

離子源溫度tem:500～650℃；

霧化氣gs1:60psi；

加熱氣gs2:60psi；

碰撞氣cad:medium；

(4)根據(jù)乙酰谷酰胺代謝特點(diǎn)，質(zhì)譜采用mim-ida和q3mi-ida方法檢測，multipleionmonitoring(mim)為預(yù)掃描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。qtrap?系統(tǒng)結(jié)合lightsight?軟件進(jìn)行代謝物鑒定；

進(jìn)一步，所述步驟（1）中，谷紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h。分時(shí)間點(diǎn)靜脈采血，血樣置肝素化離心管中，5000r/min離心分離血漿；

所述步驟（2）中，血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿200μl，加乙腈，血漿與乙腈體積比1：3.5，旋渦混勻30s，12000r離心10min，取上清作為樣品待測；

所述步驟（3）中，柱溫:40oc，流速:0.5ml/min；

所述步驟（3）中，流動(dòng)相a:水（5mm乙酸銨，ph6.2）；

所述步驟（3）按以下方法操作：梯度洗脫條件：0～1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為5%；1～5min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從5%增加為10%；5～10min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從10%增加到60%；10～12min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為60%，12～12.1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從60%減少到5%，12.1min之后，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)保持5%。梯度洗脫中，流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)之和為100%；

所述步驟（3）中，離子源溫度tem:575℃；

更具體的，優(yōu)選本發(fā)明方法按以下步驟操作：

(1)取谷紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h分時(shí)間點(diǎn)靜脈采血，血樣置肝素化離心管中，5000r/min離心分離血漿；

(2)血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿200μl，加乙腈，血漿與乙腈體積比1：3.5，旋渦混勻30s，12000r離心10min，取上清作為樣品待測；

(3)采用四極桿-線性離子阱型串聯(lián)質(zhì)譜儀，結(jié)合mim-ida和q3mi-ida掃描方法對樣品進(jìn)行檢測分析，儀器條件如下：

a、色譜條件：shimadzu20adxr；

柱溫:40oc；

流速:0.5ml/min；

流動(dòng)相a:水（5mm乙酸銨,ph6.2）；

流動(dòng)相b:乙腈；

色譜柱及洗脫方式：behamide柱，梯度洗脫：0～1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為5%；1～5min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從5%增加為10%；5～10min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從10%增加到60%；10～12min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為60%，12～12.1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從60%減少到5%，12.1min之后，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)保持5%。梯度洗脫中，流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)之和為100%；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500；

掃描模式scanmode：esinegativemode；

氣簾氣cur:25psi；

噴霧電壓is:5500v；

離子源溫度tem:575℃；

霧化氣gs1:60psi；

加熱氣gs2:60psi；

碰撞氣cad:medium；

(4)根據(jù)乙酰谷酰胺代謝特點(diǎn)，質(zhì)譜采用mim-ida和q3mi-ida方法檢測，multipleionmonitoring(mim)為預(yù)掃描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。此模式采用q3和q1設(shè)置為相同質(zhì)荷比的mrm方法，實(shí)驗(yàn)中檢測101對離子對。質(zhì)量范圍為100.1da-200.1da，該模式下不需要預(yù)測可能的生物轉(zhuǎn)化過程。為避免母離子在q2碰撞池碎裂，將ce設(shè)置為5v。每對離子對駐留和停頓時(shí)間設(shè)為1毫秒，一個(gè)掃描周期需要0.8秒。qtrap^?系統(tǒng)結(jié)合lightsight^?軟件進(jìn)行代謝物鑒定；

本檢測方法發(fā)現(xiàn)通過mim-ida-epi采集模式檢測到3種乙酰谷酰胺在體內(nèi)的可能代謝產(chǎn)物（乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸）。乙酰谷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品中均可發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間不同的3個(gè)異構(gòu)體峰，其二級(jí)譜圖一致。除乙酰谷酰胺外，乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸均為內(nèi)源性物質(zhì)。因此，其藥時(shí)曲線與一般外源性藥物代謝產(chǎn)物的藥時(shí)曲線不同。實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸。推測可能是因?yàn)榻M織分布不同，γ-氨基丁酸更多的存在于神經(jīng)系統(tǒng)中。此方法靈敏度高、可靠、快速，該方法的建立為今后同類藥物的定性定量分析提供基礎(chǔ)；

