本發(fā)明涉及的是一種分子印跡傳感器的制備方法及快速檢測應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測花青素的分子印跡傳感器的制備，具體是基于分子印跡特異性識別作用，用于檢測藥品、食品、生物樣品中的花青素技術(shù)。

背景技術(shù)：

花青素(anthocyanidin)，又稱花色素，其分子式為c15h11o6，相對分子質(zhì)量為287，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬類黃酮化合物。也是植物花瓣中的主要呈色物質(zhì)，水果、蔬菜、花卉等五彩繽紛的顏色，大部分與之有關(guān)。

花青素存在于植物細(xì)胞的液泡中，可由葉綠素轉(zhuǎn)化而來。在植物細(xì)胞液泡不同的ph值條件下，使花瓣呈現(xiàn)五彩繽紛的顏色。秋天可溶糖增多，細(xì)胞為酸性，在酸性條件下呈紅色或紫色，所以花瓣呈紅、紫色是花青素作用，花青素的顏色受許多因子的影響，低溫、缺氧和缺磷等不良環(huán)境也會促進花青素的形成和積累。

花青素為人體帶來多種益處。從根本上講，花青素是一種強有力的抗氧化劑，它能夠保護人體免受一種叫做自由基的有害物質(zhì)的損傷?；ㄇ嗨厥橇u基供體，同時也是一種自由基清除劑，它能和蛋白質(zhì)結(jié)合防止過氧化。也和金屬、vc等螯合，防止vc過氧化，也能淬滅單線態(tài)氧?；ㄇ嗨啬芘c金屬離子螯合或形成花青素一金屬—vc復(fù)合物。有助于預(yù)防多種與自由基有關(guān)的疾病，包括癌癥、心臟病、過早衰老和關(guān)節(jié)炎；增強免疫系統(tǒng)能力來抵御致癌物質(zhì)；具有抗炎功效，因而可以預(yù)防包括關(guān)節(jié)炎和腫脹在內(nèi)的炎癥；增強動脈、靜脈和毛細(xì)血管彈性等。目前，檢測花青素的方法主要有高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜，色譜法的準(zhǔn)確度受到一定限制、而且儀器比較貴需要專業(yè)人員操作，也限制了其應(yīng)用。也可用分光光度計快速測定，在堿性條件下呈藍色，其顏色受酸度影響很大，給光度分析帶來較大誤差。另外，由于花青素與黃酮類分子結(jié)構(gòu)十分相近很難分開，測定時互相干擾，準(zhǔn)確檢測花青素很困難。因此，找到一種選擇性好、靈敏度高、操作簡便使用的檢測花青素的方法十分有意義。

分子印跡技術(shù)是當(dāng)前開發(fā)具有分子識別功能的高選擇性材料的主要方法之一，它是通過在模板分子周圍形成一個高度交聯(lián)的剛性高分子，除去模板分子后在分子印跡聚合物的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中留下具有結(jié)合能力的識別位點，對模板分子表現(xiàn)出高選擇識別性能的一種技術(shù)。這項技術(shù)以其構(gòu)效預(yù)定性和特異識別性越來越受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成功用于固相萃取或微固相萃取，親和色譜或毛細(xì)管電泳及傳感器等領(lǐng)域。

