本發(fā)明利用gc-ms技術篩選植物樣本在不同組間中存在差異性的揮發(fā)性物質的方法，具體涉及香精香料、代謝組學研究技術領域。

背景技術：

天然植物香精香料中呈香呈味物質主要是植物自然生長環(huán)境下的次生代謝產(chǎn)物，由于地域、氣候、品種等因素的差別，即使由同一種植物采用相同工藝制成的香精香料成品，其呈現(xiàn)出來的感官也存在較大差異。通過研究植物中具有差異性的代謝產(chǎn)物，則能夠篩選出對外在感官品質具有重要作用的化學物質成分，對于香精香料的加工具有重要的實際意義。由于植物中具有上千種化學成分，利用gc-ms非靶標代謝分析方法能夠更為全面地表征植物中的揮發(fā)性香味成分，如何從復雜繁瑣的物質中快速篩選出具有差異性的代謝產(chǎn)物，是一個非常困難的工作。

目前時間范圍內能夠實現(xiàn)gc-ms分析物質準確提取分析，進而用于篩查不同組別之間具有差異性化學成分的方法非常少，當前能夠完成這一工作的方法有amdis-met-idea，xcms等。這些方法中存在大量的假陽性和假陰性問題，導致利用這些方法進行分析時，難免會漏掉重要的物質信息，進而導致所篩選出的差異性代謝物無法有效表征組別差異，對明確呈香呈味成分幫助不大。本發(fā)明針對當前分析方法中存在的苦難，提出了一個新的分析方法，用于快速篩查植物差異性代謝物。該方法利用現(xiàn)代gc-ms全掃描技術獲得植物中揮發(fā)性物質化學組分信息，隨后利用多尺度高斯平滑提取tic圖中物質信息，根據(jù)物質的質譜信息，采用動態(tài)時間規(guī)劃校正樣本間的時間漂移，使得物質信息在不同樣本間具有可比性，然后采用最近鄰聚類實現(xiàn)化合物注冊，最后采用多元統(tǒng)計分析篩選不同組之間具有顯著性差異的化合物。物質的質譜信息輸出為msp文件，可直接導入到nist庫搜索化學物。該方法能夠實現(xiàn)快速篩查植物樣本中差異性化合物信息，適用于大批量樣本快速分析測定。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種方法，找出植物差異性代謝物的方法。

該方法利用現(xiàn)代gc-ms全掃描技術獲得植物中不同揮發(fā)性物質化學組分信息，利用多尺度高斯平滑提取tic圖中物質信息，根據(jù)物質的質譜信息，采用動態(tài)規(guī)劃算法校正樣本間的時間漂移，對齊屬于同一物質的色譜峰，使得物質信息在不同樣本間具有可比性，采用最鄰近聚類實現(xiàn)化合物注冊，最后采用多方差分析篩選不同組之間具有顯著性差異的化合物，并將質譜信息輸出為msp文件，該文件可直接導入至nist庫進行化合物匹配。該方法適用于大批量樣本快速分析測定。

一種gc-ms非靶標方法快速篩查植物差異性代謝物的方法，其特征在于，針對gc-ms中的tic進行分析，提取其中的物質信息并進行分析，具體包括以下步驟：

(1)收集待區(qū)分的不同組別的植物樣本(可以為不同產(chǎn)地、不同批次等)；

(2)對收集的每一個植物樣本進行前處理，過程為：

樣本冷凍干燥后，粉碎處理，過60目篩；稱量樣本1g，加入濃度為100μg/ml氘代苯乙酮溶液100μl作為內標，氘代苯乙酮溶液是以甲醇為溶劑，然后加入二氯甲烷5ml作為提取液，提取植物樣本化學成分，渦旋3min、超聲1h后，13000r/min離心10min，取1ml上清液，加入100μlbstfa衍生化試劑，于60℃環(huán)境下衍生1h。隨后進入gc-ms進行分析；

(3)gc-ms分析條件為:

色譜條件：色譜柱為agilentdb-5ms柱(60m×2.5mm,i.d.,2.5μm)。程序升溫，初始柱溫50℃，以5℃/min升溫至300℃。進樣口溫度280℃，傳輸線溫度230℃。he氣作為載氣，分流比為10:1，流速為1ml，進樣量1μl；

質譜條件：ei源，全掃模式，掃描范圍50-500，采樣頻率3points/s；

(4)對步驟(3)所有樣本經(jīng)過gc-ms分析后的原始采集的數(shù)據(jù)轉化為cdf格式，然后進行數(shù)據(jù)分析，針對每個樣本中物質信息的提取分為色譜峰提取和質譜信息表征；

