亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

對樣品中的靶分子進行檢測和定量的方法與流程

文檔序號:11261267閱讀:438來源:國知局
對樣品中的靶分子進行檢測和定量的方法與流程

本申請為國際申請日2012年3月19日、國際申請?zhí)杙ct/ep2012/054768于2013年9月23日進入中國國家階段、申請?zhí)?01280014694.3、發(fā)明名稱“對樣品中的靶分子進行檢測和定量的方法”的分案申請。

本發(fā)明涉及一種通過質譜法對樣品中的至少一種靶分子進行檢測和定量的方法。更具體地,本發(fā)明提供一種直接在樣品表面上通過使用質譜法成像、特別是基質輔助的激光解吸/電離(maldi)成像對靶分子進行檢測和定量的方法。

通常,本發(fā)明可以應用在其中對樣品中的分子進行定量是有用或必要的任何領域中。本發(fā)明可以應用在例如藥物領域中以對藥物在各種生物組織中的分布和藥動學進行研究。另外,本發(fā)明可以應用在農業(yè)化學領域中,特別是用于對諸如除草劑的分子在植物和/或環(huán)境(土壤、周圍地下水等)中的毒性和降解進行評估。



背景技術:

質譜法是化學和生物化學分析中廣泛已知并用于檢測和鑒定樣品中的目標分子的技術。近年來已經開發(fā)了質譜法分子成像例如maldi成像,使得可以直接在生物組織切片上將目標分子的分布可視化。maldi成像,由于其高靈敏度,使得可以直接在樣品表面上將非常大量的不同分子的分布同時可視化。在藥物領域中,這種技術使得例如可以對處理期間各種時間點處各種器官中的分子分布進行比較。

然而,如果希望對在時間t處由此檢測到的分子進行定量,則需要將該成像技術通過傳統(tǒng)方法或儀器方法與定量化學分析進行偶聯(lián)。該第二定量步驟可能是處理和解釋錯誤的來源。而且,它不能使目標分子的存在與其在樣品中的定量分布直接關聯(lián)。



技術實現要素:

本發(fā)明提出一種在單一分析期間通常使用質譜法來檢測并任選地定量樣品中的靶分子的方法。優(yōu)先地,本發(fā)明的方法使用質譜法成像,所述質譜法成像使得能夠直接在樣品上自動獲取與分子的質譜相關的信號,從而重建所述靶分子在樣品中的分布圖像和至少相對量。

為此,根據本發(fā)明,對靶分子的消光系數(tec)(對給定樣品中的每種靶分子特異性的)進行限定并將其整合到所述方法中。事實上,在給定濃度下的給定分子不發(fā)出相同強度的信號,這依賴于所檢測的分子所處在其中的樣品。類似地,給定樣品中相同濃度的兩種不同分子具有不同的信號強度。tec的計算和整合使得可以識別并考慮到與待分析的樣品中靶分子的質譜相關的信號強度變化。然后,可以使用tec對所述分子得到的信號進行歸一化,從而使其代表其濃度,與樣品的性質及其在所述樣品中的位置無關。由此可以根據所得到的分析樣品中靶分子的質譜法結果直接對分子進行定量。

由此本發(fā)明的一個目的涉及通過質譜法對樣品中的至少一種靶分子進行鑒定和/或定量的方法,所述方法包括以下步驟:

a)將待分析的樣品沉積在支持物上;

b)通過質譜法對所述樣品進行分析,從而得到所述樣品中靶分子的質譜;

c)通過對靶分子和樣品特異性的消光系數(tec)對與所述樣品中靶分子的質譜相關的信號進行加權;以及任選地

d)使用靶分子的加權信號來確定樣品中靶分子的量。

本發(fā)明的方法可以應用于能夠通過質譜儀分析的任何類型的樣品,無論所述樣品為有機或無機的液體或固體。本發(fā)明的方法還適用于質譜法中可使用的任何類型的支持物(載玻片、板、膜等)。所述方法由此特別適用于分析生物組織。在此情形中,制備組織切片,典型地在數微米厚的數量級上,并將其沉積在支持物如載玻片上,使其能夠引入質譜儀中。本發(fā)明的方法還可以用于分析所有生物液體如血液、血漿、血清、唾液、腦脊液、尿等。本發(fā)明的方法還可以用于分析環(huán)境樣品如土壤、水、植物等的樣品。

