本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)溶菌酶的方法。

背景技術(shù)：

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶或n-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種能水解致病菌中黏多糖的堿性酶，主要通過破壞細(xì)胞壁中的n-乙酰胞壁酸和n-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷的病毒蛋白直接結(jié)合，與dna、rna、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。因此，該酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

目前溶菌酶的檢測(cè)方法有電致化學(xué)發(fā)光法，雖然電致化學(xué)發(fā)光靈敏度高，但是得到的可定量測(cè)定的線性范圍較窄。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種檢測(cè)溶菌酶的方法，能夠使得檢測(cè)結(jié)果靈敏度高、線性范圍寬。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)溶菌酶的方法，包括以下步驟：

1)將金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面，25～42℃孵育2～4h，水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極；再將溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

2)用水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極，氮?dú)獯蹈桑瓮看郎y(cè)樣品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈?，進(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到待測(cè)樣品電阻抗圖譜；

3)根據(jù)所述待測(cè)樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中溶菌酶的濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中溶菌酶的濃度與電阻抗差值之間的線性曲線；

所述金屬有機(jī)骨架的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

優(yōu)選的，所述金屬有機(jī)骨架溶液中金屬有機(jī)骨架的質(zhì)量體積濃度為0.5～2.5mg/ml。

優(yōu)選的，所述金屬有機(jī)骨架的粒度為1～3μm

優(yōu)選的，所述溶菌酶適體溶液中溶菌酶適體的摩爾濃度為0.8～1.2mol/l。

優(yōu)選的，所述溶菌酶適體的序列為：

5’-atcagggctaaagagtgcagagttacttag-3’。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作中用的標(biāo)準(zhǔn)品溶液至少包括9個(gè)梯度濃度，分別為0.8～1.2×10^-7mol/l、4.5～5.5×10^-8mol/l、0.8～1.2×10^-8mol/l、4.5～5.5×10^-9mol/l、0.8～1.2×10^-9mol/l、4.5～5.5×10^-10mol/l、0.8～1.2×10^-10mol/l、4.5～5.5×10^-11mol/l和0.8～1.2×10^-11mol/l。

優(yōu)選的，所述電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含有鐵離子的電解質(zhì)溶液；

檢測(cè)條件：頻率為0.1～1.0×10⁶hz，初始電壓為0.2～0.3v，振幅為4.0～6.0v。

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)溶菌酶的方法，包括以下步驟：

1)將金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面，25～42℃孵育2～4h，水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈珊螅玫浇饘儆袡C(jī)骨架修飾金電極；再將溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；2)用水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極，氮?dú)獯蹈?，滴涂待測(cè)樣品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到待測(cè)樣品電阻抗圖譜；3)根據(jù)所述待測(cè)樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中溶菌酶的濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中溶菌酶的濃度與電阻抗差值之間的線性曲線；在本申請(qǐng)中，由于溶菌酶適體和溶菌酶的作用非常靈敏，很少量的溶菌酶即可引起溶菌酶適體的構(gòu)型發(fā)生比較明顯的變化，反映在電化學(xué)檢測(cè)上就是電子轉(zhuǎn)移阻抗明顯增加。當(dāng)溶菌酶濃度持續(xù)增加時(shí)，電子轉(zhuǎn)移阻抗隨之增加。由于金屬有機(jī)框架吸附的溶菌酶適體量大，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移阻抗差與濃度的lg值在較大范圍內(nèi)都成線性相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例可知，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡單，不需要標(biāo)記，且靈敏度較高，檢測(cè)限可達(dá)2.0×10^-11m，線性范圍：1.0×10^-7～1.0×10^-11mol/l。

本發(fā)明以金屬有機(jī)骨架作為溶菌酶的載體，穩(wěn)定性高，可長期儲(chǔ)存；而且由于溶菌酶適體的專一性，凝血酶、牛血清白蛋白(bsa)和免疫球蛋白g(igg)干擾物響應(yīng)較低，不會(huì)干擾溶菌酶的檢測(cè)，得到的檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度。

附圖說明

圖1為溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從左至右依次為去離子水、牛血清白蛋白、免疫球蛋白g、凝血酶和溶菌酶；

圖3為金屬有機(jī)骨架的結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)溶菌酶的方法，包括以下步驟：

