本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是風(fēng)濕免疫病學(xué)和骨科學(xué)領(lǐng)域，尤其是一種用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷的試劑盒。
背景技術(shù)：
：骨是一種特化的結(jié)締組織，作為肌肉的附著點(diǎn)可以支持運(yùn)動(dòng)、保護(hù)內(nèi)臟器官和骨髓，還具有代謝功能如儲(chǔ)存和供應(yīng)體內(nèi)的鈣。骨組織處于形成-吸收的動(dòng)態(tài)過(guò)程中，其中，骨吸收主要由破骨細(xì)胞介導(dǎo)。破骨細(xì)胞是一種由單核/巨噬前體細(xì)胞融合而成的具有骨吸收能力的終末期細(xì)胞，是唯一能夠吸收骨質(zhì)的細(xì)胞；破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞是血液系統(tǒng)中的單核細(xì)胞，在特定的信號(hào)作用下，經(jīng)歷一系列分化過(guò)程最終分化形成成熟的破骨細(xì)胞，釋放骨基質(zhì)降解酶，包括抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)、組織蛋白酶k以及基質(zhì)金屬蛋白酶9等骨基質(zhì)降解蛋白。當(dāng)人體破骨細(xì)胞分化及成熟異?；钴S時(shí)，會(huì)打破骨形成-吸收平衡，出現(xiàn)全身性或局部性骨侵蝕破壞。全身性骨侵蝕主要表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥，可出現(xiàn)疼痛、脊柱變形以及骨折等表現(xiàn)。局部的骨侵蝕破壞主要導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能，最終出現(xiàn)殘疾，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見(jiàn)的以進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞為特征的慢性炎癥性致殘性疾病，是導(dǎo)致我國(guó)女性肢體殘疾的首要病因。目前對(duì)于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的評(píng)估主要通過(guò)影像學(xué)檢查，或者血清學(xué)檢查骨破壞相關(guān)代謝產(chǎn)物，只能發(fā)現(xiàn)已經(jīng)存在的關(guān)節(jié)破壞，無(wú)法預(yù)測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)展。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)破壞的嚴(yán)重程度取決于破骨細(xì)胞的數(shù)量及功能。研究發(fā)現(xiàn)人外周血單核細(xì)胞在細(xì)胞因子rankl和m-csf的誘導(dǎo)下可分化為破骨細(xì)胞，而在相同的外界環(huán)境中類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞較正常人更容易被誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞，而不同類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者之間外周血單核細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的能力也存在差異。如果能找到可以評(píng)估人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(外周血單核細(xì)胞)分化成破骨細(xì)胞能力的方法，可以為臨床判斷患者是否存在骨吸收-形成失平衡提供指導(dǎo)，以及有助于預(yù)測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)破壞進(jìn)展，為臨床診療提供指導(dǎo)?，F(xiàn)有的評(píng)估人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(外周血單核細(xì)胞)分化成破骨細(xì)胞能力的方法為：抽取人外周血并稀釋?zhuān)粤馨图?xì)胞分離液密度梯度離心分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，貼壁純化后流式細(xì)胞術(shù)cd14、cd3雙色熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)單核細(xì)胞純度，在單核細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入破骨細(xì)胞誘導(dǎo)因子m-csf和rankl，第0、7、14、21天行trap染色，光鏡下觀察trap染色陽(yáng)性且細(xì)胞核≥3個(gè)的細(xì)胞為成熟破骨細(xì)胞。將培養(yǎng)體系中人外周血單核細(xì)胞在預(yù)置了骨片的96孔板中共培養(yǎng)，第21天取出骨片，梯度酒精脫水及1％甲苯胺藍(lán)染色，相差顯微鏡觀察骨吸收陷窩情況。通過(guò)比較成熟破骨細(xì)胞數(shù)量及骨陷窩面積評(píng)估破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的活性。上述方法的缺點(diǎn)包括操作復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)，需要特殊的場(chǎng)地和設(shè)備進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，容易出現(xiàn)細(xì)胞污染導(dǎo)致檢測(cè)失敗，結(jié)果評(píng)估時(shí)存在一定的主觀因素。上述缺點(diǎn)主要是因?yàn)橐M(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)，模擬體內(nèi)的環(huán)境加入相關(guān)的誘導(dǎo)因子把破骨細(xì)胞前體誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞，并且還要進(jìn)行染色鑒定和功能實(shí)驗(yàn)。