在步驟a)期間,可以通過任何已知技術即手動(例如利用移液管)或自動(例如通過使用成斑裝置或通過噴霧或升華)地沉積樣品??梢栽诔练e到樣品支持物上之前對樣品進行稀釋或處理。

可以通過任何質譜法、特別是使用直接質譜法(ms)或串聯(lián)質譜法(msn、mrm、srm)進行靶分子的分析的步驟b)。

對實驗參數例如質量范圍和/或激光強度進行有利設定,從而在強度、靈敏度和分辨率方面優(yōu)化靶分子的檢測。

然后獲取質譜。

對于步驟c),各種光譜特性可以被用作信號,特別是質譜的峰強度、信噪比(s/n)、峰面積等。

所述方法的重要步驟在于測得的信號的歸一化。為此,通過對分子和樣品特異性的消光系數(tec)對被選擇作為樣品中靶分子的信號的光譜特性進行加權。這種加權將信號歸一化并使其僅取決于信號起源處分子的量。

tec代表與惰性樣品支持物上靶分子的信號相比或與標準分子的信號相比,靶分子的信號強度隨樣品性質和/或其在樣品上的位置而變的損失或增加。tec取決于數種因素,特別是樣品的起源(動物、植物、細菌、無機物質)、表面類型(組織、植物細胞、金屬等)、化學環(huán)境、是否存在樣品的化學處理等。在生物組織樣品的情形中,分子的消光系數對應于組織的消光系數。

有利地,對樣品進行初步組織學、化學或其他研究,以限定各種目標區(qū)域并將其用于計算tec。事實上,tec可以與樣品的特定區(qū)域相關聯(lián),特別是在非均質樣品上。

在一個實施方案中,可通過如下關系得到tec:

或相反地:

所述信號對應于所選擇的靶分子的質譜的光譜特性,例如在質譜儀上得到的所述分子的峰強度。當然,對于參比介質中和樣品上的分子,所使用的光譜特性必須相同。

使用參比介質中和待分析的樣品上相同濃度的靶分子來計算tec。也可以使用與靶分子具有類似物理化學性質的相關分子來代替參比介質中的靶分子。

對于該tec的計算,參比介質有利地對應于單獨的樣品支持物。為此,例如,將分子溶解在合適的介質(有機溶劑、水等)中,然后沉積在樣品支持物上。在沉積之后,蒸發(fā)溶劑,從而得到分子在所述支持物上的干燥沉積物。得到樣品支持物上所述分子的信號,然后將其用于tec。

tec值通常是相同條件下靶分子的數次測量結果的平均值,從而得到可靠的系數。

優(yōu)先地,對于給定類型的樣品中給定的靶分子,消光系數(tec)僅計算一次,并將其重復用于給定類型的樣品中所述靶分子的每個分析。由此,對于給定的靶分子,可以有利地產生tec數據庫,并將所述tec數據庫用于各種樣品中所述分子的每個分析,所述數據庫列出了數種不同樣品中靶分子的tec。

或者,可以在每個分析之前確定tec值。

在另一個實施方案中,通過如下關系得到tec:

或相反地:

所述信號對應于所選擇的分子的質譜的光譜特性,例如在質譜儀上得到的所述分子的峰強度。當然,對于標準分子和靶分子,所使用的光譜特性必須相同。

在本發(fā)明的上下文中,“標準分子”是指結構上類似于靶分子的分子。優(yōu)先地,標準分子的分子量與靶分子的分子量不同,從而可以容易地分析得到的質譜。例如,標準分子的分子量與靶分子的分子量相差1至17道爾頓(dalton)。有利地,為了不使總信號飽和,對標準分子的濃度進行限定,所述標準分子被容納在增溶溶液(水性或含有溶劑)中。

在具體實施方案中,標準分子是靶分子的氘化分子,即用氘標記的分子或用任何其它合適的同位素標記的分子,以作為標準分子。對分析樣品中的靶分子及其氘化補體(或標記有同位素的相應分子)同時進行評估??紤]到它們的電離是相同的,所以通過質譜法對它們進行分析將得到相同的信號,其中質量方面的差異是由于存在同位素而造成的。因為標記有同位素的分子的濃度是已知的,于是可以計算比率以得到相對量。