1)將金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面，25～42℃孵育2～4h，水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈珊螅玫浇饘儆袡C(jī)骨架修飾金電極；再將溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑灰缘玫降娜苊阁w適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

2)用水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極，氮?dú)獯蹈?，滴涂待測(cè)樣品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈?，進(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到待測(cè)樣品電阻抗圖譜；

3)根據(jù)所述待測(cè)樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中溶菌酶的濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中溶菌酶的濃度與電阻抗差值之間的線性曲線；

所述金屬有機(jī)骨架的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

在本發(fā)明中，所述金屬有機(jī)骨架的結(jié)構(gòu)為如圖3所示。

本發(fā)明提供的方法以金屬有機(jī)骨架材料作為修飾金電極的修飾劑，本發(fā)明采用的金屬有機(jī)框架有較大的比表面積，通過氫鍵、ππ相互作用可以有效吸附溶菌酶適體，增加溶菌酶適體的負(fù)載量。在加入溶菌酶以后，產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移阻抗增加明顯。如果不加入金屬有機(jī)框架，電極無法有效吸附溶菌酶適體，加入溶菌酶后，電子轉(zhuǎn)移阻抗幾乎無變化。在本發(fā)明中，所述金屬有機(jī)骨架的制備方法包括以下步驟：將2-氨基對(duì)苯二甲酸溶于揮發(fā)性有機(jī)溶劑中，得到2-氨基對(duì)苯二甲酸溶液；向所述2-氨基對(duì)苯二甲酸溶液中逐滴加入強(qiáng)堿溶液，調(diào)節(jié)混合溶液的ph值為5～6；再將所述調(diào)節(jié)ph值后的混合溶液與三氯化鈰混合，發(fā)生配位反應(yīng)后，產(chǎn)生沉淀，沉淀即為金屬有機(jī)骨架。

在本發(fā)明中，所述揮發(fā)性有機(jī)溶劑優(yōu)選包括甲醇、乙醇、苯、甲苯、丙酮或異丙醇；所述揮發(fā)性有機(jī)溶劑的體積與2-氨基對(duì)苯二甲酸的質(zhì)量比優(yōu)選為(5～15)ml:(0.01～0.08)g，更優(yōu)選為(8～12)ml:(0.03～0.06)g，最優(yōu)選為10ml:0.05g。

在本發(fā)明中，所述強(qiáng)堿溶液優(yōu)選包括氫氧化鈉溶液或氫氧化鉀溶液；所述強(qiáng)堿溶液的摩爾濃度優(yōu)選為0.05～0.15mol/l，更優(yōu)選為0.08～0.12mol/l，最優(yōu)選為0.1mol/l。所述強(qiáng)堿溶液的加入方式為逐滴加入，每滴的體積為0.5ml；在本發(fā)明中，所述強(qiáng)堿溶液調(diào)節(jié)混合溶液的ph值為5～6。

加入強(qiáng)堿溶液后，本發(fā)明將所述混合溶液再與三氯化鈰混合，進(jìn)行配位反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀，即為金屬有機(jī)骨架。在本發(fā)明中，所述三氯化鈰與2-氨基對(duì)苯二甲酸的質(zhì)量比優(yōu)選為(0.040～0.050):(0.01～0.08)，更優(yōu)選為(0.042～0.048):(0.03～0.06)，最優(yōu)選為0.044:0.05。在本發(fā)明中，所述沉淀的顏色優(yōu)選為淺黃色。

本發(fā)明優(yōu)選將反應(yīng)后的體系過濾后，得到沉淀，優(yōu)選對(duì)得到的沉淀進(jìn)行洗滌和干燥，得到金屬有機(jī)骨架。本發(fā)明對(duì)過濾的參數(shù)沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的即可。本發(fā)明對(duì)洗滌的溶劑優(yōu)選為乙醇，所述乙醇的體積與2-氨基對(duì)苯二甲酸的質(zhì)量比優(yōu)選為(10～20)ml:(0.01～0.08)g，更優(yōu)選為(12～18)ml:(0.03～0.06)g，最優(yōu)選為15ml:0.05g。在本發(fā)明中，所述干燥的時(shí)間優(yōu)選為2～4h，更優(yōu)選為2.5～3.5h，最優(yōu)選為3h；所述干燥的溫度優(yōu)選為40～80℃，更優(yōu)選為50～70℃，最優(yōu)選為60℃。