色譜峰提取部分步驟為：(i)提取色譜信號中的局部極小值(一般絕大多數(shù)局部極小值對應為儀器噪聲)，利用迭代優(yōu)化剔除屬于色譜峰的極小值；然后再將剩余的對應于儀器噪聲的極小值，通過線性差值完成tic圖中的基線漂移校正；(ii)針對非儀器噪聲的物質色譜信號為局部極大值的特點，采用不同尺度的高斯函數(shù)對基線漂移校正后的色譜信號進行平滑卷積運算(高斯函數(shù)尺度范圍1-13，步長為0.1)，獲得平滑后的信號，提取出各尺度平滑后色譜信號的局部極大值，通過脊線尋優(yōu)的方法，將不同平滑尺度下的局部極大值位置鏈接在一起得到色譜，并獲得物質色譜峰位置；

質譜信息表征：對色譜峰提取部分的步驟(ii)通過脊線尋優(yōu)方法得到的色譜，在提取物質色譜峰信號后，根據(jù)剩余的信號部分估計出儀器噪聲水平，剔除信噪比小于3的色譜峰；針對每一個物質色譜峰，提取保留時間下的質譜譜圖，用于表征該物質；

(5)不同樣本間的時間漂移校正

選擇物質色譜峰數(shù)量最多的樣本作為參照樣本，對其余樣本中的時間漂移逐個校正，使得屬于同一個物質的色譜峰進行對齊；將所有樣本中的時間漂移校正后，利用最鄰近聚類方法將保留時間較為接近的物質注冊成一個化合物，最終建立一個樣本和色譜峰的注冊圖或表；經(jīng)過內標校正后，用于后續(xù)的分析；

進一步優(yōu)選樣本的時間漂移的校正采用如下方法：利用物質的質譜信號，通過計算相關系數(shù)來表征其相似度，兩個質譜信號的相似度越高，則屬于同一個化學成分的可能性就越大，針對每一個測試樣本，均構建一個“測樣物質×參照物質”的相似度矩陣，針對每一個相似度矩陣，利用動態(tài)規(guī)劃算法，獲得一組測樣色譜峰和參照色譜峰唯一匹配的結果(注：該組匹配結果的質譜相似度總和最大)，從而實現(xiàn)時間漂移校正。

(6)利用方差分析計算樣本間差異性大的物質，置信水平閾值設定為0.05，將置信水平小于0.05的物質視作差異性化合物，將所有差異性物質的質譜信息輸入成msp文件，導入到nist庫中進行匹配，確定物質結構，從而得到差異性物質；然后通過色譜的峰面積確定含量差異。

同經(jīng)典方法相比，本方法的優(yōu)勢在于色譜峰信號經(jīng)過背景漂移校正后，結合高斯平滑脊線提取優(yōu)化方法，并利用噪聲估計剔除信噪比低的色譜峰，能夠有效避免假陽性和假陰性的色譜峰提取結果。本發(fā)明中提出的利用質譜相似度結合動態(tài)規(guī)劃算法實現(xiàn)樣本間色譜峰對齊工作，能夠克服時間漂移導致無法獲得準確結果的問題，使得樣本間的結果具有直接的可以比。此外，本發(fā)明能夠實現(xiàn)植物樣本中具有差異性代謝物的快速篩查，降低工作量，提高分析效率。

附圖說明

圖1.本發(fā)明的色譜峰提取結果示例。(a)給出了某一樣本的部分原始信號以及不同尺度高斯函數(shù)平滑后的信號。局部極大值用’o’標出。(b)給出了脊線尋優(yōu)獲得色譜峰位置，并標記于圖(c)中。通過估計噪聲水平，提出信噪比低于3的色譜峰后，最終提取出的色譜峰(d)(其中數(shù)字代表9個不同的峰)。圖2.本發(fā)明時間漂移校正原理示例。(a)給出了對照樣和一個測樣中的部分時間漂移色譜峰。(b)給出了測樣中每一個物質與對照樣本中質譜的相關系數(shù)。箭頭給出了動態(tài)規(guī)劃算法下的幾個候選路徑。(c)經(jīng)過動態(tài)規(guī)劃算法，最終實現(xiàn)了的色譜峰對齊結果。(其中數(shù)字對應不同的峰號，a、b、c的數(shù)字一一對應)；

圖3.時間漂移校正前后對比示例。(a)30個茶葉樣本的tic圖。(b)經(jīng)過時間漂移校正后，色譜峰的對齊結果。(c)時間漂移校正前，每一個樣本中色譜的色譜峰流出狀況。(d)經(jīng)過本發(fā)明進行時間漂移校正后，各色譜峰的對齊情況。(e)在時間漂移校正基礎上，利用最近鄰聚類獲得的色譜峰注冊示例圖。圖4.利用本發(fā)明篩選出的差異性代謝物在兩個產(chǎn)地上的含量上的差異示例，以及利用這些差異性代謝物進行聚類的結果。

