專利名稱：在診斷和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中使用的包含抗-cd6單克隆抗體的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是涉及包含識(shí)別白細(xì)胞分化抗原 CD6的人源化單克隆抗體的藥物組合物的獲得，和特別地涉及包含識(shí) 別白細(xì)胞分化抗原CD6的人源化單克隆抗體的治療制劑，該治療制劑 能夠在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中引起長(zhǎng)期的治療效果。
現(xiàn)有技術(shù)
對(duì)于自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，可利用各種 不同的具有治療目的的策略，其與已知的免疫病理學(xué)機(jī)制相關(guān)(Smolen， J. S.等人，(2003) Nature Reviews Drug Discovery 2: 473; Feldmann, M.等人，(2005) Nature 435: 612 )。然而，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，還 不存在可以在短時(shí)間段內(nèi)施行并誘導(dǎo)長(zhǎng)期臨床應(yīng)答的治療(Garber, K. (2005) Nature Biotechnology 23 (11): 1323 )。
目前，幾種生物療法可用于治療自身免疫疾病患者，特別是類風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎，雖然它們作為單一療法的臨床效果是非常有限的(01sen， N. J.等人，(2004) N Engl J Med 350: 2167 )。此外，生物試劑與曱 氨蝶呤的聯(lián)合療法可以在30-40%的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中引起臨床
緩解，但是，盡管進(jìn)行了治療，在大多數(shù)患者中，該疾病還是明顯地 持續(xù)，并且完全的緩解很少發(fā)生(Pincus, T.等人.(1999) Ann Intern Med 131:768; Olsen， N. J.等人，(2004) N Engl J Med 350:2167 )。 此外，關(guān)于此類治療方法，已描述了多種和嚴(yán)重的不利事件((TDell， J.R. (2004) N Engl J Med 350:2591 )。單克隆抗體(mAb )是用于治療自身免疫疾病的生物試劑(FeldmannM.等人，(2005) Nature 435: 612 )。特別地，具有耗竭自體反應(yīng)性細(xì)胞的能力的單克隆抗體具有醫(yī)學(xué)重要性，這是因?yàn)?，考慮到在患有自身免疫疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中產(chǎn)生治療效果需要淋巴細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間的耗竭(Edwards， J. C.等人，(2004) N Engl J Med 350: 2572;Stohl， W.等人，(2006) Clinical Immunology 121: 1; Browning, J丄(2006) Nature Reviews Drug Discovery 5:564)。這種由淋巴細(xì)胞耗竭所誘導(dǎo)的免疫抑制是自身免疫疾病的各種治療備選方案的治療效果的共同機(jī)制(Kahan, B. D. (2003) Nature Reviews Immunology3: 831 )。然而，治療效果是有限的，并且具有明顯的不利事件(Edwards,J.C.等人，(2004) N Engl J Med 350: 2572; Hale， D. A. (2004) CurrentOpinion Immunology 16: 565; Goldblatt， F.等人，(2005) Clinicaland Experimental Immunology 140:195)。
因此，更好地了解在自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的生理病理學(xué)中所牽涉的分子和機(jī)制可能導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的治療靶標(biāo)，其中，治療目的從消除自體反應(yīng)性細(xì)胞轉(zhuǎn)向在患者中誘導(dǎo)或重建耐受和免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制 (Taylor, P. C.等人，(2004) Current OpinionPharmacology 4: 368; Feldmann， M.等人，(2005) Nature 435: 612 )。