在本發(fā)明中，所述金屬有機(jī)骨架的粒度優(yōu)選為1～3μm，更優(yōu)選為2μm。

在本發(fā)明中，所述金屬有機(jī)骨架溶液中金屬有機(jī)骨架的質(zhì)量體積濃度優(yōu)選為0.5～2.5mg/ml，更優(yōu)選為0.8～2.0mg/ml，最優(yōu)選為1.2～1.8mg/ml。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用去離子水溶解金屬有機(jī)骨架。

在本發(fā)明中，所述金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面的體積優(yōu)選為15～25μl，更優(yōu)選為18～22μl，最優(yōu)選為20μl。

在本發(fā)明中，所述金電極的直徑優(yōu)選為1～4mm，更優(yōu)選為2～3mm。在本發(fā)明中，所述金電極的表面積優(yōu)選為2～4m²，更優(yōu)選為2.5～3.5m²，最優(yōu)選為3.1m²。所述金電極的長度優(yōu)選為40～80mm，更優(yōu)選為50～70mm，最優(yōu)選為60mm。本發(fā)明對(duì)所述金電極的來源沒有特殊限定，采用市售商品即可。

本發(fā)明優(yōu)選對(duì)金電極打磨后使用，所述打磨優(yōu)選包括以下步驟：將所述金電極在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化鋁漿打磨，再用ddh2o洗滌金電極，氮?dú)獯蹈伞Ｔ诒景l(fā)明中，所述0.5μm的氧化鋁漿與0.05μm的氧化鋁漿的濃度相同，所述氧化鋁漿中氧化鋁的質(zhì)量體積濃度優(yōu)選為1.5～2.0mg/ml，更優(yōu)選為1.6～1.8mg/ml。在本發(fā)明中，所述氧化鋁漿與洗滌用的ddh2o的體積比優(yōu)選為(4～8):(5～15)，更優(yōu)選為(5～7):(8～12)，最優(yōu)選為6:10。

在本發(fā)明中，所述金電極打磨后，將打磨后的金電極在含有鐵離子的電解質(zhì)溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，至δep＜0.12v為打磨合格。

在本發(fā)明中，所述含鐵離子的電解質(zhì)溶液優(yōu)選包括以下重量份數(shù)的組分：1.5～2.0份氯化鉀、0.2～0.6份鐵氰化鉀、0.4～0.6份亞鐵氰化鉀和200～300份去離子水；更優(yōu)選包括1.7～1.9份氯化鉀、0.3～0.5份鐵氰化鉀、0.5～0.58份亞鐵氰化鉀和220～280份去離子水；最優(yōu)選包括1.86份氯化鉀、0.41份鐵氰化鉀、0.53份亞鐵氰化鉀和250份去離子水。本發(fā)明對(duì)上述試劑的來源沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述循環(huán)伏安掃描的參數(shù)優(yōu)選為：初始電壓-0.1～-0.3v，高壓0.2～1.0v，低壓-0.1～0.3v，掃描速度0.05～0.15v/s。在本發(fā)明中，所述初始電壓優(yōu)選為-0.1～-0.3v，更優(yōu)選為-0.2v；所述高壓優(yōu)選為0.2～1.0v，更優(yōu)選為0.4～0.8v，最優(yōu)選為0.6v；所述低壓優(yōu)選為-0.1～-0.3v，更優(yōu)選為-0.2v；所述掃描速度優(yōu)選為0.05～0.15v/s，更優(yōu)選為0.08～0.12v/s，最優(yōu)選為0.1v/s。本發(fā)明對(duì)所述掃循環(huán)伏安曲線的設(shè)備沒有特殊要求，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的設(shè)備即可。

得到打磨合格的金電極后，在硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直到得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線，表明金電極清洗干凈。在本發(fā)明中，所述硫酸溶液的摩爾濃度優(yōu)選為0.4～0.6mol/l，更優(yōu)選為0.5mol/l。

