本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的制備方法。

背景技術(shù)：

葡萄糖是動植物體內(nèi)碳水化合物的主要組成部分，其定量測定在生物化學(xué)、臨床化學(xué)和食品分析中具有重要的地位。葡萄糖傳感器是生物傳感器領(lǐng)域研究最多的生物傳感器。目前以葡萄糖氧化酶為基礎(chǔ)的酶電極葡萄糖傳感器正受到越來越廣泛的關(guān)注。

葡萄糖氧化酶酶(GOx)是一種能對β-D-葡萄糖進(jìn)行專一性催化的高分子物質(zhì)。利用其高催化活性和生物分子識別的特點，GOx常被選為葡萄糖傳感器中首選的活性物質(zhì)，具體機理為：葡萄糖氧化酶酶(GOx)氧化葡萄糖為葡萄糖酸，并且放出電子，同時溶液中的氧氣被還原為過氧化氫，通過檢測生成的過氧化氫能夠反映葡萄糖的含量。

現(xiàn)有技術(shù)中，將葡萄糖氧化酶酶(GOx)固定在具有生物相容性的電極表面可發(fā)生一個相當(dāng)快的電子傳遞反應(yīng)，利用該電子傳遞性質(zhì)可以對底物分子進(jìn)行電化學(xué)測定。然而，葡萄糖氧化酶酶(GOx)的氧化還原活性中心黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)被包埋在一層厚厚的蛋白質(zhì)中，不能接近電極表面，難以實現(xiàn)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)與電極間的快速的電子傳遞。因此如何對電極表面進(jìn)行修飾和處理，在實現(xiàn)固定葡萄糖氧化酶的同時，能夠減小葡萄糖氧化酶酶(GOx)的活性中心與電極表面之間的距離，進(jìn)而實現(xiàn)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的快速電子傳遞，成為葡萄糖傳感器應(yīng)用需要解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的制備方法，該制備方法制得的葡萄糖傳感器酶電極能夠?qū)崿F(xiàn)黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)與電極間的快速的電子傳遞，具有線性范圍廣、性能穩(wěn)定、靈敏度高、生物相容性好的特點。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的制備方法，包括如下步驟：

步驟A：制備碳包覆磁性鐵氧體；

A1：將草酸亞鐵溶解于酸溶液中制得草酸亞鐵酸性溶液，在惰性氣體氛圍下攪拌均勻，并逐滴加入三乙胺至溶液顏色不再加深為止，繼續(xù)攪拌至溶液中產(chǎn)生墨綠色顆粒，得到第一混合溶液；

A2：將氧化石墨經(jīng)超聲處理溶解于去離子水中制得氧化石墨溶液；將所述第一混合溶液與氧化石墨溶液混合制得第二混合溶液，在惰性氣體氛圍下攪拌6～24小時，然后將溶液濾出后充分洗滌磁性產(chǎn)物，將所述磁性產(chǎn)物在真空條件下進(jìn)行高溫處理，制得碳包覆磁性鐵氧體；

步驟B：制備葡萄糖傳感器酶電極；

將步驟A制得的碳包覆磁性鐵氧體溶解于去離子水中制得碳包覆磁性鐵氧體懸浮液，然后將碳包覆磁性鐵氧體懸浮液滴蘸在經(jīng)過預(yù)處理的工作電極上，常溫條件下在惰性氣體氛圍中進(jìn)行干燥處理；然后將葡萄糖氧化酶溶解于pH緩沖液配制得到葡萄糖氧化酶溶液，所述pH緩沖液的pH值為6.8～7.4，采用物理吸附法將葡萄糖氧化酶固定在所述工作電極上，經(jīng)干燥處理得到葡萄糖傳感器酶電極。