白細(xì)胞分化抗原CD6是一種還很少研究和表征的分子。CD6是在正常個(gè)體外周血中主要在T淋巴細(xì)胞中和在少數(shù)B淋巴細(xì)胞亞群中表
達(dá)的表面糖蛋白。但是，在這些細(xì)胞中的起源和功能表征是非常有限的?；旧希J(rèn)為CD6在這些細(xì)胞中是具有共刺激功能的受體，盡管才幾制還不了解(Aruffo， A.等人.(1997) Immunol Today 18 (10): 498;Patel, D. D. (2000) J Biol Regul Homeost Agents 2000 14 (3) :234 )。
已將其在成熟胸腺細(xì)胞中的表達(dá)與在該淋巴器官中淋巴細(xì)胞的成熟過程相關(guān)聯(lián)(Singer, N. G.等人.(2002) Int Immunol. 14 (6):585 )。CD6模型具有治療學(xué)上的意義，并且已要求保護(hù)，抗-CDG單克隆抗體的作用機(jī)制是基于它們抑制和調(diào)節(jié)CD6與稱為ALCAM (激活的淋巴細(xì)胞粘附分子(Activated Leukocyte Adhesion Molecule))的其配體結(jié)合的能力(美國專利6372215 )。因此，考慮此類單克隆抗體可用于治療自身免疫疾病，但是基于這樣的權(quán)利要求的在患者中的治療證據(jù)實(shí)質(zhì)上并沒有得到證實(shí)。
CD6分子被鼠類單克隆抗體ior-tl所識(shí)別。該抗-CD6鼠類單克隆抗體的治療制劑在銀屑病中具有治療效果(Montero， E.等人，(1999)Autoimmunity 29 (2): 155 )。后來，基于基因工程方法(專利號(hào)0699755E. P. Bul.)，獲得了被命名為Tlh的該抗人CD6鼠類單克隆抗體的人源化形式(EP 0 807 125 A2)。
本發(fā)明的新穎性在于，提供了包含抗-CD6單克隆抗體的治療制劑，以將其應(yīng)用于患有自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。
令人驚奇地，在患有自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(處于該疾病長(zhǎng)期發(fā)展和活躍期)的患者中，在6周內(nèi)作為單一療法施用人源化單克隆抗體Tlh，產(chǎn)生了長(zhǎng)期的治療效果，其在該治療的實(shí)施結(jié)束之后還持續(xù)數(shù)月，而不具有明顯的不利事件。該效果與CD6+細(xì)胞的耗竭不相關(guān)，這是因?yàn)?，恢?fù)該細(xì)胞亞群的正常值并不妨礙該疾病的持續(xù)的臨床改善。人源化單克隆抗體Tlh不抑制CD6與其配體ALCAM
的結(jié)合，這是先前對(duì)于在該治療模型中的療法所聲稱的效應(yīng)，這表明其可能與其他備選的機(jī)制相關(guān)聯(lián)。此外，Tlh治療可以使自身免疫細(xì)
胞對(duì)于抗炎劑、類固醇或化學(xué)治療劑(例如曱氨蝶呤)的效應(yīng)敏感，這使得能夠?qū)⑷嗽椿瘑慰寺】贵wTlh與其他藥物或其他生物療法聯(lián)合使用。
發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及識(shí)別人抗原CD6的單克隆抗體的治療制劑，其在治療自身免疫疾病患者中有效。更具體地，本發(fā)明包括包含識(shí)別人白細(xì)胞分化抗原CD6的人源化單克隆抗體Tlh的藥物組合物的使用，以及其用于診斷和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的用途。
本發(fā)明的目標(biāo)是包含人源化單克隆抗體Tlh的治療制劑，所述人源化單克隆抗體Tlh通過識(shí)別CD6分子而在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中引起長(zhǎng)期的治療效果。
術(shù)語"人源化單克隆抗體，，，是指如專利號(hào)0699755 (E. P. Bui)中所描述的通過基因工程方法而獲得的單克隆抗體。
1. -包含人源化單克隆抗體Tlh的藥物組合物的獲得本發(fā)明的藥物組合物包含識(shí)別人白細(xì)胞分化抗原CD6的人源化單
克隆抗體Tlh?？谷薈D6的人源化單克隆抗體Tlh從具有保藏號(hào)ECACC96112640的分泌型雜交瘤IOR-TIA獲得，如在(EP 0 807 125 A2 )中所描述的。此外，該組合物還包含經(jīng)緩沖的生理溶液作為合適的賦形劑，類似于用于配制用于靜脈內(nèi)使用的單克隆抗體的其他那些，如在EP 0807125中所描述的。