在本發(fā)明中，在硫酸溶液中掃循環(huán)伏安曲線的參數(shù)優(yōu)選為：初始電壓-0.1～-0.3v，高壓1.2～2.0v，低壓-0.1～-0.3v，掃描段數(shù)15～25，掃描速度0.05～0.15v/s。所述初始電壓優(yōu)選為-0.1～-0.3v，更優(yōu)選為-0.2v；所述高壓優(yōu)選為1.2～2.0v，更優(yōu)選為1.4～1.8v，最優(yōu)選為1.6v；所述低壓優(yōu)選為-0.1～-0.3v，更優(yōu)選為-0.2v；所述掃描段數(shù)優(yōu)選為15～25，更優(yōu)選為18～22，最優(yōu)選為20；所述掃描速度優(yōu)選為0.05～0.15v/s，更優(yōu)選為0.08～0.12v/s，最優(yōu)選為0.1v/s。本發(fā)明對(duì)所述掃循環(huán)伏安曲線的設(shè)備沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的即可。

在本發(fā)明中，將所述金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面，25～42℃孵育2～4h，水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極。在本發(fā)明中，所述孵育的溫度優(yōu)選為25～42℃，更優(yōu)選為30～40℃，最優(yōu)選為37℃；所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為2～4h，更優(yōu)選為2.5～3.5h，最優(yōu)選為3h。

在本發(fā)明中，所述水洗滌的次數(shù)優(yōu)選為1～5次，更優(yōu)選為2～4次，最優(yōu)選為3次。所述洗滌用的水優(yōu)選為去離子水。

得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極后，本發(fā)明將溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈伞?/p>

在本發(fā)明中，將所述溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面后進(jìn)行孵育，所述孵育的溫度優(yōu)選為25～42℃，更優(yōu)選為30～40℃，最優(yōu)選為37℃；所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為1～3h，更優(yōu)選為1.5～2.5h，最優(yōu)選為2h。

在本發(fā)明中，所述溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面的體積優(yōu)選為15～25μl，更優(yōu)選為18～22μl，最優(yōu)選為20μl。

在本發(fā)明中，所述水洗滌的次數(shù)優(yōu)選為1～5次，更優(yōu)選為2～4次，最優(yōu)選為3次。所述洗滌用的水優(yōu)選為去離子水。

在本發(fā)明中，所述溶菌酶適體溶液中溶菌酶適體的摩爾濃度優(yōu)選為0.8～1.2mol/l，更優(yōu)選為0.9～1.1mol/l，最優(yōu)選為1.0mol/l。在本發(fā)明中，優(yōu)選采用去離子水溶解溶菌酶適體。

在本發(fā)明中，所述溶菌酶適體的序列優(yōu)選為：

5’-atcagggctaaagagtgcagagttacttag-3’。

在本發(fā)明中，所述溶菌酶適體的序列為委托生工生物工程(上海)有限公司合成。

在本發(fā)明中，以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；水洗滌第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極，氮?dú)獯蹈?，滴涂待測(cè)樣品，25～42℃孵育1～3h，再次水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到待測(cè)樣品電阻抗圖譜。

在本發(fā)明中，所述待測(cè)樣品滴涂到所述溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面的體積優(yōu)選為15～25μl，更優(yōu)選為18～22μl，最優(yōu)選為20μl。

本發(fā)明在所述第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極表面滴涂待測(cè)樣品，滴涂后進(jìn)行孵育反應(yīng)。所述孵育的溫度優(yōu)選為25～42℃，更優(yōu)選為30～40℃，最優(yōu)選為37℃；所述孵育的時(shí)間優(yōu)選為1～3h，更優(yōu)選為1.5～2.5h，最優(yōu)選為2h。

在本發(fā)明中，所述水洗滌的次數(shù)優(yōu)選為1～5次，更優(yōu)選為2～4次，最優(yōu)選為3次。所述洗滌用的水優(yōu)選為去離子水。

在本發(fā)明中，所述電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)優(yōu)選使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含有鐵離子的電解質(zhì)溶液，頻率為0.1～1.0×10⁶hz，初始電壓為0.2～0.3v，振幅為4.0～6.0v。