本發(fā)明中步驟A中酸溶液的pH值為3～6，優(yōu)選為pH＝4的酸溶液；具體組成可以包括稀鹽酸、稀硫酸等。

本發(fā)明中步驟A中工作電極可以為任何合適的惰性電極，具體為玻碳電極、金電極或者鉑電極，作為優(yōu)選實施方式，選擇玻碳電極作為工作電極。

本發(fā)明中步驟A中氧化石墨可以直接采用市售氧化石墨，也可以將石墨粉在酸性條件下氧化制備而成，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實施例，氧化石墨的制備方法如下：將石墨粉與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98％的濃硫酸(簡稱為98％濃硫酸)混合，其中：石墨粉與98％濃硫酸的混合比例為1g石墨粉與20mL～25mL98％濃硫酸混合，將上述混合溶液置于冰水浴中混合均勻；依次加入硝酸鈉和高錳酸鉀，使得硝酸鉀、高錳酸鉀與石墨粉的質(zhì)量比為0.5～1∶5～8∶2，在常溫下對溶液進(jìn)行攪拌，繼而對溶液升溫進(jìn)行攪拌，然后加入去離子水進(jìn)行稀釋后升溫至95℃～100℃攪拌均勻，最后加適量去離子水和適量質(zhì)量份數(shù)為30％的過氧化氫溶液終止反應(yīng)；靜置處理后除去上清液得到產(chǎn)物，將上述產(chǎn)物進(jìn)行離心處理(轉(zhuǎn)速為8000rpm～12000rpm)，離心所得產(chǎn)物首先通過多次酸洗處理，然后再通過多次水洗處理，水洗至溶液無SO₄^2-被檢測出為止；最終通過干燥處理得到氧化石墨(烘干溫度為40℃～80℃)。

本發(fā)明中步驟A中氧化石墨溶液的濃度為0.5mg/mL～2mg/mL。

本發(fā)明中步驟A中第二混合溶液中碳元素與鐵元素的質(zhì)量比為1∶4～11，最佳比例為10∶78。

通過調(diào)控草酸亞鐵、三乙胺和氧化石墨之間的不同配比，能夠得到具有不同的磁性和結(jié)構(gòu)特征的碳包覆磁性鐵氧體。

本發(fā)明中步驟A中高溫處理的溫度為120℃～200℃，處理時間為8～24小時。

本發(fā)明中步驟B中碳包覆磁性鐵氧體懸浮液的濃度為0.5mg/mL～2mg/mL。

本發(fā)明中步驟B中葡萄糖氧化酶溶液的濃度為1mg/mL～10mg/mL。

本發(fā)明中步驟B中pH緩沖液是通過磷酸二氫鈉或者磷酸二氫鉀與磷酸氫二鈉或者磷酸氫二鉀共同溶解于水中配制而成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種新型制備碳包覆磁性鐵氧體的方法，并將其運用在制作葡萄糖傳感器酶電極中，基于碳包覆磁性鐵氧體具有比表面積大、生物相容性好的特點，采用碳包覆磁性鐵氧體修飾酶電極有利于葡萄糖氧化酶的固定，增加電極表面酶的負(fù)載量；同時，本發(fā)明采用磁性功能化石墨，其表面顆粒具有粒徑小、導(dǎo)電性好、吸附能力強的特點，減少了葡萄糖氧化酶活性中心與電極之間的距離，有利于電子快速傳遞。根據(jù)本發(fā)明具體實施例可以看出本發(fā)明提供的基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極能夠?qū)舛仍?.5～10mM范圍內(nèi)的葡萄糖溶液進(jìn)行檢測，并且具有性能穩(wěn)定、靈敏度高的優(yōu)勢。此外，本發(fā)明提供的制備基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的方法流程簡單，成本低廉，可廣泛應(yīng)用于臨床、醫(yī)藥以及食品工業(yè)等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例制得氧化石墨的掃描電鏡圖。