本發(fā)明的組合物以0.05-1 mg/Kg體重的劑量以注射劑的形式進(jìn)行施用。
2. -包含人源化單克隆抗體Tlh的藥物組合物的治療效果的表征抵抗傳統(tǒng)療法(例如抗炎藥物、類固醇或化學(xué)治療劑(例如甲氨
蝶呤))的、處于該疾病活躍期的、根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)診斷出的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，對(duì)于作為單一療法或者與抗炎藥物、類固醇、化學(xué)治療劑(例如甲氨蝶呤)或者特異于T和B淋巴細(xì)胞表面分子(例如CD20)或細(xì)胞因子(例如腫瘤壞死因子a )的單克隆抗體相組合的人源化單克隆抗體Tlh的施用是易感的。人源化單克隆抗體Tlh可以作為腸胃外溶液，在依照體重的劑量的范圍內(nèi)，以可變的頻率進(jìn)行施用，所述頻率包括每日、每周或更長(zhǎng)時(shí)間段的施用。在治療前、治療期間和治療結(jié)束后，才艮據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)，通過該疾病的臨床活動(dòng)性的減少來評(píng)價(jià)治療效果。
3. -包含人源化單克隆抗體Tlh的藥物組合物對(duì)于外周血單核細(xì)胞的效應(yīng)的表征將類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞與綴合至生物素或焚光
物質(zhì)(例如，F(xiàn)ITC、 PE或PE-Cy5)的抗-CD3或抗-CD6單克隆抗體一起進(jìn)行溫育。用鏈霉抗生物素蛋白-PE-Cy5綴合物來檢測(cè)生物素化的抗體的結(jié)合。在流式細(xì)胞儀FACScan上獲得至少10000個(gè)活細(xì)胞。通過碘化丙錠染色來將死細(xì)胞排除。
4.-包含人源化單克隆抗體Tlh的藥物組合物抑制CD6與其配體ALCAM結(jié)合的能力的表征
在4。C下，將用人CD6分子轉(zhuǎn)染的人上皮細(xì)胞系HEK-293與飽和濃度的抗人CD6單克隆抗體Tlh或同種型對(duì)照(抗人CD3抗體) 一起溫育30分鐘。然后，洗滌細(xì)胞，并與0. 5 pg/mL的融合蛋白rhALCAM-Fc(ALCAM是人CD6的配體之一)在4。C下溫育30分鐘。然后，在4°C下用綴合至FITC的抗人IgG抗體將樣品染色30分鐘。在流式細(xì)胞儀FACScan上獲得10000個(gè)活細(xì)胞。通過碘化丙錠染色來將死細(xì)胞排除。
實(shí)施例
抗人CD6的人源化單克隆抗體Tlh獲自具有保藏號(hào)ECACC96112640的雜交瘤IOR-TIA，如EP 0 807 125 A2中所描述的。
實(shí)施例1:人源化單克隆抗體Tlh在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中引起長(zhǎng)期的治療效果
在13位類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中評(píng)價(jià)了人源化單克隆抗體Tlh的治療效果(

圖1 )。患者在6周期間接受在0. 2、 0. 4、 0. 6和0. 8 mg/Kg體重的劑量范圍內(nèi)的周劑量的人源化單克隆抗體Tlh。在治療前、治療期間和治療結(jié)束后，根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)由考慮患病關(guān)節(jié)的數(shù)目而通過該疾病的臨床活動(dòng)性的減少來評(píng)價(jià)治療效果。每條曲線代表了 ，對(duì)于每一根據(jù)所施用的劑量而劃分的患者組，臨床癥候或癥狀的改善
7的百分比平均值。
實(shí)施例2:用人源化單克隆抗體Tlh進(jìn)行治療暫時(shí)性地減少了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞的數(shù)目
分析了用人源化單克隆抗體Tlh治療的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞。測(cè)定了作為T淋巴細(xì)胞區(qū)別性標(biāo)志物的CD3分子，以及CD6分子的表達(dá)。用人源化單克隆抗體Tlh進(jìn)行的治療引起CD3+和主要地CD6+淋巴細(xì)胞的暫時(shí)性減少。但是，恢復(fù)正常值并不影響該疾病的持續(xù)的臨床改善(圖2)。通過使用FACScan來分析樣品的流式細(xì)胞術(shù)來進(jìn)行該研究。每條曲線代，表了在不同時(shí)間點(diǎn)處個(gè)體患者的值。