有利地,在分析步驟b)之前,將已知濃度的標準分子添加到待分析的樣品,所述標準分子的分子量也是已知的。當本發(fā)明的方法使用需要使用基質的質譜法成像技術如maldi或基質增強的次級離子質譜法(me-sims)成像時,可以在使用前將標準分子添加到基質。將基質/標準分子的混合物均勻沉積到樣品上以及樣品外圍即樣品支持物上,以使得能夠計算tec。在干燥期間,可以利用裸眼對混合物的共結晶進行觀察。

優(yōu)先地,在沉積之前,將混合物勻化。

使用標準分子的這種tec還可以與不需要基質溶液的成像技術如激光解吸/電離(ldi)、解吸電噴霧電離(desi)、激光消融電噴霧電離(laesi)或次級離子質譜法(sims)一起使用。在此情形中,可以通過使用相同的沉積裝置,在不與基質混合的條件下,將標準分子沉積到樣品和支持物上。因此樣品被標準分子浸漬,所述標準分子可以被用作參比以供研究用。

濃度已知的標準分子所得到的信號被用于將靶分子的光譜特性歸一化,從而在考慮到抑制效應的同時得到靶分子分布的真正可視化。另外,通過將靶分子的信號與標準分子的信號進行比較,標準分子所得到的信號至少可用于推導出樣品中靶分子的相對量。還可以補償基質效應,如同下面所進一步詳細描述的。

在步驟d)期間,樣品中測得的加權信號可以用于對所述分子進行定量。加權信號對應于作為相應計算的tec的函數增加或減少的靶分子所得到的信號強度。更精確地,加權信號對應于樣品中靶分子的信號與相關tec之比,或者加權信號對應于相關tec與樣品中靶分子的信號之比。

加權信號的值僅取決于分子的濃度。由此,例如通過參照靶分子的參比信號可確定靶分子的量。

表述“靶分子的參比信號”是指代表已知濃度、與樣品的性質及其在樣品中的位置無關的信號。參比信號可以是針對已知量的給定分子預先確定或建立的平均值或中值(或平均值或中值的范圍)。其還可以是標準曲線。

根據所選擇的方法,并且如果需要的話,根據所使用的參比信號,可以以相對或絕對方式確定靶分子的量。

例如,通過使用在參比介質例如其上已沉積有溶解分子的樣品支持物中的至少三種不同已知濃度的靶分子(或具有與靶分子類似的物理化學性質的另一種分子)制備標準范圍,來得到參比信號。如果將分子沉積在組織樣品上,在沉積并蒸發(fā)溶解介質之后將分子有利地吸附在所述組織上。

可以在所述標準范圍內引入不同于靶分子的內標,從而將所述靶分子的信號歸一化。用作內標的分子有利地具有與靶分子類似的物理化學性質。在沉積之前向靶分子的標準范圍添加恒定濃度的這種內標。

接下來,對每個濃度的質譜進行分析。對于每個所述濃度,讀取被選擇作為比較信號的光譜特性。有利地,在得到每個濃度點的質譜之后,所選擇的相關光譜特性可以用于建立所述分子的校準曲線。于是足以參考該校準曲線來精確確定分析樣品中的濃度。

本發(fā)明的方法可以有利地與質譜法成像一起使用。在此情形中,可使用與各種類型的分析儀如飛行時間(tof)、orbitrap、傅里葉變換離子回旋共振(fouriertransformioncyclotronresonance)(ft-icr)等組合的各種電離源如maldi、激光解吸/電離(ldi)、解吸電噴霧電離(desi)等。這種成像技術使得可以直接在樣品所得到的離子密度圖上對靶分子進行定量,所述離子密度圖對應于所述樣品中靶分子的空間分布。所述離子密度圖上的加權信號可以真正與目標分子的特定參比信號進行比較。

某些質譜法成像技術如maldi或me-sims要求利用基質預先對待分析的樣品進行覆蓋,所述基質包含小的吸收uv的有機分子。這種基質使得存在于樣品上的分子能夠解吸并電離。