圖5.本發(fā)明解析gc-ms所得代謝物nist庫匹配結果示例。

圖6.本發(fā)明同文獻以及人工分析的直接對比。

具體實施方式

下面結合具體的示例對本發(fā)明方法做進一步的詳細說明，以使相關領域技術人員更加清楚地理解本發(fā)明，本發(fā)明并不限于以下實施例，以下內容不應理解為是對本發(fā)明的權利要求書保護的范圍限制。

實施例1

將來自2個地區(qū)的共30個茶葉樣本于-80℃下冷凍除水，隨后通過粉碎機粉碎，過60目篩，于-20℃下避光保存。樣本分析前，轉移至室溫放置半小時。

針對每一個茶葉樣本，加入濃度為100μg/ml氘代苯乙酮溶液(甲醇定容)100μl作為內標，加入二氯甲烷5ml作為提取液，提取植物樣本化學成分。渦旋3min、超聲1h后，13000r/min離心10min，取1ml上清液，加入100μlbstfa衍生化試劑，于60℃環(huán)境下衍生1h。隨后進入gc-ms進行分析。

設置gc-ms分析條件:

色譜條件：色譜柱為agilentdb-5ms柱(60m×2.5mm,i.d.,2.5μm)。程序升溫，初始柱溫50℃，以5℃/min升溫至300℃。進樣口溫度280℃，傳輸線溫度230℃。he氣作為載氣，分流比為10:1，流速為1ml，進樣量1μl。

質譜條件：ei源，全掃模式，掃描范圍50-500，采樣頻率3points/s。

所有樣本經(jīng)過gc-ms分析后，將原始采集的數(shù)據(jù)轉化為cdf格式。進入matlab平臺進行分析。

在matlab環(huán)境中利用本發(fā)明進行分析。這一過程全自動完成，直接給出結果不同組織間的聚類結果和化合物質譜信息的msp文件。

為解釋本發(fā)明具體工作原理，圖1給出了本發(fā)明進行色譜峰提取示例。其中圖(a)給出了原始信號以及不同尺度高斯函數(shù)平滑后的信號。色譜信號中的色譜峰在不同高斯平滑尺度下愈加明顯。經(jīng)過(b)脊線尋優(yōu)后，可以清晰地看出色譜峰獲得的提取(c)。通過過濾掉信噪比低于3的色譜峰，能夠實現(xiàn)色譜信號中色譜峰的提取(d)。

圖2中給出了本發(fā)明進行時間漂移校正原理，圖(a)中給出了色譜峰提取結果，其中的插圖給出了參照4號色譜峰和測樣4號色譜峰的質譜圖及其相關系數(shù)：0.9969。圖(b)給出了動態(tài)規(guī)劃算法進行搜索最優(yōu)路徑示例，在多個候選路徑中，動態(tài)規(guī)劃算法選擇質譜相關系數(shù)加和最大的路徑。最終，給出圖(c)中的匹配結果。

為進一步闡明時間漂移校正的重要性，圖3給出時間漂移校正前后的結果進行對比。圖(a)中給出了gc-ms采集的tic圖，圖(b)給出了本發(fā)明進行時間漂移校正后的色譜峰對齊的結果。詳細的對比展示于圖(c)和圖(d)中，圖(c)給出了時間漂移校正前的色譜峰流出區(qū)間范圍，從圖中可以看出各樣本流出峰范圍不同，時間漂移嚴重，難以區(qū)分不同樣本中屬于不同化合物的色譜峰。經(jīng)過本方法校正后，能夠將屬于同一物質的色譜峰準確區(qū)分(d)。圖(e)給出了在時間校正基礎上，利用最近鄰聚類獲得注冊色譜峰結果。

利用本發(fā)明將注冊色譜峰結果用內標進行校正后，對注冊的色譜峰進行方差分析，最終獲得具有差異性的色譜峰，圖4(a)給出了10中存在差異的代謝物，其中a地區(qū)7種化合物高于b地區(qū)。利用這些差異性成分進行聚類分析，能夠將兩個地區(qū)的樣本進行區(qū)分，見圖b。

將差異性化合物信息寫入msp文件，導入至nist庫中進行搜索，圖5給出了匹配結果的一個示例。

將本發(fā)明同當前文獻中報道的方法進行了比較，結果展示于圖6中。從中可以看出，本發(fā)明給出的效果最優(yōu)。