依據(jù)此技術(shù)制備的分子印跡傳感器，應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境保護及生命科學(xué)研究中起著十分重要的作用。將功能分子以適當(dāng)方式修飾到電極上，制備選擇性好、靈敏度高、有一定使用壽命可再生的電化學(xué)傳感器成為分析科學(xué)工作者努力探索的課題。但是傳統(tǒng)的印跡方法所制備的印跡膜厚度難以控制，高交聯(lián)度使得電子傳遞速度和響應(yīng)慢、檢測下限高而且再生和可逆性差，影響分子印跡技術(shù)在電化學(xué)傳感器中的應(yīng)用。因此，建立一種靈敏、快速、簡便、特異性高、重復(fù)性好經(jīng)濟使用的檢測方法，對研究人員、生產(chǎn)企業(yè)、質(zhì)控人員、進出口商檢、政府管理部門等的迫切需要的，對食品、藥品、環(huán)境安全中的花青素含量準(zhǔn)確定量測定十分必要，對于花青素生產(chǎn)和藥理研究也具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是將分子印跡與電化學(xué)傳感器相結(jié)合，提供了一種花青素分子印跡傳感器的制備方法，主要是以花青素為模板，在玻碳電極表面通過氧化石墨烯、納米金粒子的修飾，提高了傳感器的靈敏度，采用滴涂法制制備花青素分子印跡傳感器。

儀器與試劑

chi660b電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司），實驗采用三電極體系：鉑絲電極為輔助電極，ag/agcl為參比電極（sce），玻碳電極（gce）為工作電極；kq-250e型超聲波清洗器（坤峰超聲儀器有限公司）。

氧化石墨烯；二甲基丙烯酸乙二醇酯、烏頭酸；1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽，偶氮二異庚腈，無水乙醇；花青素；動物膠；磷酸緩沖溶液；所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。

一種用于檢測花青素的分子印跡傳感器的制備，特征在于該方法具有以下工藝步驟：

（1）石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加12~15μl含氧化石墨烯為0.3g/l的n,n-二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯修飾玻碳電極；

（2）花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，按如下組成質(zhì)量百分濃度加入，去離子水：15~20%，無水乙醇：50~60%，二甲基丙烯酸乙二醇酯：6~10%，烏頭酸：5~8%，1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽：10~15%，偶氮二異庚腈：1.0~3%，花青素：0.2~2.0%，各組分含量之和為百分之百，攪拌溶解，通惰性氣體除氧20min，無氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)12~15h，將得到的產(chǎn)物用乙醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡6~8h，除去模板分子，干燥，即得花青素分子印跡聚合物；

（3）花青素分子印跡傳感器的制備方法：取步適量的花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得18g/l的花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12~15μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得花青素分子印跡傳感器。

在步驟（2）中所述的二甲基丙烯酸乙二醇酯與烏頭酸摩爾比為1：1為最優(yōu)。

在步驟（2）中所述的1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽與烏頭酸摩爾比為1：1為最優(yōu)。

在步驟（2）中所述惰性氣體為氖氣或氬氣。

本發(fā)明的優(yōu)點及效果是：

本發(fā)明將印跡技術(shù)、層層自組裝法和滴涂法相結(jié)合，在氧化石墨烯修飾玻碳電極表面成功地研制了一種具有特異選擇性的印跡電化學(xué)傳感器。通過與無氧化石墨烯修飾的分子印跡電極那個的響應(yīng)進行比較，本發(fā)明制備的花青素分子印跡傳感器的響應(yīng)大大提高。該印跡傳感器對花青素表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與花青素的濃度在1.0×10^-8~2.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為8.12×10^-9mol/l將本發(fā)明制備的花青素分子印跡傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中花青素的檢測中，回收率在95.86~103.88%之間，因此本發(fā)明制備的分子印跡傳感器可廣泛應(yīng)用于化工、生物醫(yī)藥、食品、環(huán)保檢測等相關(guān)領(lǐng)域。

具體實施方式

實施例1

（1）石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加13μl含氧化石墨烯為0.3g/l的n,n-二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯修飾玻碳電極；

（2）花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：17ml，無水乙醇：68ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：8g，烏頭酸：6g，1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽：12g，偶氮二異庚腈：1.5g，花青素：1.0g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧20min，無氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)13h，將得到的產(chǎn)物用乙醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡7h，除去模板分子，干燥，即得花青素分子印跡聚合物；

（3）花青素分子印跡傳感器的制備方法：取步適量的花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得18g/l的花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液14μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得花青素分子印跡傳感器。