無論所選擇的基質如何,都可以使用本發(fā)明的方法。這些基質以固體形式(在樣品上結晶)或液體形式被提供,并且為離子的或非離子的。根據分析的質量范圍選擇基質。通常在使用前片刻將它們制備在溶劑/水性溶液混合物中。

用于沉積基質的數種方法是可能的,特別是使用移液管的手動沉積,所述手動沉積使得可以將精確體積的基質直接沉積在樣品上。也可以通過噴霧或通過霧化來沉積基質,其中通過機器人系統(tǒng)或手動地將基質直接噴霧或霧化在組織上。類似地,可以設想通過微滴進行的沉積,其中通過壓電、聲音或注射泵系統(tǒng)將基質點在樣品上。還可以通過篩分來沉積基質,從而以固體形式沉積基質。

有利地,如果本發(fā)明的方法使用maldi質譜法成像,則可以預期的是對樣品上基質沉積的均勻性進行評估的步驟。事實上,與所使用的基質對應的信號可以指示所述基質的沉積的量/均勻性。于是,樣品表面上的基質缺陷可以與所研究的樣品中無法檢測到靶分子信號相關聯(lián)或與靶分子信號強度損失相關聯(lián)。

可以根據定性標準通過在光學顯微鏡下對樣品表面上的沉積均勻性進行觀察,和/或根據定量標準通過監(jiān)測樣品上與基質自身相關的信號變化,來對基質的均勻性進行評估。

關于定性標準,必須確?;|已盡可能均勻地沉積在所研究的表面上,并且不存在不含基質的區(qū)域且其結晶是最佳的。

對于基質沉積均勻性的定量評估,基質被認為是其信號在樣品分析期間以與靶分子信號相同的方式進行檢測的分子自身。然后,將基質分子的信號與其參比信號進行比較。在此情形中,基質的參比信號對應于由參比基質沉積物上即樣品上和特定用于測量基質參比信號的樣品支持物上的基質所發(fā)出的信號。

通過這些附加步驟,靶分子的信號得到驗證并被歸一化以將基質沉積品質的變化考慮在內,所述變化能夠影響基質沉積物的光譜特性。

當希望對靶分子的存在隨時間的變化進行監(jiān)測時,基質效應的這種考慮是特別有利的,因為基質沉積品質可以在一個樣品與下一個樣品之間變化。

本發(fā)明的方法可以用于分析任何類型的分子如肽、多肽、蛋白質、氨基酸、核酸、脂質、代謝物等,總的來說是在藥物學或其他方面具有活性并能夠通過質譜法電離的任何分子。本發(fā)明的方法對于分析小分子(特別是藥物)即分子量小于2000da的分子是特別有利的。

如果靶分子是高分子量的蛋白質,則可對靶分子進行酶和/或化學預處理以將其切割成數個肽(圖2)。然后對代表所述蛋白質的從酶消化和/或化學降解/修飾得到的肽中的至少一種進行檢測和定量。例如,胰蛋白酶可以用作酶以將靶蛋白質切割成預先鑒定到的數個肽?;瘜W預處理可以由通過酸或堿的化學水解、美拉德(maillard)反應、異構肽或賴丙氨酸的形成等構成。

類似地,可在檢測步驟b)之前使用至少一種溶劑和/或至少一種洗滌劑對待分析的樣品進行處理,從而優(yōu)化靶分子的檢測。例如,使用氯仿進行洗滌(圖1-a)去除了某些種類的脂質。使用乙醇進行洗滌(圖1-b)能夠更好地檢測低質量分子。圖1所示的實驗中的這兩種洗滌去除了某些分子,特別是脂質,由此促進直接在組織上檢測新離子。

本發(fā)明的方法還能夠用于同時或順序檢測和定量同一樣品上的至少兩種不同的靶分子。

本發(fā)明的方法特別適合于檢測和定量生物、植物或動物組織切片上的靶分子。特別地,在整個動物的切片上的分析能夠使得可以在同一樣品上對所述動物的各種組織中靶分子的分布進行比較。