在本發(fā)明中，所述含鐵離子的電解質(zhì)溶液優(yōu)選包括以下重量份數(shù)的組分：1.5～2.0份氯化鉀、0.2～0.6份鐵氰化鉀、0.4～0.6份亞鐵氰化鉀和200～300份去離子水；更優(yōu)選為1.7～1.9份氯化鉀、0.3～0.5份鐵氰化鉀、0.5～0.58份亞鐵氰化鉀和220～280份去離子水；最優(yōu)選為1.86份氯化鉀、0.41份鐵氰化鉀、0.53份亞鐵氰化鉀和250份去離子水。本發(fā)明對(duì)上述試劑的來源沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的市售商品即可。

在本發(fā)明中，所述電化學(xué)阻抗檢測(cè)的條件：頻率優(yōu)選為0.1～1.0×10⁶hz，更優(yōu)選為0.3～0.8×10⁶hz，最優(yōu)選為0.5～0.6×10⁶hz；所述初始電壓優(yōu)選為0.2～0.3v，更優(yōu)選為0.25v；所述振幅優(yōu)選為4.0～6.0v，更優(yōu)選為4.5～5.5v，最優(yōu)選為5.0v。

本發(fā)明根據(jù)所述待測(cè)樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)樣品中溶菌酶的濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)品溶液中溶菌酶的濃度與電阻抗差值之間的線性曲線。

在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取方法優(yōu)選包括以下步驟：按照上述技術(shù)方案對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行檢測(cè)，得到不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移電阻，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品譜圖中的電子轉(zhuǎn)移電阻與基礎(chǔ)譜圖中的電子轉(zhuǎn)移電阻得到電子轉(zhuǎn)移電阻差，差值跟標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的溶菌酶的濃度線性擬合，得到線性曲線。

在本發(fā)明中，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液至少包括9個(gè)梯度濃度，分別為0.8～1.2×10^-7mol/l、4.5～5.5×10^-8mol/l、0.8～1.2×10^-8mol/l、4.5～5.5×10^-9mol/l、0.8～1.2×10^-9mol/l、4.5～5.5×10^-10mol/l、0.8～1.2×10^-10mol/l、4.5～5.5×10^-11mol/l和0.8～1.2×10^-11mol/l；更優(yōu)選為0.9～1.1×10^-7mol/l、4.8～5.2×10^-8mol/l、0.9～1.1×10^-8mol/l、4.8～5.2×10^-9mol/l、0.9～1.1×10^-9mol/l、4.8～5.2×10^-10mol/l、0.9～1.1×10^-10mol/l、4.8～5.2×10^-11mol/l和0.9～1.1×10^-11mol/l；最優(yōu)選為1.0×10^-7mol/l、5.0×10^-8mol/l、1.0×10^-8mol/l、5.0×10^-9mol/l、1.0×10^-9mol/l、5.0×10^-10mol/l、1.0×10^-10mol/l、5.0×10^-11mol/l和1.0×10^-11mol/l。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種檢測(cè)溶菌酶的方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：

將20μl金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到金電極表面，37℃孵育3h，去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極；再將20μl溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

打磨的步驟為：將金電極在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化鋁溶液打磨，再用ddh2o洗滌金電極，氮?dú)獯蹈伞?/p>

2)用去離子水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極3次，氮?dú)獯蹈?，滴?0μl標(biāo)準(zhǔn)品溶液，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液電阻抗圖譜；

電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含鐵離子的溶液，檢測(cè)條件：頻率為0.1×10⁶hz，初始電壓為0.2v，振幅為4.0v。

3)根據(jù)所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的溶菌酶濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以所述差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝19.79711+1.74757x，

標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.99111，

線性范圍為1.0×10^-7～1.0×10^-11mol/l。

實(shí)施例2

選擇性實(shí)驗(yàn)

將20μl金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到打磨的金電極表面，37℃孵育3h，去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極；再將20μl溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

打磨的步驟為：將金電極在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化鋁溶液打磨，再用去離子水洗滌金電極，氮?dú)獯蹈伞?/p>

2)用去離子水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極3次，氮?dú)獯蹈?，分別滴涂20μl的去離子水、牛血清白蛋白溶液(濃度為1.0×10^-8mol/l)、溶菌酶溶液(濃度為1.0×10^-8mol/l)、免疫球蛋白g溶液(濃度為1.0×10^-8mol/l)、和凝血酶溶液(濃度為1.0×10^-8mol/l)，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到標(biāo)準(zhǔn)品溶液電阻抗圖譜；