實施例2

（1）石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加12μl含氧化石墨烯為0.3g/l的n,n-二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯修飾玻碳電極；

（2）花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：15ml，無水乙醇：80ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：6g，烏頭酸：5g，1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽：10g，偶氮二異庚腈：2g，花青素：2g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧20min，無氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)14h，將得到的產(chǎn)物用乙醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡6h，除去模板分子，干燥，即得花青素分子印跡聚合物；

（3）花青素分子印跡傳感器的制備方法：取步適量的花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得18g/l的花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液13μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得花青素分子印跡傳感器。

實施例3

（1）石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加15μl含氧化石墨烯為0.3g/l的n,n-二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯修飾玻碳電極；

（2）花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：20ml，無水乙醇：63ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：10g，烏頭酸：8g，1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽：11g，偶氮二異庚腈：1.0g，花青素：0.5g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧20min，無氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)12h，將得到的產(chǎn)物用乙醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡8h，除去模板分子，干燥，即得花青素分子印跡聚合物；

（3）花青素分子印跡傳感器的制備方法：取步適量的花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得18g/l的花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液12μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得花青素分子印跡傳感器。

實施例4

（1）石墨烯修飾玻碳電極制備：將玻碳電極依次用0.2μm、0.01μm拋光粉進行表面拋光，然后用二次蒸餾水超聲清洗，吹干，在玻碳電極表面滴加14μl含氧化石墨烯為0.3g/l的n,n-二甲基甲酰胺分散液，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得石墨烯修飾玻碳電極；

（2）花青素分子印跡聚合物的制備：在反應(yīng)器中，分別加入，去離子水：16ml，無水乙醇：66ml，二甲基丙烯酸乙二醇酯：7g，烏頭酸：7g，1-丙烯基-3-甲基咪唑溴鹽：15g，偶氮二異庚腈：2.8g，花青素：0.2g，攪拌溶解，通惰性氣體除氧20min，無氧氛圍，55±2℃攪拌反應(yīng)15h，將得到的產(chǎn)物用乙醇：乙酸體積比為8:1混合溶液浸泡7h，除去模板分子，干燥，即得花青素分子印跡聚合物；

（3）花青素分子印跡傳感器的制備方法：取步適量的花青素分子印跡聚合物分散于1%的動物膠溶液中，制得18g/l的花青素分子印跡聚合物溶液；然后將上述溶液15μl滴加到步驟（2）制備的石墨烯修飾玻碳電極，置于紅外燈下，揮發(fā)干溶劑后，即得花青素分子印跡傳感器。

實施例5

將上述實施例1~4所制備的花青素分子印跡傳感器，用于花青素的檢測，步驟如下：

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，底液為ph7.2的磷酸鹽緩沖溶液；

（2）工作曲線繪制：將ag/agcl為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，本發(fā)明制備的電極為工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接chi660b電化學(xué)工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循環(huán)伏安法在-0.40~0.6v電位范圍內(nèi)進行檢測，空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為i0，含有不同濃度的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流即為ii，響應(yīng)電流降低的差值為△i=i0-ii，△i與花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度c之間呈線性關(guān)系，繪制△i~c工作曲線；

（3）花青素的檢測：用待測樣品代替步驟（1）中的花青素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟（2）的方法進行檢測，根據(jù)響應(yīng)電流降低的差值△i和工作曲線，得到待測樣品中花青素的含量；

所述k3[fe(cn)6]溶液的濃度為6mmol/l；

所述ph7.2的磷酸鹽緩沖溶液的濃度在0.1mol/l。

該印跡傳感器對花青素表現(xiàn)出較高的親和性和選擇性，響應(yīng)電流與花青素的濃度在1.0×10^-8~2.0×10^-4mol/l范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為8.12×10^-9mol/l將本發(fā)明制備的花青素分子印跡傳感器成功用于藥品、食品、生物樣品中花青素的檢測中，回收率在95.86~103.88%之間。