由于誘導(dǎo)培養(yǎng)的時(shí)間周期比較長(zhǎng)，對(duì)操作人員的技術(shù)要求高，需要超凈臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱等專(zhuān)業(yè)的設(shè)備，因此難以推廣應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種操作方便、能快速準(zhǔn)確診斷受試者類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：一種類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒，所述試劑盒包含用于檢測(cè)血液中cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞中pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包含cd14抗體、同型對(duì)照抗體、pgc1β抗體和熒光二抗。所述抗體優(yōu)選是被標(biāo)記的抗體，例如生物素化的抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指特異性結(jié)合至特定抗原或與特定抗原免疫應(yīng)答的免疫球蛋白分子，并且包括抗體的多克隆、單克隆、遺傳工程化和以其它方式修飾的形式，包括但不限于嵌合抗體、人源化抗體、異綴合抗體(例如，二-、三-和四-特異性抗體、diabody、triabody和tetrabody)以及抗體的抗原結(jié)合片段包括例如fab'、f(ab')2、fab、fv、rigg和scfv片段；抗體可以包括嵌合的、靈長(zhǎng)類(lèi)化的、人源化的或人抗體；可與本發(fā)明相關(guān)使用的抗體可使用本領(lǐng)域已知的各種各樣的技術(shù)，包括使用動(dòng)物免疫、雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)或其組合來(lái)制備；可與本發(fā)明相關(guān)使用的抗體還可從供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)獲得。本發(fā)明所用的抗體可以是被標(biāo)記的抗體。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“被標(biāo)記”是指將抗體偶聯(lián)于可檢測(cè)物質(zhì)來(lái)促進(jìn)檢測(cè)?？蓹z測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用各種正電子發(fā)射型斷層攝影術(shù)的正電子發(fā)射金屬、以及非放射性順磁性金屬離子?？蓹z測(cè)物質(zhì)可直接地或通過(guò)中間體(例如本領(lǐng)域中已知的接頭)使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)間接地偶聯(lián)或綴合于抗體(或其片段)。酶標(biāo)記的實(shí)例包括螢光素酶(例如，螢火蟲(chóng)螢光素酶和細(xì)菌螢光素酶；美國(guó)專(zhuān)利no.4,737,456)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、蘋(píng)果酸脫氫酶、脲酶、過(guò)氧化物酶例如辣根過(guò)氧化物酶(hrpo)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙酰膽堿酯酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò)氧化物酶和類(lèi)似物。合適的輔基復(fù)合物的實(shí)例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和親和素/生物素；合適的熒光材料的實(shí)例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實(shí)例包括螢光素酶、螢光素和水母熒光素；以及合適的放射性材料的實(shí)例包括125i、131i、111in或99tc。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的抗體是生物素化的抗體。優(yōu)選地，所述血液是外周血。優(yōu)選地，所述cd14抗體為小鼠抗人cd14抗體，所述同型對(duì)照抗體是小鼠抗人同型對(duì)照抗體。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，所述小鼠抗人同型對(duì)照抗體是針對(duì)cd14igg的同型對(duì)照抗體。優(yōu)選地，所述熒光二抗為山羊抗兔fitc熒光二抗。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括肝素抗凝管和pbs溶液。作為本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了cd14和pgc1β的聯(lián)合使用在制備用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑盒中的用途。由此，可以通過(guò)判斷cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞的比例判斷受試者是否患有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。在本文中，正常水平是指健康受試者中生物標(biāo)志物的水平；健康受試者是指經(jīng)體檢，依據(jù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)排除患有類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的受試者；本申請(qǐng)的發(fā)明人經(jīng)多次試驗(yàn)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中含有pgc1β的cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞比例高于正常人外周血中含有pgc1β的單核細(xì)胞比例，當(dāng)受試者外周血中含有pgc1β的cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞比例為90％以上時(shí)，可以極高的準(zhǔn)確率確診受試者為類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者；根據(jù)該診斷結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)與醫(yī)學(xué)影像學(xué)、患者臨床特征表現(xiàn)等其它方法聯(lián)合檢查，從而進(jìn)一步確診類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。