本發(fā)明涉及毒性測試領(lǐng)域，具體涉及一種利用斑馬魚胚胎替代斑馬魚成魚進(jìn)行甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑急性毒性測定的方法。
背景技術(shù)：
斑馬魚(brachydaniorerio或daniorerio)原產(chǎn)于孟加拉國、印度等國。俗稱藍(lán)條魚、花條魚，是隸屬幅鰭亞綱(actinopterygii)、鯉科、短擔(dān)尼魚屬(danio)的一種硬骨熱帶觀賞魚，因體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍(lán)與銀色相間的條紋而得名。具有易飼養(yǎng)、產(chǎn)卵量大、性成熟周期短、個體小易操作等特點(diǎn)，同時斑馬魚基因與人類基因的相似度高，具有重要的科學(xué)研究意義。因此，斑馬魚已成為科學(xué)研究中常用的模式生物，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、毒理學(xué)、環(huán)境科學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域。
目前，已經(jīng)廣泛采用斑馬魚成魚進(jìn)行農(nóng)藥急性毒性安全性評價的研究，然而，采用斑馬魚胚胎進(jìn)行農(nóng)藥急性毒性安全性評價的研究較少，且不同農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的化合物毒性差別較大，能否用斑馬魚胚胎進(jìn)行替代斑馬魚成魚進(jìn)行毒性評價差異較大，因此，斑馬魚胚胎能否替代斑馬魚成魚進(jìn)行農(nóng)藥安全性評價仍然是一個函待解決的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用斑馬魚胚胎進(jìn)行甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑急性毒性測試的方法，以替代利用斑馬魚成魚進(jìn)行甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑急性毒性測試方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種農(nóng)藥的毒性測試方法，其特征在于，包含如下步驟：
（1）配制藥劑試驗(yàn)液：根據(jù)所需濃度，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液配制5-7個系列濃度的藥劑試驗(yàn)液，并置于24孔板中，每孔2ml試驗(yàn)液，每板20孔試驗(yàn)液，4孔稀釋水作為板內(nèi)對照，1板作為1個試驗(yàn)濃度組。
（2）斑馬魚胚胎的挑選：選取健康、活潑的成熟斑馬魚，于采卵前一天按雌∶雄為1∶2的比例放入配缸內(nèi)黑暗條件下馴養(yǎng)，次日上午8點(diǎn)半開燈，使其在光刺激的條件下，自然交配，1h時收集受精卵，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，在顯微鏡下挑選正常發(fā)育比率達(dá)70％以上的斑馬魚胚胎，收集和挑選過程需要快速、小心。
（3）染毒：用滴管吸取挑選好的胚胎，置于已經(jīng)準(zhǔn)備好的藥劑溶液中，每孔添加1枚斑馬魚胚胎，然后將整板染毒斑馬魚胚胎放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27-28℃，光照：黑暗=14h：10h。每24h更換一次試驗(yàn)藥液，更換時需預(yù)留少量舊藥液，避免胚胎暴露在空氣中，產(chǎn)生損傷。
（4）結(jié)果觀察與計(jì)算：觀察時間為24h、48h、72h和96h。觀察終點(diǎn)為卵凝結(jié)、缺乏體節(jié)構(gòu)造、尾芽缺失及無心跳，這些觀察將用于死亡的界定，以上的任何陽性結(jié)果都表示斑馬魚胚胎已經(jīng)死亡。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
1、斑馬魚胚胎為體外受精、體外發(fā)育、胚胎全透明，可以在顯微鏡下直接觀察斑馬魚胚胎發(fā)育的全過程，生長發(fā)育快，受精后24小時主要器官原基會基本形成，便于研究織器官的發(fā)育過程和功能；可以全程、完整觀察和研究其內(nèi)部所有器官和結(jié)構(gòu)的變化。
2、斑馬魚成魚為動物保護(hù)協(xié)會明確保護(hù)的動物，而斑馬魚胚胎則未在列，以胚胎代替成魚用于毒性試驗(yàn)還可以避免殺死動物或解剖動物，這符合環(huán)境毒理學(xué)為保護(hù)動物權(quán)利而尋求替代的毒性試驗(yàn)材料的發(fā)展方向。
3、斑馬魚胚胎較斑馬魚成魚更容易獲得，斑馬魚繁殖能力強(qiáng)，雌魚每次可產(chǎn)卵100-1000枚，可快速獲得大量胚胎。飼養(yǎng)比較方便且費(fèi)用低，所需的飼養(yǎng)場所不大，取材比較方便。