根據本發(fā)明,為了進行定量,可以通過整合了全部或部分這些因素的計算機程序將源數據即靶分子的tec和基質效應歸一化。該計算機程序或數據分析軟件有利地使用根據需要在質譜法成像的情形中在處理圖像期間用基質效應進行加權的tec值。

因此,本發(fā)明的另一個目的涉及計算機可讀的數據介質,其包含計算機可執(zhí)行的指令,例如讀取從質譜法分析得到的原始數據、和/或確定tec和/或確定校準曲線、和/或使用所述tec或所述校準曲線將所述原始數據歸一化以得到靶分子的定量值。有利地,這些計算機可執(zhí)行的指令適合于使得計算機系統(tǒng)能夠至少執(zhí)行本發(fā)明方法的步驟c)。

數據介質有利地包含在至少兩種不同樣品類型中的至少一種靶分子的至少一個tec數據庫。優(yōu)先地,在生物樣品如整個動物的切片的情形中,數據庫列出了在所述樣品的各種組織中的至少一種靶分子的tec。

數據介質還可以包含質譜法成像中使用的至少一種基質的參比信號的數據庫。由此,通過使用利用數據介質的成像方法,可以在樣品分析期間將基質效應考慮在內。

附圖說明

圖1.心臟組織的質譜法直接分析中兩種洗滌的效應的實施例。(a):在對基質沉積物不進行任何初步洗滌的條件下從心臟組織得到的信號。(b):在沉積基質之前使用90%乙醇進行洗滌而從與(a)相鄰的切片上的心臟組織得到的信號。(c):在沉積基質之前使用100%氯仿進行洗滌而從與(a)相鄰的切片上的胃組織得到的信號。

圖2.消化的模型蛋白質(牛血清白蛋白,其中使用胰蛋白酶作為消化酶)在(a)參比支持物(載玻片)和(b)組織(大鼠的肝)上的maldi-tof質譜。m/z928片段(ylyeiar)的實施例:觀察到與組織上的肽相關的質量信號的消光,其中tec等于1.62。

圖3.根據使用質譜法成像實施的實施例,本發(fā)明方法的基本步驟的示意圖。

圖4.在研究普萘洛爾在小鼠全身中的分布中用于計算組織消光系數的方法。(a)用于將各種器官或靶區(qū)域(1-單獨的載玻片、2-腦、3-腎、4-肺、5-肝、6-心臟)可視化的對照小鼠的矢狀切片的光學圖像。(b)與樣品上和樣品以外的基質混合的內標(普萘洛爾,在m/z260下的[m+h]+離子)的分布的質譜法圖像,以及強度比例尺。

圖5.用于計算腎中普萘洛爾的組織消光系數的方法。圖5a:腎的光學圖像,在靶器官內界定出相等尺寸的數個目標區(qū)域(roi)或點的區(qū)域。圖5b:roi和roi之間的內標的平均強度(roi平均值)的表。

圖6.圖6a:總結了器官或靶區(qū)域的普萘洛爾強度的表。圖6b:器官或靶區(qū)域的普萘洛爾強度的柱狀圖。

圖7.計算組織的消光系數。圖7a:數學關系:總結了按靶器官計算的普萘洛爾的tec的表。圖7b:按靶器官計算的普萘洛爾的tec的柱狀圖。

圖8.確定靶分子的校準曲線。圖8a:標準范圍沉積物的光學圖像。圖8b:標準范圍的質譜法圖像,靶分子的分布。

圖9.圖9a:總結了標準范圍的靶分子的roi的平均強度的表。圖9b:校準線的圖。圖9c:相關系數和直線方程。

圖10.在全身中靶分子(普萘洛爾)的質譜法圖像上的定量。圖10a:在注射靶分子后20分鐘時小鼠矢狀切片的光學圖像以及各種器官或靶區(qū)域(2-腦、3-腎、4-肺、5-肝、6-心臟)的可視化。圖10b:在注射靶分子(在m/z260下的[m+h]+離子)后t=60分鐘時按強度表示的分布的質譜法圖像。圖10c:在注射靶分子后t=20分鐘時通過tec歸一化并與校準線相關聯(lián)之后的分布的質譜法圖像,得到每單位面積的靶分子的量。