圖2是本發(fā)明實施例制得碳包覆磁性鐵氧體的掃描電鏡圖。

圖3是本發(fā)明實施例制得碳包覆磁性鐵氧體的能量色散譜(EDAX)。

圖4是本發(fā)明實施例制得碳包覆磁性鐵氧體的X射線衍射圖。

圖5是碳包覆磁性鐵氧體葡萄糖傳感器酶電極和未滴加碳包覆磁性鐵氧體懸浮液制備的酶電極在緩沖液中50mV/s下的循環(huán)伏安曲線圖。

圖6是在緩沖鹽中逐漸加入葡萄糖的傳感器計時電流曲線圖。

圖7是計時電流曲線的擬合曲線。

具體實施方式

以下通過具體實施例結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明：

實施例1：

制備氧化石墨的方法，具體包括如下步驟：

準(zhǔn)確稱量1克石墨粉與23mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98％的濃硫酸，將二者放于同一容器中，并置于4℃冰水浴中混合均勻；依次緩慢加入0.5g硝酸鈉和3g高錳酸鉀，在常溫下攪拌30分鐘，繼而將溶液升溫至35℃繼續(xù)攪拌30分鐘，然后緩慢加入去離子水升溫至98℃攪拌30分鐘，最后加入140mL去離子水和30mL質(zhì)量份數(shù)為30％的過氧化氫溶液終止反應(yīng)；靜置處理后除去上清液得到產(chǎn)物，將上述產(chǎn)物進(jìn)行離心處理(轉(zhuǎn)速為9000rpm)，離心所得產(chǎn)物首先通過1～2次酸洗處理，然后再通過多次水洗處理，直至溶液無SO₄^2-被檢測出為止；最終在50℃的溫度下烘干得到氧化石墨。

如圖1所示為本實施例制得氧化石墨的掃描電鏡圖，從圖中可以看出：制備的氧化石墨結(jié)構(gòu)疏松，呈多層結(jié)構(gòu)，適合磁性鐵氧體的生長。

實施例2：

一種基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的制備方法，包括如下步驟：

步驟A：制備碳包覆磁性鐵氧體；

A1：將草酸亞鐵溶解于pH＝4的酸溶液中制得濃度為0.04M的草酸亞鐵酸性溶液，在氮氣氛圍下攪拌均勻，并逐滴加入三乙胺(分析純，99％以上)至溶液顏色不再加深為止，繼續(xù)攪拌至溶液中產(chǎn)生墨綠色顆粒，得到第一混合溶液；

A2：將實施例1制得的氧化石墨溶解于去離子水中制得濃度為0.06mg/mL的氧化石墨溶液，在100W超聲儀中超聲處理30分鐘；將所述第一混合溶液與氧化石墨溶液等體積混合制得第二混合溶液，在惰性氣體氛圍下攪拌12小時，得到磁性產(chǎn)物；采用磁鐵將磁性產(chǎn)物吸附在反應(yīng)容器底部后將溶液濾出，然后充分洗滌所得磁性產(chǎn)物，將所述磁性產(chǎn)物置于溫度為150℃的真空環(huán)境中處理8小時，制得碳包覆磁性鐵氧體粉末；

經(jīng)檢測，本發(fā)明制得碳包覆磁性鐵氧體具有較好的磁性和清水性，即使在懸濁液狀態(tài)下也可以輕易地被磁鐵吸附；

如圖2、圖3和圖4所示分別為本實施例制得碳包覆磁性鐵氧體粉末的掃描電鏡照片、EDAX圖譜和X射線衍射圖，從圖2中可以看出：碳包覆磁性鐵氧體顆粒在氧化石墨的層狀結(jié)構(gòu)之間生長，具有很大的比表面性，適合葡萄糖氧化酶的吸附和固定；從圖3中可以看出：本發(fā)明制備的碳包覆磁性鐵氧體含有大量的碳、鐵和氧元素；從圖3中可以看出：衍射峰涵蓋了四氧化三鐵以及三氧化二鐵的鐵相峰。