實(shí)施例3:人源化單克隆抗體Tlh不抑制CD6與其配體ALCAM的結(jié)合
評(píng)價(jià)了人源化單克隆抗體Tlh抑制ALCAM與用人CD6分子轉(zhuǎn)染的人上皮細(xì)胞系HEK-293結(jié)合的能力(圖3) 。 (A)紅色直方圖'.結(jié)合至人Fc片段的人ALCAM重組蛋白(rhALCAM-Fc )與用抗-CD6抗體(Tlh )或抗-CD3抗體(對(duì)照)預(yù)溫育的細(xì)胞的結(jié)合；黑色直方圖rhALCAM-Fc與未處理的細(xì)胞的結(jié)合；和灰色直方圖用綴合至FITC的抗人IgG抗體標(biāo)記的細(xì)胞。該圖中顯示了平均熒光強(qiáng)度值。(B)點(diǎn)圖(dot plot)顯示了 rhALCAM-Fc和抗-CD6或抗-CD3抗體的雙染色。
附圖簡(jiǎn)述
圖1 -
分比減少禾評(píng)優(yōu)體Tlh在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中的治療效果。
圖2 -在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的外周血單核細(xì)胞中CD^和CD6+淋巴細(xì) 胞數(shù)目的定量。
圖3 _
人源化單克隆抗體Tlh不抑制CD6與其配體ALCAM結(jié)合的證明。
權(quán)利要求
1.用于診斷和治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含作為活性成分的識(shí)別人白細(xì)胞分化抗原CD6的單克隆抗體，以及合適的賦形劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于，所述抗-CD6單 克隆抗體是由具有保藏號(hào)ECACC 96112640的雜交瘤IOR-TIA產(chǎn)生的人 源化抗體Tlh。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物 包含單獨(dú)的或與選自下列的試劑之一相組合的人源化抗體Tlh:-化學(xué)治療劑，-針對(duì)T和B淋巴細(xì)胞表面分子的特異性單克隆抗體， -細(xì)胞因子。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述化學(xué)治療劑 為甲氨蝶呤。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述識(shí)別T和B 淋巴細(xì)胞表面分子的單克隆抗體為抗-CD20抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其特征在于，所述細(xì)胞因子為 腫瘤壞死因子ot。
7. 使用權(quán)利要求1的藥物組合物的方法，其特征在于，所述組合 物以0.05-1 mg/Kg體重的劑量以注射劑的形式進(jìn)行施用。
8. 抗-CD6單克隆抗體在制備用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥劑中 的用途。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的用途，其中所述抗-CD6單克隆抗體是由具 有保藏號(hào)ECACC 96112640的雜交瘤I0R-T1A產(chǎn)生的人源化抗體Tlh。
10. 抗-CD6單克隆抗體在制備用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥劑 中的用途。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述抗-CD6單克隆抗體是由 具有保藏號(hào)ECACC 96112640的雜交瘤IOR-TIA產(chǎn)生的人源化抗體Tlh。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及包含識(shí)別白細(xì)胞分化抗原CD6的人源化單克隆抗體的藥物組合物的獲得。根據(jù)本公開內(nèi)容，本發(fā)明的目標(biāo)為提供包含抗-CD6的人源化單克隆抗體的藥物組合物以用于診斷和治療自身免疫疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101657215SQ200780050236
公開日2010年2月24日 申請(qǐng)日期2007年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者A·R·卡薩克帕拉達(dá), J·E·蒙特羅卡西米洛, R·佩雷斯羅德里格斯, R·阿隆索拉梅爾茲, Z·瑪佐拉赫爾拉 申請(qǐng)人:分子免疫中心