圖11.在靶分子的ms圖像上的定量,表總結了各種器官中靶分子的量。利用tec從按器官和像素表示的平均強度計算靶分子的量的方法的說明。

圖12.用于計算腎中奧氮平的組織消光系數的方法。圖12a:對照小鼠的腎的矢狀切片的光學圖像。圖12b:與樣品上和樣品以外的基質混合的內標(奧氮平,在m/z313.3下的[m+h]+離子)的分布的質譜法圖像,以及強度比例尺。圖12c:腎中奧氮平所計算得到的tec的柱狀圖。

圖13.確定靶分子的校準曲線。圖13a:標準范圍的質譜法圖像,靶分子的分布。圖13b:示出了與奧氮平的ms圖像相關的校準線、其方程、其相關系數及其以fmol/mm2為單位的檢測限和定量限。

圖14.使用處理2小時的腎中靶分子(奧氮平)的質譜法圖像進行的定量。圖14a:在施用靶分子后2小時小鼠腎的矢狀切片的光學圖像。圖14b:在施用靶分子(在m/z313.3下的[m+h]+離子)后t=2小時按強度表示的分布的質譜法圖像。

具體實施方式

現在使用具體實施例和上述圖對本發(fā)明方法進一步進行詳細描述。僅出于示例性目的提供這些實施例,并且這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

實施例1

在實施例1中,通過maldi質譜法成像對藥物(普萘洛爾)在小鼠的各種器官中的分布進行研究。當然,可以以幾乎相同的方式使用除maldi以外的成像裝置,例如以下源:sims、desi、dios、icp、maldi顯微鏡、snom、smaldi、la-icp、esi(在組織上的液體萃取)、mildi、jedi、eldi等。

材料和方法

材料

-2,5-二羥基苯甲酸(dhb)(sigma-aldrich,saint-quentinfallavier,france)

-三氟乙酸(tfa)(sigma-aldrich)

-甲醇(sigma-aldrich)

-普萘洛爾(sigma-aldrich)

動物

使用重25-40g的雄性swiss小鼠(charlesriver,france)。通過靜脈內途徑在7.5mg/kg的濃度下注射被容納在0.9%nacl溶液中的普萘洛爾。

在注射后20分鐘通過co2窒息將動物處死。

然后將動物投入通過液氮冷卻的100%異戊烷溶液中以進行快速冷凍。

然后將動物儲存在-80℃下。

制備用于質譜法的樣品

使用在-26℃下冷卻的cm1510s低溫恒溫器(leicamicrosystems,nanterre,france)將樣品(對照和給藥后的組織)切片成20μm厚的層。然后將切片沉積在導電ito(銦錫氧化物)載玻片(brukerdaltonics,bremen,germany)上。

最后,將切片置于干燥器中20分鐘。

準備通過maldi成像進行獲取

dhb基質被用于分析組織切片中的靶分子(普萘洛爾)。將該基質以40mg/ml的濃度制備在甲醇/0.1%tfa(1:1,v/v)中。使用suncollect噴霧系統(tǒng)(sunchrome,germany)沉積基質溶液。

在相同載玻片上,但在給藥后的組織切片以外的位置,在沉積基質之前使用移液管(每個點1μl)手動沉積一系列被容納在水中的普萘洛爾的稀釋液。該范圍的稀釋液從10pmol/μl延伸到0.02pmol/μl,并包括七個點。

準備計算tec

在來自于另一個整個動物的對照組織切片上,也制備了在acn/0.1%tfa(7:3,v/v)中的10mg/mlchca基質溶液,向其中加入10pmol/μl的普萘洛爾溶液。使用suncollect噴霧系統(tǒng)(sunchrome,germany)沉積所述基質溶液以覆蓋組織切片的表面。

maldi圖像獲取

使用安裝有smartbeam激光器的autoflexspeedmaldi-tof質譜儀(brukerdaltonics,bremen,germany)得到了圖像。以正反射模式產生數據。以1000hz的激光頻率和300×300μm2的圖像空間分辨率在100da至1000da的質量范圍上對每個斑點獲得了總共700個光譜。使用2.1版的fleximaging軟件來重建圖像。