步驟B：制備葡萄糖傳感器酶電極；

本實施例采用玻碳電極作為工作電極，優(yōu)選地，玻碳電極的直徑為3毫米，根據(jù)本領(lǐng)域人員公知常識，在制備操作進(jìn)行前還應(yīng)對電極進(jìn)行預(yù)處理步驟以除去玻碳電極上的雜質(zhì)，提高玻碳電極的電化學(xué)性能，具體操作為：依次采用分別通過3.0μm和0.05μm氧化鋁水漿處理過的拋光布進(jìn)行打磨得到光滑鏡面，然后依次在無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10分鐘，然后用氮氣吹干；

將碳包覆磁性鐵氧體溶解于去離子水中制得濃度為1mg/mL的碳包覆磁性鐵氧體懸浮液，然后使用移液管取2μL碳包覆磁性鐵氧體懸浮液滴蘸于上述經(jīng)預(yù)處理后的玻碳電極上，常溫條件下在惰性氣體氛圍中進(jìn)行干燥處理；

分別準(zhǔn)確稱取0.1mol磷酸二氫鈉和0.1mol磷酸氫二鈉，并將二者置于1L容量瓶中，以去離子水作為溶劑進(jìn)行標(biāo)定，配制得到pH緩沖液，量取0.1mL待用；

準(zhǔn)確稱取0.5mg葡萄糖氧化酶，然后溶解于上述0.1mL的pH緩沖溶液中，混合均勻，配制得到葡萄糖氧化酶溶液，然后使用移液管取0.5μL葡萄糖氧化酶溶液滴蘸于上述經(jīng)碳包覆磁性鐵氧體修飾的玻碳電極上，在溫度為4℃的氮氣環(huán)境中進(jìn)行干燥處理；待干燥處理完成后，將酶電極在上述pH緩沖液輕輕蘸取，移除未被固定的葡萄糖氧化酶，繼續(xù)在溫度為4℃的氮氣環(huán)境中進(jìn)行干燥處理，最終制得碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極。

本發(fā)明采用滴涂法制備碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極，根據(jù)實際操作需要，取液量并不做限制。在本實施例中，移液槍吸取碳包覆磁性鐵氧體懸浮液的體積為0.5～3μL，優(yōu)選為2μL；移液槍吸取吸取葡萄糖氧化酶溶液的體積為0.3～2μL，優(yōu)選為0.5μL。

將本實施例制得的葡萄糖傳感器酶電極組裝形成葡萄糖氧化酶生物傳感器，并在電化學(xué)工作站上測試該生物傳感器的性能；

本實施例采用鉑電極作為對電極，電極面積1cm²，采用Ag/AgCl標(biāo)準(zhǔn)電極作為參比電極，采用本實施制得的碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極作為工作電極，采用PBS溶液作為測試底液；在-0.65～0.5V的電位范圍下，對氮氣飽和的PBS溶液進(jìn)行循環(huán)伏安掃描；作為對照，本實施例還將未滴加碳包覆磁性鐵氧體懸浮液僅滴加等量葡萄糖氧化酶的玻碳電極置于同樣環(huán)境下進(jìn)行對比伏安循環(huán)掃描測試；循環(huán)伏安掃面的結(jié)果如圖6所示；從圖6中可以看出：在經(jīng)過碳包覆磁性鐵氧體修飾過的酶電極上獲得一系列明顯的葡萄糖氧化酶的氧化還原峰，而未滴加碳包覆磁性鐵氧體懸浮液的酶電極則沒有。這說明碳包覆磁性鐵氧體修飾的酶電極能夠有效地促進(jìn)葡萄糖氧化酶與電極之間的電子轉(zhuǎn)移。

將碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極置于PBS溶液中，然后逐漸加入葡萄糖，在-0.45V(相對于Ag/AgCl參比電極)的恒定電壓下測試響應(yīng)電流，得到如圖6所示計時電流響應(yīng)結(jié)果圖；從圖6中可以看出：隨著葡萄糖濃度的增加，碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的響應(yīng)電流階梯式增加。