4、用斑馬魚胚胎替代傳統(tǒng)斑馬魚成魚進(jìn)行甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的急性毒性試驗(yàn)既可以減少實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量、試驗(yàn)場地和受試藥物的用量，降低研發(fā)成本，也有助于快速在細(xì)胞和分子水平闡明藥劑的毒性作用機(jī)理。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，本發(fā)明用以下具體實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明絕非限于這些例子。以下所述僅為本發(fā)明較好的實(shí)施例，僅僅用于解釋本發(fā)明，但不能因此理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換或改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)，因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
一、具體實(shí)施例
利用斑馬魚胚胎和斑馬魚成魚進(jìn)行吡唑醚菌酯急性毒性的測定，主要包括以下步驟：
1、吡唑醚菌酯對斑馬魚胚胎的急性毒性測試
（1）標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的配制：
（2）吡唑醚菌酯染毒液的配制：
用上述標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制不同濃度的吡唑醚菌酯染毒液，染毒液的濃度分別為：0.025mg/l、0.035mg/l、0.049mg/l、0.069mg/l和0.096mg/l。將配制好的染毒液置于24孔板中，每板20孔，每孔注入約2ml，剩余4孔注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為板內(nèi)對照，另取一板全部注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為空白對照組。
（3）斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備：
選取體色正常、健康、活潑的成熟斑馬魚，于采卵前一天按雌∶雄為1∶2的比例放入交配缸內(nèi)黑暗條件下馴養(yǎng)，次日上午8點(diǎn)半開燈，使其在光刺激的條件下，自然交配，1h時收集受精卵，用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水清洗兩次收集得到的受精卵，并去除雜質(zhì)和壞卵，在顯微鏡下挑選受精的斑馬魚胚胎，收集和挑選過程需要快速、小心。
（4）將準(zhǔn)備好的斑馬魚胚胎，由低濃度到高濃度依次添加至吡唑醚菌酯染毒液中，每孔1枚胚胎，1板作為一個濃度組。
（5）每24小時觀察一次結(jié)果，記錄胚胎的死亡數(shù)量，判斷指標(biāo)為卵凝結(jié)、缺乏體節(jié)構(gòu)造、尾芽缺失及無心跳，即觀察到上述現(xiàn)象則認(rèn)為該胚胎死亡，96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
2、吡唑醚菌酯對斑馬魚成魚的急性毒性測試
（1）用曝氣自來水配制不同濃度的吡唑醚菌酯染毒液，染毒液的濃度分別為：0.025mg/l、0.035mg/l、0.049mg/l、0.069mg/l和0.096mg/l。每個染毒液配制3l體積。
（2）選取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)7d以上，體色正常，健康活潑的成年斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)。每個濃度組10尾魚，試驗(yàn)期間不喂食。
（3）每24h觀察一次結(jié)果，記錄斑馬魚的死亡情況，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒輕觸魚尾無可見游動，并及時清除死魚。96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
3、吡唑醚菌酯對斑馬魚胚胎和成魚的毒性結(jié)果比較
利用dps13.0的tukey法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較，結(jié)果表明，吡唑醚菌酯對斑馬魚胚胎的96h-lc50和吡唑醚菌酯對斑馬魚成魚的96h-lc50，無論是在5%顯著水平還是在1%極顯著水平，差異均不顯著，表明對于吡唑醚菌酯的毒性測試，利用斑馬魚胚胎可以替代現(xiàn)行的斑馬魚成魚進(jìn)行測試。
二、對比實(shí)施例1
利用斑馬魚胚胎和斑馬魚成魚進(jìn)行苯醚甲環(huán)唑急性毒性的測定，主要包括以下步驟：
1、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的急性毒性測試
（1）標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的配制（同具體實(shí)施例）
（2）苯醚甲環(huán)唑染毒液的配制：
用上述標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制不同濃度的苯醚甲環(huán)唑染毒液，染毒液的濃度分別為：1.78mg/l、2.00mg/l、2.25mg/l、2.50mg/l和2.80mg/l。將配制好的染毒液置于24孔板中，每板20孔，每孔注入約2ml，剩余4孔注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為板內(nèi)對照，另取一板全部注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為空白對照組。
（3）斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備（同具體實(shí)施例）