1-計算對照樣品上靶分子(普萘洛爾)的tec

將按上述制備的并被用作對照樣品的整個動物的矢狀切片沉積在載玻片上。

將用作內標的普萘洛爾溶液與上述基質混合,然后將得到的混合物沉積在對照樣品上。

然后,通過質譜法成像對對照樣品進行分析,從而得到內標在對照樣品上和在支持物載玻片上的分布的圖像(圖4-b)。

可以預先通過對照樣品的光學成像有利地定位各種目標器官(圖4-a)。

然后,對于載玻片上的每個器官,在對照樣品的質譜法圖像上界定出相等尺寸的數個目標區(qū)域(roi)。選擇質譜的峰強度作為參比信號。對于每個roi和每個目標器官,記錄內標的平均強度。對于每個器官,從所有相應roi所獲得的強度計算得到平均強度(roi平均值)。該roi平均值被用于計算所研究的每個器官中普萘洛爾的消光系數。

圖5顯示了對于腎而言的這些各種步驟的示意圖。

圖6a總結了對照樣品的各種目標器官中普萘洛爾所得到的roi平均值,并且圖6b顯示了得到的相應信號強度的柱狀圖。

然后,可以根據下面的數學式使用來自于載玻片和來自于每個器官的roi平均值計算tec(圖7a):

由此,對于相同濃度的普萘洛爾,與預期的信號即在載玻片上的信號相比,腎中的相關信號被除以接近13。另一方面,肝中的信號僅被除以4.82,心臟中的信號被除以7.96。肺中的信號被除以小于8,腦中的信號被除以6.18。

2-普萘洛爾校準曲線

在本文中使用圖8和9描述的實施例中,靶分子(普萘洛爾)的參比信號對應于七種濃度的普萘洛爾的標準范圍所得到的信號。

使用移液管將對應于七種不同濃度的普萘洛爾(0至3pmol/μl)的七滴普萘洛爾和基質的溶液手動沉積在載玻片上并使其干燥。為了更易于讀取結果,以逐漸升高的濃度沉積這些液滴,并將其充分隔開以避免重疊的任何風險。

對于使用相同尺寸的roi的范圍內的所有點,將這些各種濃度所得到的質譜法圖像歸一化(圖8b),從所述相同尺寸的roi限定了普萘洛爾的平均參比強度或參比信號。然后可以繪制校準線(圖9b),其后使得可以在分析期間將普萘洛爾所得到的任何信號強度與按像素表示的濃度相關聯(lián)。

3-直接在樣品的質譜法圖像上對普萘洛爾進行定量

將按上述制備的且如果可能與在計算tec期間被用作對照樣品的切片在相同平面內的整個動物的矢狀切片沉積在載玻片上,從而通過質譜法成像進行分析(圖10b)。

在每個目標器官中,普萘洛爾所得到的信號強度作為每個器官所計算得到的tec的函數而增大。

得到了整個動物的切片的質譜法圖像,其中信號強度對應于絕對強度,即單獨普萘洛爾濃度的強度(圖10c)??梢詫⒃搱D像與先前為普萘洛爾所計算得到的校準線相關聯(lián),從而直接通過將圖像可視化來確定樣品中普萘洛爾的量。

由此,在本文中所述的實施例中,注意到,普萘洛爾幾乎不存在于肝和肺中,這與腦形成對比,在腦中普萘洛爾的分布最大,其中靶分子的總量為約5ng。在腎和肺中也觀察到普萘洛爾,其量在1.28ng至2ng的范圍內。

實施例2

在第二個實施例中,通過maldi質譜法成像對另一種藥物(奧氮平)在小鼠的腎中的分布進行研究??梢砸詭缀跸嗤姆绞绞褂萌魏纹渌上裱b置。

材料和方法

材料:

-羥基肉桂酸(chca)(sigma-aldrich,saint-quentinfallavier,france)

-三氟乙酸(tfa)(sigma-aldrich)

-乙腈、dmso、水(sigma-aldrich)

-奧氮平(lillyresearchlaboratories,elilillyandco.,indianapolis,in)