圖7為外加電壓為-0.45V的計時電流響應(yīng)的校準(zhǔn)曲線，從圖7中可以看出：酶電極在0.5mol/L～10mol/L葡萄糖濃度范圍內(nèi)線性增加，酶電極的靈敏度為4.31μA/mmol。

實施例3：

一種基于碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極的制備方法，包括如下步驟：

步驟A：制備碳包覆磁性鐵氧體；

A1：將草酸亞鐵溶解于pH＝4的酸溶液中制得濃度為0.08M的草酸亞鐵酸性溶液，在氮氣氛圍下攪拌均勻，并逐滴加入三乙胺(分析純，99％以上)至溶液顏色不再加深為止，繼續(xù)攪拌至溶液中產(chǎn)生墨綠色顆粒，得到第一混合溶液；

A2：將市售的氧化石墨溶解于去離子水中制得濃度為0.1mg/mL的氧化石墨溶液，在100W超聲儀中超聲處理30分鐘；將所述第一混合溶液與氧化石墨溶液等體積混合制得第二混合溶液，在惰性氣體氛圍下攪拌12小時，得到磁性產(chǎn)物；采用磁鐵將磁性產(chǎn)物吸附在反應(yīng)容器底部后將溶液濾出，然后充分洗滌所得磁性產(chǎn)物，將所述磁性產(chǎn)物置于溫度為150℃的真空環(huán)境中處理8小時，制得碳包覆磁性鐵氧體粉末；

步驟B：制備葡萄糖傳感器酶電極；

本實施例采用玻碳電極作為工作電極，優(yōu)選地，玻碳電極的直徑為3毫米，根據(jù)本領(lǐng)域人員公知常識，在制備操作進(jìn)行前還應(yīng)對電極進(jìn)行預(yù)處理步驟以除去玻碳電極上的雜質(zhì)，提高玻碳電極的電化學(xué)性能，具體操作為：依次采用分別通過3.0μm和0.05μm氧化鋁水漿處理過的拋光布進(jìn)行打磨得到光滑鏡面，然后依次在無水乙醇和去離子水分別超聲清洗10分鐘，然后用氮氣吹干；

將碳包覆磁性鐵氧體溶解于去離子水中制得濃度為1mg/mL的碳包覆磁性鐵氧體懸浮液，然后使用移液管取1μL碳包覆磁性鐵氧體懸浮液滴蘸于上述經(jīng)預(yù)處理后的玻碳電極上，常溫條件下在惰性氣體氛圍中進(jìn)行干燥處理；

分別準(zhǔn)確稱取0.1mol磷酸二氫鈉和0.1mol磷酸氫二鈉，并將二者置于1L容量瓶中，以去離子水作為溶劑進(jìn)行標(biāo)定，配制得到pH緩沖液，量取0.1mL待用；

準(zhǔn)確稱取0.5mg葡萄糖氧化酶，然后溶解于上述0.1mL的pH緩沖溶液中，混合均勻，配制得到葡萄糖氧化酶溶液，然后使用移液管取0.5μL葡萄糖氧化酶溶液滴蘸于上述經(jīng)碳包覆磁性鐵氧體修飾的玻碳電極上，在溫度為4℃的氮氣環(huán)境中進(jìn)行干燥處理；待干燥處理完成后，將酶電極在上述pH緩沖液輕輕蘸取，移除未被固定的葡萄糖氧化酶，繼續(xù)在溫度為4℃的氮氣環(huán)境中進(jìn)行干燥處理，最終制得碳包覆磁性鐵氧體修飾的葡萄糖傳感器酶電極。

以上結(jié)合附圖對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了闡述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實施方式，上述具體實施方式僅僅是示意性的，而不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可做出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。