作為本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了外周血中cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞中pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞在制備用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的試劑盒中的用途。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：采用本發(fā)明的試劑盒和方法，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞分離，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色鑒定以及功能實(shí)驗(yàn)，只需要全血細(xì)胞標(biāo)記相關(guān)cd14和pgc1β的抗體后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算cd14陽(yáng)性的單核細(xì)胞中pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞比例即可，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，檢測(cè)周期短，數(shù)小時(shí)即可完成，且結(jié)果客觀可靠，具有可比性，有利于推廣應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明實(shí)施例中經(jīng)流式細(xì)胞儀后圈出的單核細(xì)胞群；圖2是本發(fā)明實(shí)施例中經(jīng)流式細(xì)胞儀后圈出的cd14陽(yáng)性細(xì)胞；圖3是本發(fā)明實(shí)施例中經(jīng)流式細(xì)胞儀后對(duì)照顯示的pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞群；圖4是本發(fā)明中將單核細(xì)胞體外培養(yǎng)，下調(diào)pgc1β之后獲得的圖片與統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖5a為采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及正常人的外周血中單核細(xì)胞pgc1β+陽(yáng)性率；圖5b為pgc1β表達(dá)升高促進(jìn)人單核細(xì)胞分化及成熟能力所得圖及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。具體實(shí)施方式為更好地說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本文中的試劑或細(xì)胞如無(wú)特別說(shuō)明，則屬于市場(chǎng)上可購(gòu)買(mǎi)的常規(guī)試劑或細(xì)胞。一、試劑及耗材試劑與耗材濃度或規(guī)格公司屬?lài)?guó)humancd14-apc100tests，1:5～20bectondeckinson美國(guó)平衡鹽溶液(pbs)100ml，280～315mosm/kginvitrogengibco美國(guó)fixationandpermeabilization5mlbectondeckinson美國(guó)gout-ribbitigg-fitc100μl，1:25～100康為世紀(jì)中國(guó)流式管12×75mm，5mlbectondeckinson美國(guó)anti-pgc1betaantibody0.093mg/mlabcam英國(guó)二、試劑盒組成及使用方法(1)《類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒》的組成：該試劑盒主要有肝素抗凝管4ml×2支、小鼠抗人cd14抗體2ml，小鼠抗人同型對(duì)照抗體2ml，兔抗人pgc1β抗體100μl，山羊抗兔fitc熒光二抗100μl，以及pbs100ml、試管4支組成。(2)《類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒》的使用方法：獲取類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血4ml于肝素抗凝管中，取1ml置于2個(gè)試管中，分別加入小鼠抗人cd14抗體+兔抗人pgc1β抗體和小鼠抗人cd14抗體+小鼠抗人同型對(duì)照抗體，孵育20min后，再加入山羊抗兔fitc熒光二抗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血單核細(xì)胞含有pgc1β抗體的比例。三、具體實(shí)驗(yàn)步驟(1)采集患者外周靜脈血2ml，各取100μl血樣分別加入3支空白流式管中，分別標(biāo)記空白對(duì)照管、陰性對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)管；(2)分別各取5μlhumancd14-apc抗體加入空白對(duì)照管、陰性對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中，混勻，室溫孵育20min；(3)每管加入pbs2ml，1000rpm×5min離心洗滌1次，棄上清液；(4)分別各取100μlfixation液加入空白對(duì)照管、陰性對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中于實(shí)驗(yàn)管中，混勻，室溫孵育20min；(5)每管加入pbs2ml，1000rpm×5min離心洗滌1次，棄上清液；(6)分別各取100μlpermeabilization液加入空白對(duì)照管、陰性對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