下面將結(jié)合附圖、實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1：乙酰谷酰胺在負(fù)離子模式下二級(jí)譜圖；

圖2：乙酰谷酰胺可能代謝途徑圖；

圖3：乙酰谷酰胺質(zhì)譜圖和在血漿中的時(shí)間變化曲線圖；

圖4：乙酰谷氨酸質(zhì)譜圖和在血漿中的時(shí)間變化曲線圖；

圖5：谷氨酰胺質(zhì)譜圖和在血漿中的時(shí)間變化曲線圖；

圖6：谷氨酸質(zhì)譜圖和在血漿中的時(shí)間變化曲線圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案、積極效果更加清楚明白，通過以下實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下對于具體實(shí)施方案的描述僅用于解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明；

一種乙酰谷酰胺代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法

一、儀器：

四極桿-線性離子阱型串聯(lián)質(zhì)譜儀（液相shimadzu20adxr，質(zhì)譜absciexqtrap4500）；

二、樣品準(zhǔn)備：

取谷紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為10mg/kg，5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h分時(shí)間點(diǎn)靜脈采血，血樣置肝素化離心管中，5000r/min離心分離血漿。微量加樣器吸取血漿200μl，加乙腈，血漿與乙腈體積比1：3.5，旋渦混勻30s，12000r離心10min，取上清作為樣品待測；

三、檢測條件：

采用四極桿-線性離子阱型串聯(lián)質(zhì)譜儀，結(jié)合mim-ida和q3mi-ida掃描方法對樣品進(jìn)行檢測分析，儀器條件如下：

a、色譜條件：shimadzu20adxr；

柱溫:40oc；

流速:0.5ml/min

流動(dòng)相a:水（5mm乙酸銨,ph6.2）；

流動(dòng)相b:乙腈；

色譜柱及洗脫方式：behamide柱，梯度洗脫：0～1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為5%；1～5min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從5%增加為10%；5～10min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從10%增加到60%；10～12min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)為60%，12～12.1min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)從60%減少到5%，12.1min之后，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)保持5%。梯度洗脫中，流動(dòng)相a和流動(dòng)相b的體積分?jǐn)?shù)之和為100%；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500；

掃描模式scanmode：esinegativemode；

氣簾氣cur:25psi；

噴霧電壓is:5500v；

離子源溫度tem:575℃；

霧化氣gs1:60psi；

加熱氣gs2:60psi；

碰撞氣cad:medium；

四、分析方法

根據(jù)乙酰谷酰胺代謝特點(diǎn)，質(zhì)譜采用mim-ida和q3mi-ida方法檢測，multipleionmonitoring(mim)為預(yù)掃描模式，采用mim-ida-epi的工作流程。此模式采用q3和q1設(shè)置為相同質(zhì)荷比的mrm方法，實(shí)驗(yàn)中檢測101對離子對。質(zhì)量范圍為100.1da-200.1da，該模式下不需要預(yù)測可能的生物轉(zhuǎn)化過程。為避免母離子在q2碰撞池碎裂，將ce設(shè)置為5v。每對離子對駐留和停頓時(shí)間設(shè)為1毫秒，一個(gè)掃描周期需要0.8秒。qtrap^?系統(tǒng)結(jié)合lightsight^?軟件進(jìn)行代謝物鑒定；

乙酰谷酰胺代謝物鑒定小結(jié)：

①通過mim-ida-epi采集模式檢測到3種乙酰谷酰胺在體內(nèi)的可能代謝產(chǎn)物（乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸）；

②乙酰谷酰胺標(biāo)準(zhǔn)品和血漿樣品中均可發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間不同的3個(gè)異構(gòu)體峰，其二級(jí)譜圖一致；

③除乙酰谷酰胺外，乙酰谷氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸均為內(nèi)源性物質(zhì)。因此，其藥時(shí)曲線與一般外源性藥物代謝產(chǎn)物的藥時(shí)曲線不同；

④實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸。推測可能是因?yàn)榻M織分布不同，γ-氨基丁酸更多的存在于神經(jīng)系統(tǒng)中；

此方法靈敏度高、可靠、快速，該方法的建立為今后同類藥物的定性定量分析提供基礎(chǔ)；本說明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容，屬于本專業(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。