動物

使用重25-40g的雄性swiss小鼠(charlesriver,france)。在8mg/kg的濃度下口服施用奧氮平。

在施用后2小時通過co2窒息將動物處死。

然后將動物投入通過液氮冷卻的100%異戊烷溶液中以進行快速冷凍。

然后將動物儲存在-80℃下。

制備用于質譜法的樣品

在與上述實施例1相同的條件下將樣品切片成10μm厚的層(對照和給藥后的腎切片)。

準備通過maldi成像進行獲取:

chca基質被用于分析給藥后的組織切片中的靶分子(奧氮平)。將該基質以10mg/ml的濃度制備在acn/0.1%tfa(7:3,v/v)中。使用suncollect噴霧系統(tǒng)沉積基質溶液。

在相同載玻片上,但在給藥后的組織切片以外的位置,在沉積基質之前使用移液管(每個點1μl)手動沉積一系列被容納在dmso中的奧氮平的稀釋液。該范圍的稀釋液從60pmol/μl延伸到1pmol/μl,并包括七個點。

準備計算tec:

在(來自于另一個動物的)腎的對照組織切片上,也制備了在acn/0.1%tfa(7:3,v/v)中的10mg/mlchca基質溶液,向其中加入10pmol/μl的奧氮平溶液。使用suncollect噴霧系統(tǒng)沉積所述基質溶液以覆蓋組織切片的表面。

maldi圖像獲?。?/u>

以與實施例1相同的方式獲得了圖像,但利用200×200μm2的圖像空間分辨率。

1-計算對照樣品上靶分子(奧氮平)的tec

將按上述制備的并被用作對照樣品的腎的對照矢狀切片沉積在載玻片上。將用作內標的奧氮平溶液與上述基質混合,然后將得到的混合物沉積在對照樣品上。

然后,通過質譜法成像對對照樣品進行分析,從而得到內標在對照樣品上和在支持物載玻片上的分布的圖像(圖12b)。圖12a中所示對照樣品的光學圖像使得可以將目標器官即腎可視化。

然后,在對照樣品的質譜法圖像上界定出腎上和載玻片上相等尺寸的數個目標區(qū)域(roi)。選擇質譜的峰強度作為參比信號。如同實施例1計算平均強度(roi平均值)。該roi平均值被用于計算腎中奧氮平的消光系數。

根據與實施例1相同的方法計算tec(圖12c)。由此觀察到,對于相同濃度的奧氮平,與預期的信號即在載玻片上的信號相比,腎中的相關信號被除以接近22.2。

2-奧氮平校準曲線

圖13中所示的奧氮平的參比信號對應于七種濃度的奧氮平的標準范圍所得到的信號。

使用移液管將對應于七種不同濃度的奧氮平(0至60pmol/μl)的七滴奧氮平和基質的溶液手動沉積在載玻片上并使其干燥。為了更易于讀取結果,以逐漸升高的濃度沉積這些液滴,并將其充分隔開以避免重疊的任何風險。

對于使用相同尺寸的roi的范圍內的所有點,將這些各種濃度所得到的質譜法圖像歸一化(圖13a),從所述相同尺寸的roi限定了奧氮平的平均參比強度或參比信號。然后可以繪制校準線(圖13b),其后使得可以在分析期間將奧氮平所得到的任何信號強度與以pmol/mm2為單位的濃度相關聯(lián)。

3-使用樣品的質譜法圖像對奧氮平進行定量

將按上述制備的且如果可能與在計算tec期間被用作對照樣品的切片在相同平面內的經奧氮平處理的腎的矢狀切片沉積在載玻片上,從而通過質譜法成像進行分析(圖14a)。由此得到了腎切片的質譜法圖像,在所述圖像上,通過檢測主要在髓質中的m/z313.3離子來定位奧氮平(圖14b)。

腎中奧氮平所得到的信號強度被歸一化作為預先計算得到的tec的函數。然后,可以將該數據與先前為奧氮平所計算得到的校準線相關聯(lián),從而得到其在腎中的總濃度,單位為pmol/mm2。

然后,利用所分析的腎切片的厚度和表面積,可以確定樣品中以每克組織的克數為單位的奧氮平的量。

由此,在本文中所述的實施例中,可以計算得到奧氮平的平均濃度(經三次實驗),其為41.1μg/g組織。

當前第1頁1 2 
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1