（4）將準(zhǔn)備好的斑馬魚胚胎，由低濃度到高濃度依次添加至苯醚甲環(huán)唑染毒液中，每孔1枚胚胎，1板作為一個濃度組。
（5）每24小時觀察一次結(jié)果，記錄胚胎的死亡數(shù)量，判斷指標(biāo)為卵凝結(jié)、缺乏體節(jié)構(gòu)造、尾芽缺失及無心跳，即觀察到上述現(xiàn)象則認(rèn)為該胚胎死亡，96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
2、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚的急性毒性測試
（1）用曝氣自來水配制不同濃度的吡唑醚菌酯染毒液，染毒液的濃度分別為：1.05mg/l、1.20mg/l、1.40mg/l、1.60mg/l和1.85mg/l。每個染毒液配制3l體積。
（2）選取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)7d以上，體色正常，健康活潑的成年斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)。每個濃度組10尾魚，試驗(yàn)期間不喂食。
（3）每24h觀察一次結(jié)果，記錄斑馬魚的死亡情況，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒輕觸魚尾無可見游動，并及時清除死魚。96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
3、苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎和成魚的毒性結(jié)果比較
利用dps13.0的tukey法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較，結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎的96h-lc50和苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚成魚的96h-lc50，無論是在5%顯著水平還是在1%極顯著水平，均有顯著差異,表明對于苯醚甲環(huán)唑的毒性測試，利用斑馬魚胚胎無法替代現(xiàn)行的斑馬魚成魚進(jìn)行測試。
三、對比實(shí)施例2
利用斑馬魚胚胎和斑馬魚成魚進(jìn)行氰氟草酯急性毒性的測定，主要包括以下步驟：
1、氰氟草酯對斑馬魚胚胎的急性毒性測試
（1）標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的配制（同具體實(shí)施例）
（2）氰氟草酯染毒液的配制：
用上述標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制不同濃度的氰氟草酯染毒液，染毒液的濃度分別為：1.20mg/l、1.50mg/l、1.88mg/l、2.34mg/l和2.93mg/l。將配制好的染毒液置于24孔板中，每板20孔，每孔注入約2ml，剩余4孔注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為板內(nèi)對照，另取一板全部注入2ml標(biāo)準(zhǔn)稀釋液作為空白對照組。
（3）斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備（同具體實(shí)施例）
（4）將準(zhǔn)備好的斑馬魚胚胎，由低濃度到高濃度依次添加至氰氟草酯染毒液中，每孔1枚胚胎，1板作為一個濃度組。
（5）每24小時觀察一次結(jié)果，記錄胚胎的死亡數(shù)量，判斷指標(biāo)為卵凝結(jié)、缺乏體節(jié)構(gòu)造、尾芽缺失及無心跳，即觀察到上述現(xiàn)象則認(rèn)為該胚胎死亡，96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
2、氰氟草酯對斑馬魚成魚的急性毒性測試
（1）用曝氣自來水配制不同濃度的氰氟草酯染毒液，染毒液的濃度分別為：2.00mg/l、2.50mg/l、3.10mg/l、3.90mg/l和4.90mg/l。每個染毒液配制3l體積。
（2）選取實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴養(yǎng)7d以上，體色正常，健康活潑的成年斑馬魚進(jìn)行試驗(yàn)。每個濃度組10尾魚，試驗(yàn)期間不喂食。
（3）每24h觀察一次結(jié)果，記錄斑馬魚的死亡情況，死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為用玻璃棒輕觸魚尾無可見游動，并及時清除死魚。96h時結(jié)束試驗(yàn)。采用dps13.0計(jì)算出半數(shù)致死濃度lc50。
該試驗(yàn)相同操作重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果如下：
3、氰氟草酯對斑馬魚胚胎和成魚的毒性結(jié)果比較
利用dps13.0的tukey法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較，結(jié)果表明，氰氟草酯對斑馬魚胚胎的96h-lc50和氰氟草酯對斑馬魚成魚的96h-lc50，無論是在5%顯著水平還是在1%極顯著水平，均有顯著差異,表明對于氰氟草酯的毒性測試，利用斑馬魚胚胎無法替代現(xiàn)行的斑馬魚成魚進(jìn)行測試。