管中于實(shí)驗(yàn)管中，于陰性對(duì)照管、實(shí)驗(yàn)管加入1μlanti-pgc1beta抗體，混勻，室溫孵育20min；(7)每管加入pbs2ml，1000rpm×5min離心洗滌1次，棄上清液；(8)于實(shí)驗(yàn)管加入2μlgoat-ribbitigg-fitc抗體，混勻，空白對(duì)照管、陰性對(duì)照管中不加抗體作為對(duì)照，室溫孵育20min；(9)加入pbs2ml，1000rpm×5min離心洗滌1次，棄上清液；(10)每管加入200μlpbs重懸，上流式細(xì)胞儀(美國(guó)bectondeckinsonfacsverse)分析，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血cd14陽(yáng)性細(xì)胞pgc1β表達(dá)與否，并計(jì)算其陽(yáng)性率；(11)先將空白對(duì)照管上流式細(xì)胞儀，根據(jù)細(xì)胞大小形態(tài)劃定單核細(xì)胞群(如圖1)；(12)將陰性對(duì)照管上流式細(xì)胞儀，根據(jù)空白對(duì)照管設(shè)門(mén)，將cd14陽(yáng)性細(xì)胞圈出(如圖2)；(13)將目標(biāo)實(shí)驗(yàn)管上流式細(xì)胞儀，根據(jù)陰性對(duì)照管設(shè)門(mén)，將cd14陽(yáng)性細(xì)胞中pgc1β陽(yáng)性細(xì)胞圈出，并統(tǒng)計(jì)其陽(yáng)性率(如圖3)。四、結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2和圖3所示，圖1所示為將空白對(duì)照上樣管通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析所得到的圖像，圖像顯示裂紅后的細(xì)胞大致分為3群，即淋巴細(xì)胞群、粒細(xì)胞群和單核細(xì)胞群，根據(jù)細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí)的fsc和ssc形態(tài)將單核細(xì)胞群圈出以進(jìn)行下一步分析；圖2所示為將陰性對(duì)照上樣管通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析所得到的圖像，圖像顯示根據(jù)空白對(duì)照管設(shè)門(mén)，將單核細(xì)胞群中標(biāo)記cd14-apc熒光的陽(yáng)性細(xì)胞在橫坐標(biāo)(代表apc熒光值)突前部分的細(xì)胞群圈出，即得到cd14陽(yáng)性細(xì)胞以進(jìn)行下一步分析；圖3所示為將目標(biāo)檢測(cè)上樣管通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析所得到的圖像，圖像顯示根據(jù)陰性對(duì)照管設(shè)門(mén)，將cd14陽(yáng)性細(xì)胞中標(biāo)記pgc1β-fitc熒光的陽(yáng)性細(xì)胞圈出，cd14陽(yáng)性細(xì)胞群中標(biāo)記pgc1β-fitc熒光的陽(yáng)性細(xì)胞在橫坐標(biāo)(代表fitc熒光值)突前部分的細(xì)胞群圈出并統(tǒng)計(jì)其陽(yáng)性率為95.11％。本發(fā)明研制的《類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒》是由收集人外周血的抗凝管、單核細(xì)胞的標(biāo)記物cd14以及反映單核細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞能力的標(biāo)記物pgc1β組成。該試劑盒具有快速、準(zhǔn)確評(píng)估破骨細(xì)胞分化及成熟的能力。下表對(duì)比示出了傳統(tǒng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)鑒定法和本發(fā)明的試劑盒用于診斷類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時(shí)的優(yōu)缺點(diǎn)：pgc1β是一種核轉(zhuǎn)錄因子，我們研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者pgc1β的表達(dá)升高，體外實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用單核細(xì)胞(raw264.7)進(jìn)行體外培養(yǎng)，并運(yùn)用慢病毒敲減pgc1β表達(dá)后，通過(guò)rankl+m-csf誘導(dǎo)培養(yǎng)12天后，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色檢測(cè)破骨細(xì)胞生成和甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)破骨吸收陷凹形成，證實(shí)下調(diào)pgc1β之后，單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞及骨破壞能力均受到抑制，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果判斷：我們運(yùn)用分離出的單核細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過(guò)rankl+m-csf誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色檢測(cè)破骨細(xì)胞生成，發(fā)現(xiàn)外周血中pgc1β+單核細(xì)胞比例高于60％，提示人破骨細(xì)胞分化及成熟能力異常，結(jié)果如圖5b所示；另外，將類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者及正常人的外周血中pgc1β+單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)正常人外周血中pgc1β+單核細(xì)胞比例均低于60％，類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血中pgc1β+單核細(xì)胞比例約為90％～100％，結(jié)果如圖5a所示。最后所應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12