電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)優(yōu)選使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含鐵離子的溶液，檢測(cè)條件：頻率為1.0×10⁶hz，初始電壓為0.24v，振幅為5.0v。

3)根據(jù)第二次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)得到的電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差為縱坐標(biāo)，以去離子水、牛血清白蛋白溶液、溶菌酶溶液、免疫球蛋白g溶液和凝血酶溶液為橫坐標(biāo)，得到選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果見圖2。

從圖2中可以得出，溶菌酶適體對(duì)溶菌酶具有高度的專一性，對(duì)凝血酶、牛血清白蛋白(bsa)和免疫球蛋白g(igg)響應(yīng)較低，進(jìn)而凝血酶、牛血清白蛋白(bsa)和免疫球蛋白g(igg)不會(huì)干擾溶菌酶的檢測(cè)，表明本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)溶菌酶具有選擇專一性。

實(shí)施例3

將20μl金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到打磨的金電極表面，37℃孵育3h，去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極；再將20μl溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

打磨的步驟為：將金電極在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化鋁溶液打磨，再用ddh2o洗滌金電極，氮?dú)獯蹈伞?/p>

2)用去離子水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極3次，氮?dú)獯蹈?，滴?0μl人尿樣品，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈桑M(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到人尿樣品電阻抗圖譜；

電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)優(yōu)選使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含鐵離子的溶液，檢測(cè)條件：頻率為1.0×10⁶hz，初始電壓為0.3v，振幅為6.0v。

3)根據(jù)所述人尿樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，差值為4000khom，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到溶菌酶的濃度，溶菌酶的濃度為1.0×10^-9mol/l。

實(shí)施例4

將20μl金屬有機(jī)骨架溶液滴涂到打磨的金電極表面，37℃孵育3h，去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈珊?，得到金屬有機(jī)骨架修飾金電極；再將20μl溶菌酶適體溶液滴涂到所述金屬有機(jī)骨架修飾金電極表面，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面3次，氮?dú)獯蹈?；以得到的溶酶體適體-金屬有機(jī)骨架修飾金電極為工作電極，進(jìn)行第一電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到基礎(chǔ)電阻抗圖譜；

打磨的步驟為：將金電極在麂皮上依次用0.5μm和0.05μm的氧化鋁溶液打磨，再用去離子水洗滌金電極，氮?dú)獯蹈伞?/p>

2)用去離子水洗滌所述步驟1)第一次電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)后的金電極3次，氮?dú)獯蹈?，滴?0μl人尿樣品，37℃孵育2h，再次去離子水洗滌金電極表面，氮?dú)獯蹈?，進(jìn)行第二電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)，得到人尿樣品電阻抗圖譜；

電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)優(yōu)選使用三電極系統(tǒng)，包括工作電極、對(duì)電極和參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，ag/agcl電極作為參比電極；檢測(cè)液采用含鐵離子的溶液，檢測(cè)條件：頻率為0.5×10⁶hz，初始電壓為0.25v，振幅為4.5v。

3)根據(jù)所述人尿樣品電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻減去所述基礎(chǔ)電阻抗圖譜中的電子轉(zhuǎn)移電阻后得到的電子轉(zhuǎn)移電阻差，差值為6500khom，與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到溶菌酶的濃度，溶菌酶的濃度為3.2×10^-7mol/l。

由以上實(shí)施例可知，采用本發(fā)明的檢測(cè)方法操作簡單，不需要標(biāo)記，且靈敏度較高，檢測(cè)限可達(dá)2.0×10^-11mol/l，線性范圍：1.0×10^-7～1.0×10^-11mol/l。金屬有機(jī)骨架的穩(wěn)定性高，可長期儲(chǔ)存。由于溶菌酶適體的專一性，凝血酶、牛血清白蛋白(bsa)和免疫球蛋白g(igg)干擾物響應(yīng)較低，不會(huì)干擾溶菌酶的檢測(cè)，得到的檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確度。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>臨沂大學(xué)

<120>一種檢測(cè)溶菌酶的方法

<130>2017年03月

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atcagggctaaagagtgcagagttacttag30